Abstract
Sikt
Deregulering av FOXM1 er dokumentert i ulike kreft. Målet med denne studien var å vurdere rollen til FOXM1 i eggstokkreft tumorigenesis og paclitaxel motstand.
Experimental Design
Uttrykk for FOXM1 ble undersøkt i 119 kliniske prøver ved immunhistokjemi og korrelert med clinicopathological parametere . Effekter av FOXM1 knockdown på eggstokkreft celle migrasjon, invasjon og mitotisk katastrofe ble også studert. qPCR og chip-qPCR ble brukt til å etablere KIF2C som en roman FOXM1 Målgenet innblandet i chemoresistance.
Resultater
Høy atom FOXM1 uttrykk i eggstokkreft kreftpasientprøvene ble signifikant assosiert med avanserte stadier (
P
= 0,035), kortere samlet (
P
= 0,019) og sykdomsfri (
P
= 0,014) overlevelse. Multivariat analyse bekreftet FOXM1 uttrykk som en selvstendig prognostisk faktor for eggstokkreft. FOXM1 knockdown betydelig hemmet migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler og økt paclitaxel-mediert celledød og mitotisk katastrofe i en p53-uavhengig måte. Bioinformatikk analyse foreslått en rekke potensielle transkripsjons mål for FOXM1. En av de potensielle mål, KIF2C, oppviste lignende uttrykk mønster til FOXM1 i kjemosensitiv og kjemoresistent cellene i respons til paclitaxel-behandling. FOXM1 kunne påvises ved arrangøren av KIF2C og FOXM1 stanse betydelig nedregulert KIF2C.
Konklusjon
Våre funn tyder på at FOXM1 er assosiert med dårlig pasient utfall og bidrar til paclitaxel motstand ved å blokkere mitotisk katastrofe. KIF2C er identifisert som en roman FOXM1 transkripsjonen mål som kan være innblandet i oppkjøpet av chemoresistance. FOXM1 bør undersøkes nærmere som en potensiell prognostisk markør og terapeutisk mål for eggstokkreft
Citation. Zhao F, Siu MKY, Jiang L, Tam KF, Ngan HYS, Le XF, et al. (2014) Overuttrykte gaffelhode Box Protein M1 (FOXM1) i Eggstokkreft korrelerer med dårlig pasient overlevelse og bidrar til Paclitaxel Resistance. PLoS ONE 9 (11): e113478. doi: 10,1371 /journal.pone.0113478
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 24 februar 2014; Godkjent: 28 oktober 2014; Publisert: 20.11.2014
Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Fung Zhao er en mottaker av en HKU-ICL felles student. Ana Gomes er en postdoktor støttes av Cancer Research UK. Laura Bella er støttet av en studieplass fra Breast Cancer Campaign. Pasarat Khongkow støttes av stipend fra Royal Thai Goverment. Eric Lam arbeid er støttet med tilskudd fra Breast Cancer Campaign og Cancer Research UK. Annie Cheung arbeid er støttet av midler fra Stipend Rådet HKSAR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft over hele verden som de fleste pasienter, når diagnosen, blir presentert med avansert sykdom [1]. Selv om bedring i median overlevelse har blitt observert de siste tiårene, tilbakefall og dødelighet holder seg høy skyldes delvis oppkjøpet av chemoresistance [2]. En kombinasjon av paclitaxel og carboplatin har mye blitt brukt som førstelinje kjemoterapi for ovarian kreftpasienter. Paclitaxel virker spesifikt i løpet av G2-M-fasen av cellesyklusen ved å indusere unormal spindler og forstyrrelse av mikrotubul-dynamikk, for derved å blokkere cellesyklusprogresjon. Til tross for sin opprinnelige effektivitet som et cancer terapeutisk middel, i de fleste tilfeller kan pasienter som til slutt blir ufølsom overfor paclitaxel-kjemoterapi og tilbakefall. Det er derfor viktig å identifisere nye prognostiske markører og terapeutiske mål, spesielt gener relatert til metastasering og resistens.
