Abstract
koelreuteria henryi
Dummer, en endemisk plante av Taiwan, har blitt brukt som en folkemedisinen for behandling av hepatitt, enteritt, hoste, faryngitt, allergi, hypertensjon, hyperlipidemi og kreft. Austrobailignan-1, en naturlig lignan derivat isolert fra
koelreuteria henryi
Dummer, har anti-oksidative og anti-kreft egenskaper. Imidlertid har effekten av austrobailignan-en på humane kreftceller ikke undersøkt ennå. Her viste vi at austrobailignan-1 inhiberte cellevekst av humant ikke-småcellet lungecancer A549 og H1299 cellelinjer både dose- og tidsavhengig oppførsel, IC
50 verdi (48 h) i austrobailignan-1 var 41 og 22 nM, respektivt. Data fra flowcytometrisk analyse indikerte at behandling med austrobailignan-1 i 24 timer forsinkes cellesyklusen i G2 /M-fasen. Den molekylære tilfelle austrobailignan-1-mediert G2 /M fase arrest var assosiert med økning av p21
Waf1 /Cip1 og p27
Kip1 uttrykk, og reduksjon av Cdc25C uttrykk. Videre behandling med 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer resulterte i en markert frigjøring av cytokrom c, etterfulgt av aktivering av kaspase-2, -3, og -9, og følgelig indusert apoptose. Disse hendelsene ble ledsaget av økningen av PUMA og Bax, og reduksjon av Mcl-en og BCL-2. Videre vår studie viste også at austrobailignan-en var en topoisomerase en inhibitor, som dokumentert av en avslapping assay og induksjon av en DNA-skader respons signalveien, inkludert ATM, og Chk1, Chk2, γH2AX fosforylert aktivering. Totalt sett, våre resultater tyder på at austrobailignan-en er en roman DNA-ødeleggende middel og viser en topoisomerase I hemmende aktivitet, fører til DNA-trådbrudd, og dermed induserer DNA-skader respons system for cellesyklus G2 /M arrest og apoptose i en p53 uavhengig måte.
Citation: Wu CC, Huang KF, Yang TY, Li YL, Wen CL, Hsu SL, et al. (2015) topoisomerase 1 Inhibitor Austrobailignan-1 Isolert fra
koelreuteria henryi
induserer en G2 /M-fase Arrest og celledød Uavhengig av p53 i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 10 (7): e0132052. doi: 10,1371 /journal.pone.0132052
Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, UNITED STATES
mottatt: 9. januar 2015. Godkjent: 09.06.2015; Publisert: 06.07.2015
Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra Taichung Veterans General Hospital (TCVGH1033209C) til Tsung-Ying Yang, MD, PhD, samt fra Taichung Veterans General Hospital (TCVGH -1027305D), og TCVGH-1027319D Dr. Shih-Lan Hsu
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende dødsårsaken for både menn og kvinner i mange land, inkludert Taiwan, som viste den høyeste økningen i lungekreft dødelighet i en fersk tiår [1, 2]. De fem års overlevelse av lungekreftpasienter utover stadium II er bare 13-25% [3]. Lungekrefttilfellene er histologisk klassifisert i to hovedtyper: småcellet lungekreft (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Den NSCLC, står for 85% av forekomsten av lungekreft, og kan videre deles inn i tre grupper: adenokarsinom, platecelle-karsinom og storcellet karsinom. Kliniske strategier for behandling av lungekreftpasienter inkluderer kirurgi, cellegift, strålebehandling og målrettet terapi. Selv om lovende behandling har dukket opp for behandling av lungekreftpasienter i det siste tiåret, en stor del av pasientene fortsatt uherdet [4]. Derfor, for å søke etter nye stoffer med større effekt og sikkerhet er et presserende behov for lungekreftpasienter.
