Abstract
sulindak er en FDA-godkjente ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler med dokumentert kreft aktiviteter. Våre nyere studier viste at sulindak selektivt forsterket drap av kreftceller eksponert for oksidasjonsmidler via produksjon av reaktive oksygenforbindelser (ROS) som resulterer i mitokondriell dysfunksjon. Denne effekten av sulindak og oksidativt stress på kreftceller kan være relatert til defekt i respirasjonen hos kreftceller, først beskrevet av Warburg for 50 år siden, kjent som Warburg virkning. Vi postulerer at sulindac kan øke selektiv dreping av kreftceller når den kombineres med en hvilken som helst forbindelse som endrer mitokondriell respirasjon. For å teste denne hypotesen vi har brukt dikloracetat (DCA), som er kjent for å forskyve pyruvat metabolisme bort fra melkesyre formasjon til åndedrett. Man kunne forvente at DCA, siden det stimulerer aerob metabolisme, kunne reke mitokondriell respirasjon i kreftceller, noe som vil resultere i økt dreping i nærvær av sulindac. I denne studien, har vi vist at en kombinasjon av sulindac og DCA forbedrer selektiv dreping av A549 og SCC25 kreftceller under de benyttede betingelser. Som spådd, mekanismen for drapet innebærer ROS produksjon, mitokondriell dysfunksjon, JNK signalering og død ved apoptose. Våre resultater tyder på at sulindak-DCA legemiddelkombinasjonen kan gi en effektiv kreftbehandling
Citation. Ayyanathan K, Kesaraju S, Dawson-Scully K, Weissbach H (2012) Kombinasjon av sulindak og dichloroacetate dreper kreftceller via oksidativ skade. PLoS ONE syv (7): e39949. doi: 10,1371 /journal.pone.0039949
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 12 august 2011; Godkjent: 04.06.2012; Publisert: 17.07.2012
Copyright: © 2012 Ayyanathan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding hjelp fra National Institutes of Health i KA (tilskudd 5K01CA95620) og HW (tilskudd R15 CA122001) og fra delstaten Florida til HW (SURECAG tilskudd R94007) til å utføre dette arbeidet er takknemlig erkjent. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
sulindac er et FDA-godkjent ikke-steroide anti-inflammatorisk legemiddel (NSAID), som også har vist seg å ha anti-kreft-aktivitet [1] – [6]. Nyere studier fra vårt laboratorium har vist at RKO, A549 og SCC25 cancercellelinjer viste følsomhet overfor en kombinasjon av sulindac og et oksydasjonsmiddel, så som TBHP eller H
2o
2 [7]. Dataene indikerte at sulindac effekten ikke var relatert til dets NSAID aktivitet, men som sulindac gjort kreftceller mer følsomme for oksidativt stress som resulterer i mitokondriell dysfunksjon og tap av levedyktighet. I motsetning til dette har normale celler ikke vise forbedret dreping under lignende betingelser [7]. I de siste 10 årene har det vært spredte rapporter om økt kreft drapet bruker sulindak i kombinasjon med en rekke forbindelser inkludert arsenikk, bortezomib, Difluoromethylornithine (DFMO) og suberoylanilide hydroxaminsyren (Saha) [8] – [14]. Selv om disse forbindelser har forskjellige virkningsseter, kan en felles mekanisme for sulindac /medikamentkombinasjonen forbedres dreping involvere oksidativ skade, slik det ble klart vist i våre tidligere studier ved bruk av sulindak og et oksidasjonsmiddel [7], [15]. Faktisk har ROS vært innblandet i studier med sulindak i kombinasjon med arsenikk, bortezomib og Saha [10], [12], [14].