gaffelhodeboks (FOX) proteiner tilhører en superfamily av evolusjonært konserverte transkripsjonsfaktorer ansvarlig for rom-tid-bot -tuning av et repertoar av transkripsjonelle programmer som er nødvendig for normal utvikling og homeostase [3]. Blant annet, gaffelhodeboks protein M1 (FOXM1) deltar i en rekke biologiske prosesser, inkludert celle proliferasjon, cellesyklusprogresjon, celledifferensiering, DNA-skade reparasjon, vev homeostase, angiogenese og apoptose [4], [5]. Det er derfor ikke overraskende at deregulering av FOXM1 kan resultere i alvorlige patologiske tilstander, inkludert kreft. Faktisk har FOXM1 overekspresjon er dokumentert i kreft i lunge, bryst, lever, prostata og tykktarm, etc. som tyder på at FOXM1 har en nøkkelrolle i tumorigenesis [3], [6]. Nylig har det blitt vist at deregulert FOXM1 uttrykket kan gi resistens mot kjemoterapeutiske medikamenter, såsom cisplatin og epirubicin, ved å beskytte celler mot DNA-skade indusert celledød, og forstyrre den mitotiske kontrollpunkt [7] -. [9]
i denne studien undersøkte vi uttrykket mønster av FOXM1 i eggstokkreft. Effektene av FOXM1 uttrykk for kreftcellemigrering, invasjon og paclitaxel motstand ble også undersøkt i et forsøk på å evaluere FOXM1 som en potensiell molekyl prognostisk markør og terapeutisk mål for kreft i eggstokkene. Videre analyser ble utført for å identifisere KIF2C som en roman FOXM1 transkripsjonen mål som kan være innblandet i oppkjøpet av chemoresistance.
Materialer og metoder
Kliniske prøver og cellelinjer
Arkiv parafin innebygde vevsblokker fra år 1987 til 2004 ble hentet fra Institutt for patologi, Queen Mary Hospital, University of Hong Kong. Prøvene inkludert 2 godartede cystadenomas, 2 borderline tumorer, 94 primær karsinomer og 21 metastaser av kreft (på ligament, gut, lymfeknute og livmor serosa). Alle pasienter med karsinom gikk kirurgi etterfulgt av standard førstelinje kjemoterapi inkludert platina /paclitaxel. Den oppfølgingsperioden varierte fra 5 til 209 måneder (median 63 måneder). Bruken av disse prøvene ble godkjent av Institutional Ethical Review Board. Hver pasientprøve ble vurdert av patologer og sørget for å inneholde mer enn 70% tumorceller.
eggstokkreft cellelinjer Skov-3 og OVCAR-3 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SKOV3-TR celler var en generøs gave fra Dr Lawrence XF Le (Division of Cancer Medicine, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA) [10]. PEO1 og PEO1-TaxR er nylig utviklet cellelinjer og har blitt godkjent ved Cancer Research UK. Bruken av PEO1 og PEO1-TaxR istedenfor SKOV-3 og SKOV3-TR for noen eksperimenter gir ekstra midler for å sikre at resistente mekanismer som er identifisert i SKOV-3 og SKOV3-TR er felles for alle paclitaxel-resistente eggstokkreft celler og ikke unik for SKOV-3 og SKOV3-TR. Viktigere, både PEO1 og PEO1-TaxR holdes lavere passasjer for å unngå fonner i motstand og oppkjøpet av sekundære mutasjoner [10] [11]. OVCAR-3 ble dyrket i Medium 199 01:01 (Invitrogen, CA, USA): MCDB105 (Sigma, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 enheter /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen). SKOV3, SKOV3-TR, PEO1 og PEO1-TaxR ble dyrket i RPMI 1640 (Sigma) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 enheter /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen). PEO1-TaxR ble supplert med 50 nM paclitaxel. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i fuktet inkubator med 5% CO
2. Cellekulturmediet ble skiftet hver 3 til 5 dager, avhengig av celletetthet. For rutinemessig passasje, når cellene nådde 85% til 90% konfluens, ble de delt i et forhold på 1:04.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemi ble utført som beskrevet tidligere [12], [13 ]. Kort fortalt ble formalinfiksert parafinsnitt inkubert med anti-FOXM1 antistoff (NBP1-30961, 01:40, Novus Biologicals, CO, USA) ved romtemperatur over natten og farget hjelp EnVision + Dual Link System (K4061, Dako, CA, USA) . Antigen gjenfinning ble utført ved anvendelse av EDTA-buffer, pH 8,0, i en trykkoker i 30 minutter. Alle delene ble vurdert av to uavhengige etterforskere. Immunreaktiviteten til antistoffet FOXM1, intensiteten av fargede celler og deres prosentandeler ble målt i intensitet og prosentpoengsummer respektivt. Den prosentvise stillingen varierte fra 0 til 4: 0 = mindre enn 5% av positivt fargede celler, 1 = 5-25% av positivt fargede celler, 2 = 26-60% av positivt fargede celler, 3 = 61-85% av positivt fargede celler, og 4 = 86-100% av positivt fargede celler. Immunhistokjemisk (IHC) score (0-16) ble beregnet ved å multiplisere poengsummen intensitet (0-4) og den prosentvise score (0-4), med en maksimal poengsum på 16 [12], [13]. FOXM1 nukleære og cytoplasmiske immunoreaktiviteter ble scoret separat.