Apoptose er en tett regulert prosess kontrollert av enten extrinsic (Død reseptoren) og /eller iboende (mitokondrie) trasé [5 ]. De Bcl-2 familien proteiner har en sentral rolle i å kontrollere mitokondrie apoptotiske sti. Bcl-2 og Mcl-1 er anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien og deres forhøyet ekspresjon finnes i mange typer av tumorceller [6]. Bax og Bak tilhører pro-apoptotiske medlemmer av BCL-2-familien, fører deres aktivisering til oligomerisering forårsaker dannelsen av porer som igjen resulterer i en økning av mitokondriell ytre membran permeabilitet og slippe cytokrom c for å aktivere caspase kaskade. BCL-2 og Mcl-en kan direkte binde med Bax og hindre apoptotisk aktivering av Bax [7]. PUMA er en generell sensor av apoptotiske stimuli og et lovende legemiddel mål for cancerterapi [8, 9], som induserer apoptose ved å aktivere pro-apoptotiske protein Bax gjennom dets interaksjon med anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer, inkludert Bcl-2- og Mcl-en. Interaksjonene Puma med anti-apoptotiske proteiner føre til forskyvning av Bax, noe som resulterer i aktivering av pro-apoptotiske aktivitet av Bax [10]. Samler bevis peker på at induksjon av apoptose ved å målrette Bcl-2 familien proteiner er ansett som et potensielt lovende terapeutisk tilnærming i kreft hos mennesker [7].
Samler bevis tyder på at naturmidler har anti-kreft egenskaper og vise evne for å hemme vekst eller indusere apoptose av forskjellige typer av tumorceller. De aktive komponentene i urte medisiner som er ansvarlig for den anti-kreft effekt og deres underliggende mekanismene er imidlertid fortsatt i stor grad uklart. Identifiseringen og karakteriseringen av disse komponentene, og dermed kan bidra til å akselerere utviklingen av potensielle anti-kreft medikamenter.
koelreuteria henryi
Dummer (
K
.
henryi
), en endemisk plante i Taiwan, har vært brukt som en folkemedisinen for behandling av tarmbetennelse, hepatitt, allergi, hypertensjon, faryngitt, hoste, hyperlipidemi, og kreft i Taiwan [11-13]. Lignan, en phytoestrogen derivat forbindelse som eksisterer i vidt urter, utviser forskjellige fysiologiske effekter, inkludert forbedring av lever og kardiovaskulær funksjon og forebygging av osteoporose og kreft [14]. Lignans har også blitt funnet å være potente inhibitorer av human DNA topoisomerase-I og II [15-17]. Austrobailignan-1, en naturlig lignin, isolert fra blad av
K
.
henryi
, har anti-proliferative effekter på forskjellige typer av tumorceller [13, 18, 19]; effekter og de underliggende mekanismer for austrobailignan-1 i kreftceller, men er fortsatt ukjent. I denne studien isolert vi austrobailignan-en fra bladet av
K
.
henryi
, og undersøkt DNA topoisomerase jeg hemmende effekt in vitro og cytotoksiske effekter av austrobailignan-1 i humane ikke-småcellet lungekreft celler. Vi fant at austrobailignan-1 inhiberte topoisomerase 1-aktivitet og DNA-skade forårsaket reaksjon signalering, og følgelig forsinkes cellesyklusen i G2 /M fase og utløste apoptotisk celledød i både lunge adenokarsinom A549 og H1299 cellelinjer. Dessuten viste vi også at flere molekyler knyttet til cellesyklus og apoptose ble modulert av austrobailignan-en.
Materialer og metoder
Kjemi og reagenser
4 «, 6»-diamindino-2-fenylindol (DAPI), propidiumjodid (PI), ribonuklease (RNase), dimetylsulfoksyd (DMSO), og Triton X-100 ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO. USA ). Føtalt bovint serum og RPMI1640 medium ble anskaffet fra GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, USA). Antistoffene mot p21
Waf1 /Cip1 (sc-397), p27
Kip1 (sc-667), p53 (sc-126), Cdc25c (sc-327), Cdk1 (sc-53219), cyclin A1 (sc-751), cyclin B1 (sc-245), BCL-2 (sc-509), cytokrom c (sc-13156) og β-aktin (sc-47778) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA , USA). COX IV (4844), Mcl-1 (4572), Bax (2772), Bak (3814), PUMA (12450), fosfor-ATM (4526), fosfor-H2AX (9718), fosfor-Chk1 (2341), fosfor -Chk2 (2661) og fosfor-p53 (9284) antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) som beskrevet i forrige rapport [20]. Den inhibitor av kaspase-2 (Z-VDDADFMK, # FMK003) ble innkjøpt fra R 0,05, ** p 0,01, *** p . 0,001
Resultater
Austrobailignan-en indusert cellesyklus G2 /M fase arrestasjon og celledød i både A549 og H1299 celler
tap av normal funksjon av p53 hadde vært å finne i over halvparten av alle humane tumorer [29]. Litteraturen viser at p53 er en av de viktigste regulatorer i å mediere vekststans og apoptose indusert ved hjelp av forskjellige indre eller ytre påkjenninger, herunder kjemoterapeutiske midler [30]. Dessuten er p53 også en viktig kontakt og switcher mellom cellesyklus arrest og apoptotiske prosessen. Når skadene ikke kan repareres, aktiverer p53 transkripsjon av ulike pro-apoptotiske gener, inkludert Bax, Noxa, PUMA, Fas, og DR5 [31, 32] for å utføre den apoptotiske prosessen. Alternativt utløser p53 apoptose ved undertrykkelse av anti-apoptotiske gener, slik som Bcl-2, og dermed indusere frigjøring av cytokrom c, etterfulgt av caspase-3 og -9 aktivering [31]. Det er godt dokumentert at statusen til p53 kan påvirke responsen av kreftceller til noen kjemoterapeutiske medikamenter [33]. Vi først undersøkte antiproliferative effekter av austrobailignan-en renset fra bladene av
K
.
