Abstract
Bakgrunn
Fomitopsis pinicola (Sw Ex Fr.. m) Karst plakater (FPK) som tilhører stilksporesopper sopp klasse er en av de mest populære medisinske sopp i Kina. Det har vært brukt i mange sykdommer: kreft, hjertesykdommer, diabetes, og så videre. Imidlertid har liten studie på pro-apoptotiske effekt og migrasjon hemming av FPK kloroform ekstrakt (FPKc) er rapportert og mulig involverte mekanismen har ikke blitt belyst.
metodikk /hovedfunnene
Chemical analysen ble utført ved hjelp av HPLC som viste ergosterol konsentrasjon (ES) var 105 ug /mg. MTT-analysen viste at FPKc kan selektivt inhibere SW-480-celler levedyktighet med IC
50 av 190,28 ug /ml. Sårtilheling og transwell analysen indikerte at FPKc kunne hemme migrering av SW-480 celler åpenbart, FPKc kan også dramatisk redusert de matriksmetalloproteinaser-2, 9 (MMP-2 og MMP-9) uttrykk. Annexin V-FITC /PI farging, kjernekraft Hoechst 33342 farging og DNA-fragmentering analyse viste at FPKc og ES kan indusere SW-480 celler apoptose. Den apoptose Fremgangsmåte tett involvert i ROS-akkumulering og uttømming av GSH, aktivering av kaspase 3, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) degradering. FPKc kan også up-regulere P53 uttrykk og dermed føre til G1 fase arrest. Når SW-480 celler ble forbehandlet med N-acetylcystein (NAC), ROS generasjon, celle levedyktighet og apoptotisk forholdet ble delvis avslått, noe som indikerte at ROS var loddrett i pro-apoptose prosess indusert av FPKc. Videre, i hele prosessen, ES som tidligere er blitt funnet i FPKc hadde lignende effekt til FPKc. Dermed kan vi konkludere med at ES, som en av de høyeste rikelig komponentene i FPKc, kanskje også en av de aktive bestanddelene.
Konklusjon /Betydning
FPKc kunne hemme migrering av SW-480 celler, indusere SW-480 celler G1 fase arrest og forårsake ROS-mediert apoptose effekt. Og ES kan være en av de effektive bestanddeler i hele prosessen
Citation. Wang Y, Cheng X, Wang P, Wang L, Vifte J, Wang X, et al. (2014) Gransker Migrasjon Hemming og apoptotiske Effekter av
Fomitopsis pinicola
Kloroform Extract on Human tykktarmskreft SW-480 celler. PLoS ONE 9 (7): e101303. doi: 10,1371 /journal.pone.0101303
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 19 desember 2013; Godkjent: 03.06.2014; Publisert: 03.07.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en svulst med fleetness øker på verdensbasis hvert år. Hvert år nesten halvparten av de diagnostiserte pasienter ville være død av sykdommen [1]. CRC er regnet som den tredje mest vanlige ondartede tumor og den tredje dødsårsak av kreft i USA [2]. Selv om forekomsten av CRC er mye lavere i Asia sammenligne at det i USA er det blitt øker raskt i Kina [3]. Mens tradisjonell behandling for CRC inkludert kirurgi, strålebehandling, og aktuelle kjemoterapeutiske alternativer har vært ute av effektivitet og har mange bivirkninger [4]. Alle disse problemene markere viktigheten av å finne ut en ny agent for CRC. Som tradisjonell kinesisk medisin har blitt mer og mer populært, har det vært ansett som potensiell terapeutisk middel på grunn av sin høye effektivitet og sikkerhet [4].