Western blot
Cellene ble høstet med lyseringsbuffer [0,125 m Tris, pH 6,8 ved 22 ° C inneholdende 1% NP-40 (v /v ), 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 2 mM N-etylmaleimid, 2 mM phenylmethanesulphonyl fluorid (PMSF), 1 mM natriumortovanadat og 0,1 um natrium okadate] og sentrifugert ved 4 ° C i 10 min. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved detergent-kompatibel (DC) proteinanalyse (Bio-Rad). Tyve mikrogram protein ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), overført til polyvinylidendifluorid-membran og hybridisert med de følgende anti-organer: anti-FOXM1 (sc-502, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) , anti-Caspase 9 (9502, Cell Signaling Technology, MA, USA), anti-KIF2C (WH0011004M1, Sigma), anti-Caspase 7 (9492, Cell Signaling) og anti-β-tubulin (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology ).
kvantitativ real-time PCR
kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble utført ved hjelp av Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) og analysert ved ABI7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems ). L19 (RPL19), en ikke-regulert ribosomale husholdningsgenet ble anvendt som en intern kontroll for normalisering ved hjelp av delta-delta Ct-metoden. Følgende primere ble brukt:
KIF2C Forward 5 «til 3»: CATGATTGCCACGATCTCAC
KIF2C Reverse 5 «til 3»: CGTTAGAGCAGGCTTCCATC
L19 Forward 5 «til 3»: GCGGAAGGGTACAGCCAAT
L19 Reverse 5 «til 3»: GCAGCCGGCGCAAA
Transient knockdown av FOXM1
ON-TARGET Plus Menneskelig FOXM1 siRNA og Non-targeting kontroll sirnas (Thermo Scientific, CO , USA) var ansatt på midlertidig stanse av FOXM1 hjelp Oligofectamine transfeksjon reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
In vitro
migrasjon og invasjon analyser
in vitro
migrering og invasjon analyser ble utført som beskrevet tidligere [12], [13]. Kort fortalt ble 1,25 × 10
5 celler belagt på øvre kammeret av en Transwell kammer (Corning Life Sciences, MA, USA). For migrerings analysene ble celler tillatt å migrere gjennom en gelatin-belagte membran. For invasjon analyser, ble cellene tillatt å invadere gjennom en matrigel belagt membran. Etter 24 timer ble cellene på oversiden av membranen fjernet og migrerte eller invaderte celler ble fiksert, farget og tellet.
TdT-mediert dUTP nick ende merking (TUNEL) analyse og evaluering av mitotisk indeks katastrofe
etter FOXM1 knockdown i 48 timer og paclitaxel behandling (50 nM) i 24 timer, ble TUNEL analyse utført ved hjelp av In Situ Død Detection Kit (Roche Biochemical, IN, USA) etter produsentens protokoll [14]. Apoptotiske og mitotiske katastrofetall ble vurdert under fluorescens mikroskopi. Mitotiske katastrofetall ble observert av morfologiske forandringer i cellekjerner (DAPI flekker) [10]. Mer enn 1000 levedyktige celler i hvert eksperiment ble undersøkt og den mitotiske indeksen katastrofen ble evaluert som prosenter av celler tellet. Hver analysen ble kjørt i tre eksemplarer.