henryi
(Fig 1 og [12]) i human NSCLC A549 (+ p53, som høste en vill-type p53) og H1299 (-p53, som er p53-null) cellelinjer. Som vist i figur 2A, behandling med austrobailignan-en i betydelig grad hemmet veksten av A549 og H1299-celler i både treringstrinnet og tidsavhengige oppførsel med IC
50 verdier på 41 og 22 nM etter 48-timers administrering, henholdsvis. Resultatene viste også at behandling av lungekreftceller med lave konsentrasjoner (mindre enn 10 nM) av austrobailignan-1 forårsaket en cytostatisk virkning, bare hemmet celleproliferasjon, men ingen cytotoksisk effekt observeres etter mikroskopisk undersøkelse. Imidlertid behandling med høy konsentrasjon (30 og 100 nM) av austrobailignan-1 oppviste morfologiske trekk av apoptotisk celledød, flytende og ble observert blebbing-celler (data ikke vist). For å møte den nøyaktige virkning er ansvarlig for austrobailignan-1-mediert antiproliferativ effekt, ble cellesyklusfordelingen profil undersøkt. Som antydet i figur 2B, eksponering av A549 og H1299 celler til 30 og 100 nM av austrobailignan-1 i 24 timer førte til en akkumulering av celler i G2 /M fase sammenlignet med kontrollceller, kombinert med en samtidig reduksjon i andelen celler i G1 og S-faser. I tillegg er en hypodiploid DNA-innhold topp (sub-G1 populasjon), som er en indikasjon på dårligere DNA og et kjennetegn på apoptose, ble observert etter 24 timer høydose behandling og økt kontinuerlig etter 48-h austrobailignan-1 inkubering (Fig 2B ). For ytterligere å bekrefte at induksjon av apoptose ved austrobailignan-1 i A549-celler, ble det TUNEL-analysen og DAPI farging utført. Som indikert i figur 2C, behandling med 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer signifikant induserte den apoptotiske celledød med kondenserte kjerner og økning av TUNEL-positive celler (grønn fluorescerende fargede celler), noe som tyder på at DNA-fragmentering ble forekommer i disse cellene.
(A) A549 og H1299-celler ble behandlet med forskjellige doser (0, 1, 3, 10, 30 og 100 nM) av austrobailignan-en i 24 og 48 timer. Celletallet ble målt med en Trypan-blått fargestoff eksklusjon metoden. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. fra 3 uavhengige eksperimenter. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 versus kontroll). (B) Celler ble behandlet med ulike doser (0, 3, 10, 30 og 100 nM) av austrobailignan-en i 24 og 48 timer, og deretter farget med propidiumjodid, og flow-cytometri ble utført for å undersøke cellesyklusfordelingen. (C) Cellene ble behandlet uten eller med 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer, ble en TUNEL assay så utført for å påvise apoptotiske celler (grønne) og nukleært DNA ble farvet med DAPI (blå). De fargede celler ble undersøkt ved fluorescens mikroskopi. Forstørrelse x 400; skala bar, 50 mikrometer.