Fomitopsis pinicola (Sw. Ex Fr.) Karst
(FPK) som tilhører stilksporesopper sopp klasse er en av de vanligste tre rooting sopp og utbredt i mange land i verden, som Japan, Korea, Kina og Sverige [5]. FPK ble tradisjonelt brukt som en helsekost kilde for plantevekst regulering og diabetes i Japan [6], [7]. FPK som et ikke-toksisk naturlig produkt har blitt mer og mer attraktivt for forskere, og dens ekstrakter har blitt rapportert å ha anti-inflammatorisk, anti-mikrobielle, anti-sopp og anticancer virkning [8], [9], [10]. For anticancer effekt av FPK, forskning i hovedsak fokusert på sin etylacetat og etanol ekstrakter. For eksempel, Ren G demonstrert både petroleter og etylacetat-ekstrakter av FPK har cytotoksisitet mot visse tumorcellelinjer så som Hela og SMMC-7721 [11]. Hung-Tsung Wu fra Taiwan har vist F. pinicola etanolekstrakt har anticancer-effekt på S180-celler in vitro og in vivo. Han viser også at det kan utløse Homo sapiens hepatoma (HepG2), lungekreft (A549), kolorektal kreft (HCT-116) og brystkreft (MDA-MB-231) celler apoptose [12]. Og for FPK Kloroformekstraktet (FPKc), er det bare en rapport for å demonstrere dets anti-fungal virkning [10]. Til vår beste kunnskap, har lite informasjon om anticancer effekten av FPKc blitt publisert. Derfor er det første målet med vår studie var å vurdere om FPKc kan utøve sin anticancer effekt i vårt eksperimentelle system, da i hovedsak fokusere på å undersøke migrasjon hemming og pro-apoptose effekten av FPKc og potensialet involvert mekanismer.
videre, den kjemiske analysen av FPK ekstrakter, som hovedsakelig peker i n-heksan og metanol ekstrakter av FPK inneholde noen triterpenoids som ergosterol, ergosterol-derivater, lanostane triterpener og så videre [13], [14]. Mens den kjemiske analysen om FPKc har aldri blitt studert. Fordi ergosterol (ES, figur 1) er blitt rapportert å fordele vidt i mange typer sopp og viser noen anticancer virkning [15], [16]. Dermed annen Hensikten med denne studien var å undersøke de kjemiske komponentene i FPKc og undersøke om ES jobbet da FPKc utført sitt anticancer effekt.
Metoder og materialer
Samling og utarbeidelse av kloroform ekstrakt
Ingen spesielle tillatelser var nødvendig for stedet der FPK ble samlet og denne studien ikke involverer truet eller beskyttet arter.
den friske FPK ble samlet i juli 2011 fra Pingheliang, sør av Qinling Fjell, Shaanxi-provinsen, Kina (breddegrad, 33 ° 27’N, lengdegrad, 108 ° 30’E, høyde, 2305 m). Det ble bekreftet av professor Yaping Xiao og deponert i Kunnskapsdepartementet, Key Laboratory for medisinsk plante Resource (MPR) og Natural Farmasøytisk kjemi, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi, Kina.
etanolekstrakt av FPK ble oppnådd gjennom den ultrasoniske utvinningsmetoden og deretter konsentrert med en roterende evaporator (RE-2000 A; tilhører, Shanghai, Kina). For det tredje ble det tørket med en frysetørker (ALPHA1-2, KRISTUS, Tyskland) og til slutt frysetørket. Etanolen ekstraktet ble deretter fraksjonert ved kloroform (CHCIs
3). Kloroform-fraksjonen ble homogenisert i 70% etanol, og supernatanten ble filtrert ved bruk av 0,22 mm filter.
HPLC-analyse
Bestemmelsen av FPKc og ES ble evaluert ved høytrykks-væskekromatografi (HPLC) analysemetode. LC-systemet besto av Shimadzu LC-20AT (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) med en kvaternær pumpe, en termostat kolonne kammer og Shimadzu LC-løsning programvare. Separasjon av fytokjemikalier ble oppnådd på en Shim-pack VP-ODS C18-kolonne (Shimadzu, 1504,6 mm, 5 mm partikkelstørrelse). Den mobile fase bestod av acetonitril og vann. En gradient eluering program ble anvendt som 10-100% acetonitril (v /v) ved 0-80 min, 100% -85% på 80-90 min, og holder 85% ved 90-100 min. Kolonnetemperaturen ble holdt konstant ved 40 ° C, og den mobile fase Strømningshastigheten var 0,8 ml /min. Påvisningen bølgelengden var 254 nm og 20 pl prøver ble injisert. Re-likevekt varighet var 15 min mellom de enkelte løper.
Kalibreringskurver
ES-standarden ble brakt i Sima, Tianjin, Kina. Renheten ble vist å være høyere enn 98%. Kalibreringskurver ble konstruert med fortynninger av 2000, 1000, 500, 250, 125 ug /ml i metanol. Et volum på 20 ul ble injisert ved triplikat og kalibreringskurvene var basert på den gjennomsnittlige topparealene for hvert kromatogram. Kalibreringskurvene viste en R
2 av 0,993 for ES.