Cell syklus analyse
Cellesyklus analyse ble utført av propidiumjodidfarging som beskrevet tidligere [15]. Kort sagt ble både adherente og suspensjonsceller høstet og farget med propidiumjodid (1 mg /ml) i nærvær av DNase-fri RNase for flowcytometrisk analyse. Cellesyklus profilen ble analysert ved hjelp av celle Diva programvare (Becton Dickinson UK Ltd.).
Chromatin Immunpresipitasjon
40 ul Dynabeads Protein A (10002D, Invitrogen) ble vasket med 200 ul TSE i buffer tre ganger og fortynnet med 40 pl av TSE i buffer. Anti-FOXM1 (sc502, Santa Cruz Biotechnology) (4 ug) og kanin-IgG-kontroll (X0903, DAKO) (4 ug) ble først hver for seg fortynnet i buffer D, blandet med fortynnet Dynabeads og deretter roteres O /N ved 4 ° C. PEO1 og PEO1-TaxR-celler ved 90% konfluens i 100 mm kulturskål ble tverrbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter, skylt med iskald PBS og inkubert med 2,5 M glycin i 5 min. Cellene ble deretter høstet med 2 ml skraping buffer. Etter en sekvensiell vask med PBS buffer I og buffer II, ble cellepelleten resuspendert i 300 ul lyseringsbuffer og underkastet ultralydbehandling i henhold optimalisert tilstand (20 min med 30 s på og 30 sekunder av). Supernatanten ble deretter fortynnet i 300 ul buffer D hvor 100 ul ble tatt som inngangskontroll. 200 ul cellelysat ble blandet med fremstilte Dynabeads og roteres O /N ved 4 ° C. Etter en sekvensiell vasking med TSE I, TSE II Buffer III og TE-buffer, ble 100 pl elueringsbuffer tilsatt til Dynabeads, og blandingen ble rotert ved RT i 1 time. Eluerte prøve ble oppsamlet i eppendorf og Dynabeads ble re-eluert med ytterligere 100 ul elueringsbuffer. 200 ul av prøven ble de-tverrbundet ved inkubering ved 65 ° C O /N. PCR Purification Kit (Qiagen) ble deretter anvendt for å rense DNA. Kvantitativ real-time PCR ble utført med følgende primere: KIF2C (Forward 5 «til 3»: GCCAAGTCTCCAACTTGCTC; Omvendt 5 «til 3»: TTCCCAACCATCTTCCTACG)
ChIP-qPCR data ble normalisert til IgG kontroll og plottet. som prosent inngang. Sammensetning av buffere ble oppført i tabell 1.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført av Statistisk Package for Social Science versjon 19.0 for Windows (IBM). Sammenligning mellom to grupper av ikke-parametriske data ble utført ved Mann-Whitney
U
-test. Sannsynligheten for å overleve ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier tilnærming. Multivariat analyse av prognostiske faktorer ble utført ved hjelp av Cox regresjonsmodellen.
P
-verdier på 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
FOXM1 overekspresjon korrelerer med dårlig overlevelse
uttrykk for kjernefysisk FOXM1. i eggstokkene godartede og borderline tumorer samt invasive krefttyper ble evaluert av immunhistokjemi. Eggstokkreft vises sterkere kjernefysisk FOXM1 flekker enn godartede og borderline tumorer. Men det var ingen signifikant forskjell i FOXM1 uttrykk mellom primær karsinomer og deres metastaser (
P
= 0,6). Høyere atom FOXM1 uttrykk var signifikant assosiert med avanserte stadier av eggstokkreft (
P
= 0,035) (Fig. 1a). Selv om det ikke nådde statistisk signifikans, vises FOXM1 overekspresjon en trend knyttet til serøs histologisk type (
P
= 0,142), høy klasse kreft (dårlig differensiering) (
P
= 0,235) og chemoresistance (
P
= 0,282) (tabell 2). For å studere sammenslutning av FOXM1 uttrykk med pasientenes utfall, ble pasientene kategorisert i to grupper som bruker cutoff punktet IHC poengsum 0. Som vist i Kaplan-Meier total overlevelse tomten (Fig. 1B), pasienter med negativ FOXM1 flekker hadde en signifikant lengre total (
P
= 0,019) og sykdomsfri overlevelse (
P
= 0,014) enn de med positiv FOXM1 uttrykk. Multivariat progresjon analyse viste høy uttrykk for FOXM1, avansert kreft stadier og dårlig histologisk differensiering (høy grad) ble funnet å være uavhengige prognostiske faktorer for kort total overlevelse (95% KI, 0,906 til 5,754, HR 2,283,
P
= 0,08; 95% CI, 0,953 til 5,963, HR 2,384,
P
= 0,06; 95% CI, 2,137 til 40,638, HR 9,318,
P
= 0,003, henholdsvis) og sykdoms- overlevelse (95% KI, 1,025 til 6,631, HR 2,607,
P
= 0,04; 95% CI, 1,039 til 6,555, HR 2,61,
P
= 0,04; 95% CI, 1,821 -35,091, HR 7,993,
P
= 0,006, henholdsvis). Interessant, cytoplasma farging av FOXM1 ble også påvist i tillegg til kjernefysisk uttrykk, men ble ikke observert noen signifikant sammenheng med clinicopathological parametre (data ikke vist).