Austrobailignan-1 hemmet topoisomerase en aktivitet og indusert DNA skade signalveien
Lignan familie forbindelser har blitt funnet å være potente hemmere av humant DNA topoisomerase 1 [16, 17]. Deretter anvendte vi en kommersiell DNA avkobling analysesett for in vitro måling av topoisomerase 1-aktivitet i nærvær av austrobailignan-1. Dette settet er majorly å analysere muligheten for topoisomerase-en til å slappe av en supercoil DNA. Figur 3A viser at austrobailignan-1 inhiberte DNA avslapping aktiviteten av topoisomerase en doseavhengig. Kamptotecin, en kjent Topoisomerase en inhibitor, ble anvendt som positiv kontroll. Ved 100 nM, austrobailignan-1 oppviste ekvipotent inhibitorisk aktivitet til camptothecin (100 uM), som indikerer at austrobailignan-1 kan være mer effektiv enn camptothecin.
(A) Inhibering av DNA topoisomerase 1-aktivitet. Phot-1-DNA-plasmid ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av austrobailignan-1 (0, 10, 30 og 100 nM) og topoisomerase 1 ved 37 ° C i 30 minutter. Reaksjonsproduktene ble separert på 1% agarosegel og farget med etidiumbromid. Fluorescens bildet ble tatt opp av mikrofotografering. Camptothecin (CPT) ble anvendt som en positiv kontroll. S. C. DNA: super kveilet DNA, slappe av DNA: stresse lukket sirkulært DNA. (B) DNA-skade respons. A549 og H1299 cellene ble behandlet uten eller med 30, 100 nM austrobailignan-1 i 24 timer, og DNA-skade på per celle basis ble undersøkt av en komet assay. Representative komet bilder fra cellene eksponert for austrobailignan-en ved forskjellige konsentrasjoner vises (øvre panel). Graden av DNA-skade ble scoret av hale øyeblikk (% DNA i halen x hale lengde) fra minst 100 celler i hver behandlingsgruppe (nedre panel). Dataene er gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. **
p
0.01, ***
p
0,001. (C) Aktivering av ATM-signalreaksjonsveien ved austrobailignan-1. A549 og H1299-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av austrobailignan-1 i 24 timer, de uttrykte nivået av fosforylert ATM, Chk1, Chk2, H2AX, og p53 proteiner ble undersøkt ved Western blot-analyse. β-actin ble brukt som en intern lasting kontroll
Litteratur viser at topoisomerase en inhibitor kan indusere dobbel tråd pauser (DSB sin) og deretter føre til DNA-skader respons [34, 35].; Derfor ble en komet analyse utført for å undersøke om austrobailignan-en forårsaket DNA-skade i A549 og H1299 celler. Som vist i figur 3B, austrobailignan-en økte komet halebevegelse i begge testede celler i en konsentrasjonsavhengig måte. ATM er en velkjent DNA skade sensor og regulator. Etter eksponering for DNA-skade belastninger som oksidativt stress eller inhibitorer av topoisomerase 1 og 2, er ATM /ATR-kinaser aktiveres ved fosforylert ved ser1981 [36], som i sin tur fosforylerer tallrike nedstrøms substrater, inkludert Chk1-ser345, Chk2-thr68, γH2AX -ser139, og p53-ser15, etc., og til slutt fører til cellesyklus og apoptose [37, 38]. Deretter ble de potensielle effektene av austrobailignan-en på ATM signalveien undersøkt. Data fra Western blot analyse viste klart en konsentrasjonsavhengig fosforylering av ATM-ser1981, Chk1-ser345, Chk2-thr68, γH2AX-ser139 og p53-ser15 i austrobailignan-en-behandlede celler (figur 3C). Men nivåene av total ATM, Chk1, og Chk2 forble uendret i respons til austrobailignan-en eksponering (data ikke vist).