Cell kultur
SW-480, SW-620, Caco-2 og HEK-293 celler ble kjøpt fra cellen bank av den kinesiske Academy of Science, Shanghai, Kina. SW-480, SW-620 Caco-2 og HEK-293 cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640, L-15 og DMEM-medium, respektivt. Alle av dem ble dyrket med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) og 1% glutamin i 100 cm
2 vevsdyrkingskolber i henhold til en fuktet 5% CO
2 og 95% luft atmosfære ved 37 ° C.
Celleviabilitet
for å evaluere effekten av FPKc på SW-480, SW-620 og Caco-2 celle levedyktighet, celler ble sådd i 96-brønns plater (5 x 10
4, 1 x 10
5 og 1 x 10
5). Forskjellige konsentrasjoner av FPKc ble brukt på SW-480 (120, 160, 200, 240 ug /ml 70% etanol ble anvendt som løsningsmiddel kontroll) og SW-620 (40, 80, 120, 160, 200, 240 pg /ml) og Caco-2 (40, 80, 120, 160, 200, 240, 280 ug /ml) celler. Forskjellige doser av ES (0, 12, 24 ug /ml; 100% etanol) ble tilsatt til SW-480-celler. Etter at alle cellene ble inkubert i 48 og 72 timer henholdsvis. Humane embryonale nyre
293 plakater (HEK-293) celler ble brukt som normale celler derimot å evaluere cytotoksisk aktivitet av FPKc. Levedyktigheten av de fire cellelinjer ble bestemt ved hjelp av MTT-analyse [17]. Absorbansen ved 570 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Tek ELX800, USA). Den cellelevedyktighet FPKc og ES behandlede prøvene ble deretter beregnet ved å sammenlignet med kontrollen. (All konsentrasjonen nevnt i denne artikkelen referert til tørrvekten).
Cell motilitet
Cell motilitet ble evaluert av grunnen såret og transwell analysen. For scratch såret analysen: SW-480-celler ble sådd ut i 24-brønners plater i 24 timer, deretter cellene i individuelle brønner ble såret ved å skrape med en pipettespiss og cellene ble inkubert med den indikerte konsentrasjon av FPKc og ES for 12 og 24 timer. Cellene ble fotografert under fase-kontrastmikroskopi (x 200 forstørrelse).
For transwell analysen, 5 x 10
5-celler ble sådd ut i topp kammer med serumfritt medium inneholdende 0,3% BSA og mellom inneholdende 10% serum ble tilsatt til det nedre kammer i den Corning kammeret (polykarbonatfilter med 8 mm porestørrelse innsatser, Corning Pharmingen, San Diego, CA). Etter inkubering i 36 timer, cellene flyttet til undersiden av membranen ble detektert ved å tørke den øvre side med bomullspinne og beising undersiden cellene med 0,1% krystallfiolett oppløsning. Celler flyttet til undersiden av membranen ble observert i mikroskop, og det krystallfiolett klebet på undersiden cellene ble løst opp i 33% eddiksyre, ble OD forholdet av oppløsningen målt ved 570 nm ved mikroplateleser.
Immunfluorescens
etter FPKc inkubering i 24 timer, ble cellene anbragt som folowing: fiksert med 4% paraformaldehyd, permeabilisert med 0,1% Triton X-100 og blokkert med 5% bovint serumalbumin (BSA), mellom hvert trinn cellene ble vasket med PBS tre ganger. Etter celler ble blokkert, ble de inkubert med anti-MMP-9 og -MMP-2 antistoffer (kjøpt fra Santa Cruz) over natten og farget med den tilsvarende sekundære antistoff utført av immunoglobulin FITC (Zhong Shan Golden Bridge Bioteknologi Co, Beijing, Kina ) ved 37 ° C i mørke i 1 time, og deretter Cellene ble fotografert med fluorescens mikroskop (Nikon E 600).