A, Representative bilder av immunoreaktivitets atom FOXM1 i (I) godartet cystadenoma, (II) borderline tumor, (III) fase I invasiv kreft, (IV) trinn II invasiv kreft, (V) stadium III invasiv kreft og (VI) stadium IV invasiv kreft. Forstørrelser X400. Innfellinger: Regioner med høyere forstørrelser av atom FOXM1 flekker. B, kumulative ordnede og sykdomsfri overlevelse tomter ved hjelp av Kaplan-Meier tilnærming.
Transient knockdown av FOXM1 hemmer Skov-3 celle migrasjon og invasjon
Vi neste undersøkt rollen FOXM1 i kreft progresjon eggstokkene.
In Vitro
Transwell analyser ble benyttet for å studere effekter av forbigående stanse av FOXM1 på eggstokkreft cellemotilitet og invasjon. Betydelig redusert migrasjon og invasjon (
P
0,05) ble observert i Skov-3 celler transfektert med ON-TARGET Plus Menneskelig FOXM1 siRNA (siFOXM1) sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (siControl), noe som indikerer at knockdown av FOXM1 var i stand til å inhibere migrering og invasjon av SKOV3-celler (fig. 2).
A. Representative bilder som viser celler migrert (gelatin-belagt membran) eller invadert (matrigel belagt membran) etter 24 timer. B. Representative Western blot-analyse demonstrerer effektiviteten av FOXM1 forbigående knockdown i SKOV-3. C. Grafisk representasjon av migrasjon (venstre panel) og invasjon (høyre panel) resultater som gangers forandring av migrerte og invaderte celler i forhold til kontrollgruppen, henholdsvis, i fem felt av triplikate brønner fra tre uavhengige eksperimenter; * P 0,05, betydelig; Mann-Whitney
U
-test.
Paclitaxel behandling nedregulerer uttrykket av FOXM1 i Skov-3, men ikke i den paclitaxel-resistente SKOV3-TR
I riss av IHC-farging som viser at forhøyet FOXM1 ekspresjon er assosiert med dårlig prognose og således chemoresistance, et par av etablert eggstokk-kreft cellelinje følsomme og resistente overfor paclitaxel, nemlig SKOV-3 og SKOV3-TR respektivt, ble anvendt for å studere effekten av paclitaxel behandling på uttrykk for FOXM1. Celler ble behandlet med paclitaxel (100 nM) og innhøstet ved forskjellige tidspunkter 0, 8, 16, 24, 48 og 72 timer. Forbløffende nok immunoblotting viste FOXM1 uttrykk til å bli redusert til 48 timer og 72 timer i Skov-3. Imidlertid forble FOXM1 ekspresjon relativt konstant ved høye nivåer i SKOV3-TR ved paclitaxel-behandling (fig. 3), noe som tyder på en rolle FOXM1 ved formidling av paclitaxel motstand i eggstokkreft celler. Spesielt, er det også ut til å være kun marginale økninger i ekspresjon av spaltede Caspase-9 og Caspase-7 både i SKOV-3 og SKOV3-TR på paclitaxel-behandling, hvilket antyder at apoptose kan ikke være den dominerende mekanisme for å indusere celledød i disse ovarialcancer celler.
paclitaxel sensitive Skov-3 og resistente SKOV3-TR eggstokkreft celler ble behandlet med 100 nM paclitaxel og høstet til tider blir brukt for Western blot analyse. Paclitaxel behandling nedregulert FOXM1 uttrykk ved tidspunkter 48 timer og 72 timer i Skov-3, men ikke i SKOV3-TR som vist ved immunoblotting. Det var også ikke markerte endringer i den kløyvde caspase-9 og caspase-7 uttrykk.