Austrobailignan-1 regulert cellesyklusen relaterte proteiner
Vi har vist at p53 kan bli fosforylert av ATM /ATR-kinaser i nærvær av austrabailignan-1 i A549-celler. Den aktive p53 kan transcriptionally øke uttrykket nivåer av p21
Waf1 /Cip1, p27
Kip 1 [39], som begge er breakers av cellesyklusprogresjon. Dessuten Cdc25 dual spesifisitet fosfatase familie (Cdc25A, Cdc25B og Cdc25C) er en annen vanlig signal svinger nedstrøms substrat av ATR /ATR /CHKS. Fosforylert inaktivering av Cdc25C mediert av ATM /ATR /CHKS spiller en sentral rolle i G2 /M fase arrest og senere apoptose indusert av flere antitumormidler [40-43]. For å møte den påfølgende molekylære tilfelle av austrobailignan-1-mediert cellesyklus retardasjon, uttrykket nivåer av G2 /M-relaterte molekyler som p53, p27
Kip 1, p21
waf1 /Cip1, Cdk1, Cdk2, cyklin A, cyklin B1 og Cdc25C ble undersøkt etter forskjellige doser av austrobailignan-1 (0, 10, 30 og 100 nM) behandling av A549-celler i 24 timer. Som forventet, uttrykk for p53, p21
Waf1 /Cip1, p27
Kip1 og cyclin B1 ble økt mens cyclin A og Cdc25C ble redusert (figur 4A) i austrobailignan-en-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. Nivåene av Cdk1 og Cdk2 ble ikke påvirket av austrobailignan-en. Begrenset av det sammensatte tilgjengelighet, ble bare p21
Waf1 /Cip1, p27
Kip 1 og Cdc25C nivåer undersøkt i p53-null H1299 cellelinje. Tilsvarende oppregulering av p21
Waf1 /Cip1 og p27
KIP 1 og nedregulering av Cdc25C ble observert i austrobailignan-1-behandlede H1299 celler (figur 4B). Disse resultatene indikerte at austrobailignan-1-medierte cellulære og molekylære hendelser i de testede cellelinjene var p53 uavhengig av hverandre.
(A) A549-celler ble behandlet med 0, 3, 10, 30 og 100 nM av austrobailignan-1 til 24. etter behandling, ble celleekstrakt samlet og analysert ved hjelp av Western blot. (B) H1299-celler ble behandlet med 0, 10, 30, 100 nM austrobailignan-1 i 24 timer, nivåene av p21Waf1 /Cip1, p27Kip1, og Cdc25C ble påvist ved Western blot. β-Actin ble brukt som en lasting kontroll.
Austrobailignan-en indusert iboende mitokondriene-mediert apoptose
Fordi caspaseaktivering spiller en sentral rolle under utføringsfasen av apoptose [44] , for å undersøke hvorvidt austrobailignan-1-indusert apoptose ved aktivering av kaspase vei, aktiviteten av caspaser-2, -3, -8, -9 og -12 ble beregnet ved hjelp av en caspase fluorogent peptidsubstrat kit. Som vist i figur 5A og 5B, behandling av A549 og H1299-celler med 100 nM austrobailignan-1 resulterte i aktivering av mitokondriene relaterte caspase-2, -9, og -3, men ikke død reseptor-relaterte caspase-8 og endoplasmatiske retikulum-assosiert caspase-12. For å karakterisere rolle caspaseaktivering i austrobailignan-1-indusert apoptose, A549 og H1299-celler ble forbehandlet med inhibitorer av kaspase-2 (Z-VDDADFMK), caspase-3 (Z-DEVD-FMK), og caspase-9 (Z -LEHD-FMK) i 1 time, og deretter behandlet med 100 nM austrobailignan-1 for en annen 48 timer. De inhibitorer av kaspase-2, -3, og -9 signifikant beskyttet A549 og H1299 cellene mot austrobailignan-1-mediert celledød (figur 5C). Disse resultatene antydet at de aktiverte kaspasene kan bidra til austrobailignan-1-utløst apoptose i disse celler.
(A), A549-celler ble behandlet med 100 nM av austrobailignan-1 for angitte tidsperioder (0, 12, 24 og 48 h). (B) H1299-celler ble utsatt for austrobailignan-1 i 48 timer. Cellelysatene ble høstet, og caspase aktiviteter ble bestemt ved bruk fluorogen underlag. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 versus bærer-behandlede kontroll). (C) kaspaseinhibitorer blokkere austrobailignan-1-indusert celledød. A549 og H1299-celler ble forbehandlet med 50 uM indikert kaspaseinhibitorer i 1 time, og deretter behandlet med 100 nM austrobailignan-1 for en annen 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av en Trypan blått fargestoff utelukkelse metode. (D) Regulering av Bcl-2 familien proteiner. A549 og H1299-celler ble behandlet med 0, 30, 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer. Nivåene av angitte Bcl-2 familien proteiner ble undersøkt med Western blot. (E) Offentliggjøring av cytokrom
c
fra mitokondriene til cytosol. A549 og H1299 cellene ble behandlet uten eller med 100 nM austrobailignan-en i 24 og 48 timer. Etter behandling, partikkelformet og cytosoliske fraksjoner ble isolert, nivået av cytokrom
c
protein ble analysert ved hjelp av Western blot. α-tubulin og cytokromoksydase IV ble anvendt som kontroll lasting.