Hoechst 33342-farging
Hoechst 33342-farging ble gjennomført for å detektere endringer av kjerner morfologi av SW-480 celler etter FPKc og ES behandling. De behandlede celler ble farget med 10 uM Hoechst 33342 i 15 minutter ved 37 ° C, deretter ble de fargede cellene ble vasket tre ganger med PBS og observert ved hjelp av et fluorescens mikroskopi med standard eksitasjon filtre (Nikon, Japan). Eksitasjon bølgelengde var 346 nm og emisjonsbølgelengden var 460 nm
Flowcytometri analyse av DNA-fragmentering
metode for å analysere DNA-fragmentering var flyten fluorocytometric påvisning av DNA hypoploidy etter tilsetting propidiumjodid (PI.; Sigma, St. Louis, USA) til døende celler og permeabilizing dem ved fryse-tine [18]. For å undersøke effekten av FPKc og ES på DNA skade av SW-480 og HEK-293 celler, utførte vi oligonucleosomal DNA fragmentering av flyt fluorocytometry. Celler i 24-brønners plater ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FPKc og ES i 12 timer, henholdsvis. Cellene ble deretter farget med 5 ug /ml PI og analysert for DNA-innhold ved hjelp av strømningscytometri.
cellesyklusanalyse
SW-480 ble sådd ut i 24-brønners plater, og deretter behandlet med FPKc og ES (0, 240, og 24 ug /ml) i 24 timer. Deretter ble cellene høstet og anordnet som følgende trinn: vasket to ganger med kald PBS inneholdende 1% BSA (Sigma, St. Louis, USA), fiksert med 70% iskald etanol ved -20 ° C over natten, deretter vasket to ganger med kald PBS , inkubert med 100 pg /ml RNase A (Sigma, St. Louis, USA) i 30 minutter ved 37 ° C, etter at farget med 50 ug /ml PI i 30 minutter i mørket og endelig analysert ved flow-cytometri (Millipore, USA).
Annexin V-FITC /PI farging eksperiment
phosphatidylserine fungerer som en sensitiv markør for celler som gjennomgår apoptose når det er ekstern til den ytre pakningsvedlegget [19]. forholdet mellom apoptotiske celler ble således målt med en Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, SW-480, SW-620 og HEK-293-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FPKc og ES i 24 timer ved 37 ° C, deretter ble de behandlede celler ble høstet og resuspendert i 200 ul bindingsbuffer. Etter tilsetning av 2 pl Annexin V-FITC og 2 ul Pl til cellesuspensjonen, ble prøvene inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Den apoptotiske Indeksen ble umiddelbart bestemt ved strømningscytometri.
Påvisning av intracellulær reaktive oksygenarter (ROS) generasjon
Noen spiselig sopp, så som Pleurotus abalonus, kan provosere ROS-mediert apoptose [20] . I denne studien også vi målte forandringer i celle ROS nivå gjennom den oksidative omsetting av den følsomme fluorescerende probe 2 «, 7′-dichlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) for å fluorescerende 2′, 7»-dichlorofluorescein (DCF). DCFH-DA diffunderer lett gjennom cellemembranen og enzymatisk hydrolysert ved intracellulære esteraser til danner ikke-fluorescerende DCFH, som deretter hurtig oksyderes for å danne sterkt fluorescerende DCF i nærvær av ROS, og fluorescensintensiteten er proporsjonal med ROS produksjon. SW-480 og HEK-293-celler i 24-brønners plater ble behandlet med den nevnte konsentrasjon av FPKc og ES i 3 og 6 h (HEK-293-celler bare i 6 timer). Cellene ble høstet og vasket to ganger med PBS, resuspendert i 500 pl 10 pM DCFH-DA (levert fra Molecular Probes Inc., Invitrogen, CA, USA) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i mørket. Prøvene ble deretter umiddelbart detektert ved strømningscytometri. Histogrammer ble analysert ved hjelp av FCS Express V3.
glutation besluttsomhet
SW-480 celler ble inkubert i 24-brønners plater, og da de ble behandlet med FPKc og ES i 3 timer og 5 timer. Etter dette ble de behandlede cellene høstet og vasket to ganger med PBS. Totalt glutation konsentrasjoner ble utført av Glutathione Kit (Nanjing Jiancheng bioteknologi institutt, Kina) i henhold til produksjon protokoll. Til slutt ble prøvene målt ved 405 nm med mikroplateleser (Bio-Tek ELX 800, USA).