Transient stanse av FOXM1 vesentlig bedre paclitaxel-mediert mitotisk katastrofe
Vi har tidligere vist at paclitaxel dreper eggstokkreft celler, hovedsakelig ved å indusere mitotisk katastrofe i stedet for apoptose i celler [10]. Å belyse potensielle rolle FOXM1 i eggstokkreft chemoresistance, ble Skov-3 og OVCAR3 eggstokkkreft cellelinjer behandlet med paclitaxel i 24 timer etter FOXM1 utarming av siRNA, farget med DAPI og undersøkt av fluorescerende mikroskopi. Resultatet viste at det var en økning i antall flerkjernedannelse celler (pil) i eggstokkreft celler med FOXM1 knockdown (
P
= 0,03 og 0,01, henholdsvis) (Fig. 4), noe som tyder FOXM1 uttømming betydelig forbedret paclitaxel -mediert mitotisk katastrofe i både Skov-3 og OVCAR3. Det er bemerkelsesverdig at apoptose var knapt synlig i disse paclitaxel-behandlede celler. Dette var sannsynligvis på grunn av det faktum at både SKOV-3 og OVCAR3 havnen dysfunksjonelle p53, p53 og funksjonelt er nødvendig for paclitaxel-indusert apoptose i eggstokkreft celler.
SKOV-3 og OVCAR3-celler transfektert med enten siRNA bassenger mot FOXM1 eller kontroll siRNA bassenger ble behandlet med paklitaksel (100 nM) og farget med DAPI. A. Representative fargingsresultater ble vist som viser at transient FOXM1 knockdown betydelig forbedret paclitaxel-indusert mitotisk katastrofe (pil) i Skov-3 og OVCAR3 celler henholdsvis (Øvre panel). B. graf representerer resultatene av tre uavhengige eksperimenter, som viser prosentandelen av celler som gjennomgår mitotisk katastrofe, * P 0,05, signifikant; Mann-Whitney
U
-test.
FOXM1 knockdown induserer beskjedne økninger i akkumulering av G2 /M og døde celler på paclitaxel behandling i motstandsdyktig SKOV3-TR cellelinje
cellesyklusanalyse ble deretter utført for å klargjøre rollen av FOXM1 i paclitaxel-mediert celledød. For dette formål ble SKOV-3 og SKOV3-TR-celler transient transfektert med kontroll og FOXM1 siRNA i 48 timer og dyrket i nærvær eller fravær av paclitaxel-behandling (100 nM) i 48 timer. De resulterende cellene ble høstet, farget med propidiumjodid og utsatt for flowcytometrisk analyse. Resultatene viste at paclitaxel induserte signifikante nivåer av celledød (sub-populasjon G1) i SKOV-3-celler transfektert med enten FOXM1 eller tak siRNA basseng (fig. 5A, øvre panel). Økt antall celler akkumulerte med sub-G1 DNA-innhold i SKOV3-TR med FOXM1 knockdown (8,1%) (Fig. 5A, øvre panel) sammenlignet med SKOV3-TR transfektert med kontroll siRNA (4,2%) (Fig. 5A, øvre panel ), noe som tyder FOXM1 bidrar til paclitaxel motstand i eggstokkreft celler og at FOXM1 lyddemping kan forbedre paclitaxel-mediert celledød. Ved paclitaxel behandling, en beskjeden økning i celler blokkert ved G2 /M fasen ble også observert i SKOV3-TR behandlet med siRNA mot FOXM1 sammenlignet med kontroll, noe som tyder FOXM1 stanse kan forbedre paclitaxel-mediert celledød via mitotisk katastrofe (fig. 5A nedre panel fig. 5B). Nedbryting av FOXM1 i de sensitive Skov-3 celler har ingen tilleggseffekt til paclitaxel behandling. Dette skyldes sannsynligvis det faktum at paclitaxel funksjoner gjennom downregulating FOXM1 uttrykk som avslørt av Western blot analyse (se Fig. 3).