På basis av de ovenfor angitte resultater, aktivering av kaspase-2, -3, og -9 som er involvert i austrobailignan-1-indusert apoptose Dette indikerer at den mitokondrielle apoptotiske reaksjonsvei ble aktivert. Det er kjent at Bcl-2-familieproteiner er involvert i iboende mitokondriene-mediert apoptose [45]. For å få ytterligere innsikt i de molekylære hendelser som er involvert i austrobailignan-1-indusert apoptose, ble de uttrykte nivåer av BCL-2, Mcl-en, Bax, Bak, og PUMA undersøkt. Uttrykket av pro-apoptotiske molekyler Bax, Bak, og PUMA ble drastisk økt, mens nivåene av anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Mcl-en ble redusert etter austrobailignan-en behandling (figur 5D). Cytokrom c spiller en nøkkelrolle i Bcl-2 familien protein-mediert apoptotisk død. Den ligger vanligvis i mitokondriene men translocates inn i cytosol, kjøring caspaseaktivering ved starten av apoptotiske påkjenninger. Således ble den cellulære fordelingen av cytokrom c undersøkt. Som vist i figur 5E, administrering av austrobailignan-1 resulterte i frigjøring mitokondriell cytokrom c til cytosol. Disse resultater antyder at austrobailignan-1-indusert apoptose var hovedsakelig via den indre mitokondrie-utløste reaksjonsveien.
p53 ble ikke nødvendigvis er påkrevd for austrobailignan-1-indusert cellesyklus G2 /M rest og celledød
Våre resultater har vist at autrobailignan-1-indusert celledød i både A549 og H1299 cellelinjer (figur 2A og 2B). Fosforylering av p53 på ser
15 språk representerer vanligvis apoptotisk aktivering [46]. Figurene 4A og 5E viste at austrobailignan-1-behandlingen økte nivåene av total p53 og p53-fosforylert ser15 i A549-celler, noe som tyder på en rolle av p53 i austrobailigan-1-indusert celledød. For å karakterisere hvorvidt p53 faktisk spiller en rolle i austrobailignan-1-mediert cellesyklus og apoptose, vi neste undersøkt effekten av austrobailignan-1 i p53-knockdown A549 (A549-p53-shRNA) celler, som var stabilt transfektert med en p53 -spesifikk shRNA [47]. Det var ingen signifikant forskjell mellom A549-vektor kontrollceller (A549 (-shRNA) og A549-p53-shRNA celler i cellesyklus arrest (Fig 6A) og i celle levedyktighet etter 48 h austrobailignan-en behandling (fig 6B). Vi er derfor konkluderer med at austrobailignan-1-mediert G2 /M rest og celledød krever ikke nødvendigvis p53.
(A) A549-A549 eller shRNA-p53shRNA-celler ble behandlet med austrobailignan-1 (0, 10, 30 og 100 nM) i 48 timer. Den cellesyklusfordelingen ble bestemt ved flow cyotmetry. (B) A549-shRNA og A549-p53shRNA-celler ble behandlet uten eller med 100 nM austrobailignan-1 i 48 timer. nivåene av p53-protein var oppdaget av Western blot (øvre panel). cellen levedyktighet ble bestemt av en trypanblått eksklusjon metoden (nedre panel).
Diskusjoner
i denne studien gir vi bevisene som viser at austrobailignan-en, en lignan familie sammensatt isolert fra
koelreuteria henryi
Dummer, hemmet topoisomerase-en aktivitet, og deretter utløste en DNA-skader signalveien, dermed ført til celle-syklus og apoptose i menneskelig ikke- kreft A549 småcellet og H1299 celler. Den økende nivåer av p21
Waf1 /Cip1 og p27
Kip1, og redusere Cdc25C nivå, indikerte at disse molekylene var aktivt involvert i respons til austrobailignan-1-indusert G2 /M arrest. Videre mitokondrie apoptose-relaterte molekyler, slik som Bcl-2-familieproteiner, cytokrom c, caspase-2, 3 og 9, har bidratt til austrobailignan-1-utløste apoptotisk celledød.
DNA topoisomerase 1 regulerer den topologiske tilstanden DNA i mange cellulære prosesser, inkludert DNA-replikasjon og transkripsjon [48, 49]. Forbindelser som hemmer topoisomerase en aktivitet har blitt mye brukt som kreftmedisiner fordi blokkerer topoisomerase en aktivitet kan føre til skade på DNA og initiere DNA sjekkpunkter som utløser cellesyklus arrest og senere indusere celledød [34, 50].