Western blotting-farging
SDS-PAGE og immunoblotting ble utført i henhold til standardprosedyrer. I korthet, etter behandling med FPKc (240 ug /ml) og ES (24 ug /ml) i 0 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer ble cellene lysert ved RIPA buffer på is. Proteinprøvene ble separert på en 10% SDS polyakrylamid gel, og deretter ble gelen ble overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, MA, USA) og blottet med primære antistoffer (Caspase-3, spaltet-RARP, Bcl-2, P53 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, USA) over natten ved 4 ° C. De bundne primære antistoffer ble deretter merket med IRDye 680 konjugert IgG (Li-cor, Biosciences) ved romtemperatur i 1 time. Og det infrarøde fluorescens ble påvist med Odyssey infrarød bildesystem (Li-Cor Bioscience, Lincoln, NE).
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer, og data ble uttrykt som betyr ± SD. IC50-verdier ble beregnet ved regresjonsanalyse. Dataene ble utsatt for en analyse av Duncans multiple range test (SPSS, versjon 18.0). En signifikant forskjell ble ansett å foreligge i et nivå på ** p. 0,01
Resultatene
HPLC
HPLC-analyse er vist for å identifisere ES og de kjemiske komponentene FPKc. Dataene ble vist i figur 2, ved de samme eksperimentelle betingelser, ES standard viste sin retensjonstid på 83,8 min (figur 2B); FPKc vist seks hovedtopper, og med en topp med samme retensjonstid på ES, noe som tyder ES kan være en av de viktigste komponentene i FPKc (figur 2A); Fra området av toppene, avslørte ES rangeres den andre i FPKc; Fra den kvantitative bestemmelse av ES i FPKc med HPLC, spekulerte vi ES besatt 105 ug /mg (ca. 10% i det totale FPKc).
FPKc og ES standard ble identifisert ved hjelp av HPLC-PDA ved 254 nm som beskrevet i den eksperimentelle delen.
cytotoksiske effektene av ES
3A-C viste cytotoksisitet av FPKc på SW-480, henholdsvis SW-620 og Caco-2 celler FPKc og som var i en dose- og tidsavhengig måte. Når SW-480-celler ble behandlet med 120 og 240 ug /ml FPKc i 48 timer, cellelevedyktigheten tapet var 34,99 ± 1,08% og 65,20 ± 2,34%, IC
50 verdi ble beregnet til 190,28 ug /ml; For SW-620-celler, cellelevedyktigheten ble redusert til 74,61 ± 0,99% og 29,52 ± 1,28% når konsentrasjonen var 80 og 160 ug /ml, henholdsvis IC
50 verdi ble beregnet til 143,26 ug /ml. Caco-2 utført mindre sensitiv enn de ovenfor angitte 2-cellelinjer. Etter 72 timers inkubering med FPKc, Caco-2 begynte å utføre levedyktighet tap, cellelevedyktigheten var 71,65 ± 0,003% med 200 ug /ml FPKc, og når dosen økes til 280 ug /ml cellelevedyktigheten ble redusert til 47,16 ± 0,011% og IC
50 var 371,5 mikrogram /ml.
SW-480, SW-620, Caco-2 og HEK-293 celler levedyktighet etter FPKc (A, B, C, D) og ES (E) behandling ble målt ved MTT-analyse. Hver verdi ble uttrykt som middelverdi ± S.D. av minst tre uavhengige bestemmelser. Enveis ANOVA ble brukt for sammenligning av flere gruppeanordning, etterfulgt av Dunnetfs t-test. * P 0,05 og ** P 0,01 versus kontroll. (feilfelt = S.D., n = 3).
Figur 3D viser den cytotoksiske aktivitet av ES, og cellene skaden var 34,52 ± 0,58% når ES-dosen var 24 ug /ml etter 48 timers inkubering. Til sammenligning, under de samme forsøksbetingelser, 240 ug /ml FPKc forårsaket 65,20 ± 2,34% celleviabilitet tap, som tyder på noen andre cytotoksiske komponenter som finnes i FPKc.