A. Flowcytometrisk analyse ble utført etter propidiumjodidfarging på SKOV-3 og Skov-3-TR celler behandlet med paklitaksel (100 nM) eller forble ubehandlet etter transfeksjon med siRNA bassenger mot FOXM1 eller kontrollere siRNA bassenger. Representative data er vist som indikerer at FOXM1 stanse er i stand til å øke antallet av døde celler og celler er blokkert i G2 /M-fase cellesyklus i SKOV-3-TR sammenlignet med celler behandlet med kontroll siRNA. B. Bar diagrammer i ulike faser av cellesyklus i Skov-3 og SKOV3-TR behandlet med paklitaksel etter transfeksjon med kontroll eller siRNA mot FOXM1. Resultatene representerer data fra to uavhengige forsøk.
KIF2C er identifisert som en roman FOXM1 transkripsjonen mål som kan være innblandet i oppkjøpet av chemoresistance
Bioinformatikk analyse viste KIF2C, et medlem av KIF superfamilien av proteiner, som et potensielt mål gen av FOXM1 med konsensus gaffelhodebindingsseter som ligger oppstrøms for transkripsjonsstartsetet (fig. 6D). Ved hjelp av et par av paclitaxel-sensitive (PEO1) og motstandsdyktig (PEO1-TaxR) eggstokkreft cellelinje, paclitaxel behandling nedregulert uttrykk for KIF2C på 48 timer og 72 timer i PEO1. Imidlertid forble KIF2C uttrykk relativt konstant i PEO1-TaxR på paclitaxel behandling (fig. 6A), noe som tyder på en rolle KIF2C i formidling av paclitaxel motstand i eggstokkreft celler. Forbløffende nok uttrykk for FOXM1 endret i et lignende mønster (Fig. 6A). Kvantitativ real-time PCR (qPCR) ble deretter anvendt for å studere effekten av forbigående stanse av FOXM1 på transkripsjon nivå av KIF2C. FOXM1 knockdown resulterte i betydelig nedregulert mRNA uttrykk for KIF2C i begge cellelinjer (P 0,05) (figur 6B.). Kromatin immunoutfelling-qPCR (chip qPCR) viste videre FOXM1 var i stand til å binde til promotorområdet av KIF2C (P 0,05). (Fig. 6C), noe som tyder KIF2C kan tjene som en ny FOXM1 transkripsjonen mål
A, Paclitaxel behandling (50 nM) nedregulert FOXM1 og KIF2C uttrykk ved 48 t og 72 t på PEO1 men ikke i PEO1-TaxR. B, FOXM1 knockdown betydelig redusert transkripsjon nivået KIF2C i PEO1 og PEO1-TaxR. Data representerer tre paralleller fra tre eksperimenter. * P = 0,04, *** P = 0,0003. siControl: Ikke-spesifikk kontroll. siFOXM1: FOXM1 knockdown. C, chip-qPCR viste FOXM1 betydelig trekke ned KIF2C promoter-regionen i PEO1 og PEO1-TaxR i forhold til den negative IgG kontroll. Data representerer tre paralleller fra tre eksperimenter. * P = 0,04, *** P = 0,0001. D, Prinsippskisse som viser plassering av gaffelhode respons element (FHRE) og bindingssetet av primere som brukes i ChIP-qPCR oppstrøms av transkripsjon start stedet for KIF2C.
Diskusjoner
I denne studien viser vi at høy atom FOXM1 ekspresjon er signifikant korrelert med scenen, kortere total overlevelse og sykdomsfri overlevelse av ovarian kreftpasienter. Multivariat analyse indikerer at FOXM1 uttrykk kan tjene som en uavhengig prognostisk faktor. Videre er forbigående FOXM1 uttømming stand til å inhibere ovarial cancer cellemigrering. Disse funnene tyder på at FOXM1 kan ha en avgjørende rolle i eggstokkene kreftutvikling og progresjon, og kan forutsi pasientens utfall.