For sammenligning figur 3E reflekterte cytotoksisiteten til FPKc på human normal Embryonic nyre 293 celler (HEK-293), ble en relativt svakere celleskader observert i HEK-293 celler sammenlignet med SW-480 celler under samme dose FPKc, noe som tyder FPKc har noen selektiv tumorcelledrepende effekt.
migrasjon hemming av FPKc og ES på SW-480 celler in vitro
for å avgjøre om FPKc påvirket migrasjonen evne SW-480 celler, sårheling og transwell-analysen ble utført (figur 4A). Sårhelingsprosessen evnen til cellene reflekterte deres bevegelse og migrering på overflaten på hvilken de ble forankret til for vekst. I SW-480 celler, sammenlignet med 0 timer etter såret, etter 12 timers inkubasjon, hver tette celler i kontrollen gradvis vokste til mellomrommet av sår; celler i 120 mikrogram /ml FPKc behandlede gruppe viste liten forskjell med kontroll; mens celler i 240 mikrogram /ml FPKc og 24 ug /ml ES-behandlede gruppene sjelden vokste til mellomrommet av såret. Når inkubasjonstiden øket til 24 timer, ble evnen til-cellemigrering ble redusert med hver dose av FPKc. Og antall celler med 120 ug /ml FPKc og 24 ug /ml ES ble ikke endret mye sammenlignet med kontrollen, mens 240 mikrogram /ml ble behandlet gruppe ble redusert synlig.
SW-480 celler i 24- brønners plater ble såret ved å skrape med en pipette tips og cellene ble inkubert med FPKc og ES for 12, 24 timer. Cellene ble fotografert under fase-kontrastmikroskopi (forstørrelse x 200). Figur 4B, Analyse av forandring i migrering på SW-480-celler ved transwell-analyse. Cellene i hver gruppe bevegelse til den nedre overflate av filteret ble farget med krystallfiolett og fotografert under et lysmikroskop ved 200 x. b) OD forholdet mellom krystallfiolett ble målt. Feilstolpene representerer standardavvik for de midler fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p. 0,01 versus ubehandlet kontroll
Transwell analysen ble ansatt for å ytterligere bekrefte migrasjon hemming indusert av FPKc på SW-480 celler. Og Figur 4B viste at etter 24 timers inkubering med FPKc, nedsatt cellemigrering evnen til 28,28 ± 0,07% sammenlignet med kontroll; og for ES-gruppen, migreringen var 51,92 ± 0,85%, noe som bekreftet den til sårheling analysen. De begge Resultatene indikerte FPKc og ES kunne hemme cellevandring åpenbart.
immunfluorescens
MMP er vertikale i celle migrasjon og bevegelse. MMP-2 og MMP-9 ble påvist ved immunfluorescens eksperiment i denne studien. Figur 5 viste MMP-2 og MMP-9 ble høy uttrykt med lys grønn fluorescens i kontrollgruppen. Og for ES og FPKc grupper, nedsatt begge enzymene kraftig sammenlignet med kontrollen.
SW-480-celler ble fiksert og behandlet for immunofluorescens, MMP-9 og MMP-2 ble visualisert ved bruk av FITC-merket andre antistoff ( grønn). Skala barer, 100 mikrometer.
Morfologiske endringer indusert av FPKc og ES på SW-480 celler
Morfologisk undersøkelse ble utført av Hoechst 33342. Som vist i figur 6 kjerner av kontrollceller ble jevnt farget, og kontrasten fasen indikerte normal SW-480 cellemorfologi med små øyer av epitelceller. Imidlertid celler etter FPKc og ES behandling i 48 timer viste betydelige morfologiske endringer: kondensert kromatin og fragmentert punctata blå kjerne fluorescens ble observert i en doseavhengig måte. Når den FPKc dosen var 240 ug /ml, den nukleær farging var tydeligvis og fasebilder viste at cellene forandret til unormal rund type, og antall celler ble redusert utpreget.
SW-480-celler ble behandlet i 48 h ble farget med Hoechst ble observert 33342. Morfologiske endringer under fluorescerende mikroskop.
DNA-fragmentering indusert av FPKc og ES
PI farging av flowcytometri ble brukt til å evaluere DNA-skader forårsaket av FPKc og ES. Som vist i figur 7A, FPKc ved 120 ug /ml utløste en 1,8 ganger økning i DNA-skade i SW-480-celler, og 240 ug /ml av FPKc førte til en konsentrasjonsavhengig økning av DNA-fragmentering av 7,2-fold, sammenlignet til ubehandlede celler (p 0,01). En tilsvarende økning på 4,2 ganger i rød fluorescens intensiteten til SW-480-celler ble også oppnådd med en inkubasjon med ES (24 ug /ml). Figur 7B viste 240 ug /ml FPKc indusert 18,26 ± 0,28% DNA skade på HEK-293 (ca. 1,6 ganger over kontrollen) som indikerte HEK-293 utført mye mindre DNA-skade (p 0,01) enn den til SW-480-celler (p .. 0,01) med samme dose av FPKc behandling
Begge Cellene ble behandlet med FPKc og ES for 12 (PI) og analysert ved flowcytometri
Cell syklus arrest indusert av FPKc og ES
for behandling av kreft, cellesyklus arrest har vært ansett som en av de viktigste målene. Som vi alle vet, kreft celler alltid holde uhemmet celledeling fordi deres genmutasjon som kontrollert celledeling [21]. For å evaluere effekten av FPKc behandling på fordelingen av celler i cellesyklus, gjennomførte vi DNA cellesyklusanalyse ved strømningscytometri. Figur 8 viser effekten av FPKc og ES på cellesyklusen fase (G1, S og G2 /M) fordeling av SW-480-celler. Etter FPKc behandling av 24 timer, akkumulering av SW-480 celler i G1 øket fra 39,27 ± 0,56% til 56,77 ± 0,5%; mens til ES behandling, akkumulering var opp til 65,22 ± 0,54%. Resultatene viste at FPKc og ES kunne indusere SW-480-celler cellesyklusarrest i G1 fase.
SW-480-celler ble høstet og fiksert i 70% alkohol og deretter farget med PI. Endelig er de fargede celler ble analysert ved hjelp av et strømningscytometer.
Apoptose effekt fremkalt ved FPKc og ES
Cell syklus-stans er nært knyttet til apoptose, og ødeleggelse av cellesyklusprogresjon kan eventuelt føre til apoptotisk /nekrotisk død [22]. For evaluering av apoptose indeksen som FPKc og ES kunne provosere, det Annexin V-FITC /PI dobbel farging ble brukt. Fra figur 9A, var det tydelig å se FPKc kan utløse SW-480-celler apoptose i en doseavhengig måte etter inkubering i 24 timer. Sen apoptose forholdet (øverst til høyre) øket fra 15,40 ± 0,53% til 31,82 ± 0,93% ledsaget av økning av FPKc konsentrasjon fra 120 til 240 ug /ml, mens kontrollgruppen bare var 6,42 ± 0,5%. Interessant, ES (24 mikrogram /ml) kan også fremkalle phosphatidylserine eksternalisering, forholdet mellom sent og tidlig fag apoptose var 28,90 ± 0,63% (øvre og nedre høyre).
Celler ble dobbelt-farget med Annexin V- FITC og PI, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Alle forsøk ble utført in triplo uavhengig pr eksperimentelt punkt, og representative resultater ble vist. Resultatene representerte gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p 0,01 indikerte statistisk signifikante forskjeller versus kontrollgruppen
Figur 9B viste apoptose ledet av FPKc på HEK-293 celler.. Etter inkubasjon med 240 ug /ml FPKc i 24 timer, apoptose frekvensen av de behandlede celler var 11,83 ± 3,2% og kontrollgruppen var 9,63 ± 3,7%, som vist var det ingen stor forskjell på de to gruppene.
Heri SW-620 celler ble også testet av AnnexinV /PI analyse, og figur 9C avslørte at FPKc kan indusere SW-620 celler apoptose spesielt tidlig apoptose. Etter 24 timers inkubering med FPKc, forholdet mellom tidlige apoptose-celler var fra 3,13 ± 0,40% til 12,23 ± 0,51% og 15,20 ± 0,40% som FPKc dosen økes fra 0 til 80 og 160 ug /ml.
ROS opphopning indusert av FPKc og ES på SW480 celler
Den intracellulære ROS produksjonen ble analysert ved flowcytometri med DCF farging. Dataene vist i figur 10A antydet de intracellulære ROS-nivåene ble øket etter FPKc og ES behandling. Ved 3 timer, omtrent 34,33 ± 0,45% 82,77 ± 1,05% og 50,33 ± 0,53% av celler i 120 og 240 ug /ml FPKc og 24 ug /ml ES behandlede grupper viste lyse DCF fluorescens, mens bare 5,40 ± 0,45% av cellene i kontrollgruppen viste lyse DCF fluorescens. Når inkubasjonstiden økt til 6 timer, ble prosentandelen av celler med lys DCF fluorescens ikke endres mye i FPKc behandlede celler, ES-behandlede celler økt til 71,10 ± 1,7%. Og Figur 10B viste etter FPKc behandling, HEK-293 viste liten ROS akkumulering sammenlignet med kontrollen.