Selv om FOXM1 tilknytning høy klasse eggstokkreft karsinom har blitt rapportert [16], enten FOXM1 deltar i oppkjøpet av paclitaxel motstand forblir udefinert. Faktisk har deregulert FOXM1 ekspresjon er vist å gi resistens overfor kjemoterapeutiske medikamenter som cisplatin og epirubicin [8], [9]. I lys av den immunhistokjemiske funn tyder assosiasjon mellom FOXM1 og chemoresistance, et par av etablerte paclitaxel-sensitive og -resistente cellelinjer, SKOV-3 og SKOV3-TR [10], ble anvendt for å studere effekten av paclitaxel på FOXM1. Interessant, paklitaksel behandlingen resulterte i nedregulering av FOXM1 i SKOV-3, men ikke i den resistente cellelinje SKOV3-TR, noe som tyder på en rolle FOXM1 ved formidling av paclitaxel motstand i eggstokkreft celler. Immunfluorescens Studien viste videre transient FOXM1 knockdown kunne forbedre paclitaxel-mediert celledød i to eggstokkreft cellelinjer, Skov-3 (slettet p53) [17] og OVCAR3 (mutant p53) [18]. Det er ikke overraskende at apoptotiske celler var knapt synlig som begge cellelinjer båtplass dysfunksjonell p53. Nylig ble det foreslått at induksjon av p53-uavhengig apoptose skjer gjennom aktivering av Caspase-9 [19]. Imidlertid immunoblotting avslørte Caspase-9 ble ikke aktivert ved paclitaxel behandling i SKOV-3 og Skov-3-TR-celler, noe som indikerer at både paclitaxel og FOXM1 stanse virkning celledød i første rekke gjennom å forbedre mitotisk katastrofe i stedet for apoptose i eggstokkreft celler, som vanligvis har dysfunksjonelle p53 veien. Dette er i overensstemmelse med tidligere funn på paclitaxel i brystkreft [20].
Mitotisk katastrofe kan betraktes som en form for celledød som oppstår under mitose eller som følge av svikt mitotisk [21]. To mekanismer har blitt foreslått som avgjørende for mitotisk katastrofe, nemlig G2 /M og mitotiske spindel sjekkpunkter [22]. For G2 /M sjekkpunkt, inaktivering av gener som
p53
,
p21
Cip1 Hotell og
14-3-3Sigma
har blitt rapportert å indusere DNA skade-indusert mitotisk katastrofe [23], [24]. Flowcytometrisk analyse utført i vår studie antydet FOXM1 knockdown i kjemoresistent eggstokkreft cellelinje SKOV3-TR kan indusere celledød. Paclitaxel behandling og immunfluorescens analyse videre foreslått FOXM1 lyddemping kunne forbedre paclitaxel-mediert mitotisk katastrofe i en p53-uavhengig og caspase-9-uavhengig måte. Avgrensning av den underliggende mekanismen som FOXM1 formidler paclitaxel motstand vil belyse nye tilnærminger til behandling.
kinesin super proteiner (KIFS) spiller sentrale roller i intracellulær transport av organeller og vedlikehold av spindelenheten under mitose og meiose [ ,,,0],25]. Å være grunnleggelsen og best karakteriseres medlem av kinesin-13-familien, er KIF2C /MCAK avgjørende for å sikre den trofaste segregering av kromosomene i mitosen og for ivaretakelse av kromosom stabilitet [26]. Ikke overraskende opp-reguleringer av KIF2C har blitt dokumentert i flere kreft hos mennesker og KIF2C har blitt foreslått å spille en viktig rolle i kreftutvikling [27], [28]. I denne studien, immunblotanalyse viste KIF2C uttrykk i PEO1 endret på et lignende mønster som FOXM1 uttrykk ved å vise en nedregulering på 48 timer og 72 timer på paclitaxel behandling. I kontrast, forble KIF2C uttrykk relativt konstant i PEO1-TaxR, impliserer KIF2C kan være involvert i utviklingen av paclitaxel motstand i eggstokkreft. Dette funnet er konsistent med en fersk rapport som viser tap av KIF2C kan øke følsomheten av kinesisk hamsterovarie (CHO-celler) til paclitaxel [29]. Videre KIF2C ble identifisert som en roman FOXM1 transkripsjonen mål som kan spille en sentral rolle som formidler paclitaxel motstand i eggstokkreft celler.
I konklusjonen, ble overekspresjon av FOXM1 funnet å være korrelert med dårlig pasientenes overlevelse og til paclitaxel-mediert mitotisk katastrofe i eggstokkreft celler.