SW-480 (A) og HEK-293 (B) celler ble behandlet med FPKc og ES, og ROS nivåene ble målt ved flow-cytometri etter farging med DCFH-DA. SW-480-celler ble forbehandlet med NAC (5 mM) i 1 time, deretter intracellulær ROS generasjon (C), DNA-skade (D), celle-levedyktighet (E) og apoptose (F) ble påvist.
for ytterligere å validere at ROS var involvert i FPKc indusert apoptose effekten av SW-480 celler, ble ROS åtseldyr-NAC forbehandlet med SW-480 celler. Som forventet, i nærvær av 5 mM antioksidant NAC, akkumulering av ROS redusert til 4,26 ganger i forhold til kontrollen, mens FPKc gruppe var 10,15 ganger i forhold til kontrollen (figur 10C).
Det er blitt rapportert at overdreven mengder av ROS kan forårsake oksidativ skade lipider, proteiner og DNA, som fører til tumorgenese eller celledød [23]. I denne studien målte vi DNA-skader etter samtidig behandling med NAC. Og resultatene viste at DNA-skade kan selvsagt reverseres ved NAC: DNA-skade indeksen var 38,85 ± 2,7% når cellene ble behandlet med 240 pg /ml FPKc i 24 timer, NAC ko-behandlingsgruppe var bare 8,20 ± 0,71%, mens kontrollen var bare 6,50 ± 0,5% (figur 10D). Resultatene viste at FPKc-indusert DNA-skader kan være assosiert med ROS opphopning
cytotoksisitet effekten av FPKc på SW-480 celler ble i stor grad reversert ved NAC (p 0,01, figur 10E).. De levedyktige celler var ca 85,73 ± 0,14% og 69,62 ± 0,21% av forbehandling med NAC, sammenlignet med om 55,42 ± 2,00% og 39,44 ± 0,64% ved behandling med 120 og 240 mikrogram /ml FPKc hhv.
Annexin V-FITC /PI dobbel farging analysen avslørte også at forbehandling med NAC kan delvis beskytte SW-480 celler fra FPKc indusert apoptose (figur 10F). Disse resultatene indikerer at oppbyggingen av intracellulær ROS deltatt i FPKc-indusert apoptose av SW480 celler.
Endringer i intracellulære glutation konsentrasjon forårsaket av FPKc
Som GSH uttømming har vært ansett som en av de viktigste faktor som forårsaker akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) [24] er konsentrasjonen av GSH i SW-480-celler ble evaluert etter FPKc og ES behandling (figur 11). Når cellene ble behandlet i 3 timer, redusert den intracellulære GSH-konsentrasjon til 70,38 ± 1,50% 29,23 ± 1,00% 50,14 ± 1,70% av kontroll med 120, 240 pg /ml FPKc og 24 ug /ml ES, respektivt. Og da inkubasjonstiden økt til 5 timer, gjorde GSH innhold i SW-480 celler ikke endre mye etter FPKc behandling; mens for de ES behandlede prøver, nedsatt cellulær GSH til 42.18 ± 1.00%, noe som var i samsvar med ROS generasjon.
Intracellulær GSH konsentrasjon av SW-480 celler etter FPKc og ES behandlinger ble målt ved 405 nm med mikro leseren.
Undersøkelse av nivåer av proteiner assosiert med cellesyklus og apoptose
den underliggende mekanismen for FPKc-indusert endring av protein uttrykk som er involvert i cellesyklus og apoptose i SW-480-celler ble ytterligere undersøkt ved Western blotting-analyse (Figur 12). Nivåene av Actin tjente som en intern kontroll. Det ble funnet at ekspresjonen av anti-apoptotiske protein Bcl-2 ble redusert når cellene ble behandlet med 240 pg /ml FPKc i 48 timer; og til ES (24 ug /ml) behandling av cellene, ble Bcl-2 nivå ble redusert når inkubert i 24 og 48 timer. I denne studien ble spaltet caspase-3 og spaltet PARP ble evaluert, og resultatene viste begge ble oppregulert etter inkubert med FPKc og ES i 24 timer og 48 timer.