Våre tidligere resultater antydet at den forbedrede drap av kreftceller ved en kombinasjon av sulindac og et oksydasjonsmiddel kan skyldes en defekt i åndedrett i kreftceller, som først beskrevet av Warburg mer enn 50 år siden, [16], som bemerket at kreftceller favorisere glykolyse, ikke åndedrett, for å oppnå energi, i motsetning til normale celler. Enkelte kreftceller erholdt så mye som 50% av sin energi fra glykolyse, mens glykolyse i normale celler utgjør mindre enn 5% av energibehovet [16]. For å få ytterligere bevis for mulige rollene endret respirasjon og ROS i drap av kreftceller ved sulindak og oksidativt stress, vi satt i gang studier med natrium dikloreddiksyre (DCA). DCA er en ideell kandidat som det er kjent for å hemme en kinase som ned regulerer aktiviteten av pyruvat dehydrogenase, noe som resulterer i en forskyvning av pyruvat metabolisme bort fra melkesyre formasjon, mot respirasjon [17], [18]. DCA har vært brukt klinisk for å behandle pasienter med laktisk acidose [19], og på grunnlag av dets biokjemiske egenskaper DCA har også blitt testet som et anticancermiddel. Bonnet et al. 2007 har vist at DCA reverserer Warburg effekten i kreftceller ved å omdirigere kreft celle metabolisme fra glykolyse til oksidativ fosforylering. I disse tidligere studier ble det vist at DCA øker nivået av ROS fra komplekset I. Dette i sin tur utløser «remodeling» av mitokondriell metabolismen (reduserer ΔΨm, åpnes mitokondriell overgang pore) i kreftceller å skyve dem mot apoptose. Videre har flere nyere studier bekreftet at DCA kan øke ROS-nivåer i kreftceller og depolarisere mitokondriene membran i lunge, endometrial, og glioblastom cellelinjer som fører til apoptose både
in vitro Hotell og
in vivo
[18], [20] – [22]. Av interesse var den observasjon at de vilkår som er brukt DCA synes ikke å påvirke mitokondrie metabolisme eller levedyktighet i normale celler [18], [23].
Basert på våre tidligere observasjoner på kreftdrepende effekt av sulindak og et oksydasjonsmiddel som påvirkes mitokondrie metabolismen [7], postulerte vi at kombinasjonen av sulindak og DCA kunne synergistisk å forbedre kreft dreping og ha viktig terapeutisk verdi. I foreliggende studie har vi undersøkt effekten av å bruke sulindac i kombinasjon med DCA på levedyktigheten til A549 og SCC25 kreftcellelinjer. Vi har også undersøkt hvilken rolle mitokondrienes funksjon og apoptose i kreft drapet observert med dette stoffet kombinasjon.
Materialer og metoder
Material
sulindak, N-acetylcystein og Tiron ble kjøpt fra Sigma (St.Louis, MO). DCA natriumsaltet ble hentet fra Acros Organics (Geel, Belgia). H2DCFDA og JC-en ble kjøpt fra Molecular Probes (Eugene, OR). MTS assayreagens og deadend Tunel Kit ble oppnådd fra Promega (Madison, WI). Cytosol /mitokondrier fraksjone kit og CBA077 InnoCyte ™ Flowcytometriske Cytokrom
c
Slipp kit var fra Calbiochem, Gibbstown, NJ. All cellekultur media, fetal bovine serum, og andre kosttilskudd som penicillin /streptomycin, glutamin, etc. ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).
A549 og SCC25 kreftceller, normale lungeceller og humane epidermale keratinocytter ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av DCA i nærvær eller fravær av sulindac (Sul) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble overvåket ved MTS-analyse som nevnt i fremgangsmåtene. Den cellelevedyktighet er uttrykt som% av kontroll (celler ikke behandlet med sulindac). Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet (SEM), uttrykt som% av den midlere verdi av quadruplicates fra et representativt eksperiment. Celle viabilities er illustrert for A549 kreftceller (A), SCC25 kreftceller (B), normale lungeceller (C) og normale humane epidermale keratinocytter (D). ♦, -Sul; ▪, + Sul. * P 0,05, ** p 0,005, *** p. 0,0005
Cell Culture
En ikke småcellet lungekreft cellelinje (NSCLC), A549, den normal human cellelinje lunge, MRC-5, og en not-avledet squamous cell carcinoma linje, SCC25 ble anskaffet fra ATCC (Rockville, MD) og holdt i F12-K-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fuktet, 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C. Normale humane epidermale keratinocytter ble oppnådd fra Promocell GmbH (Heidelberg, Tyskland) og holdt i den anbefalte kulturmediet. Tidlig passasje, ikke-immortaliserte normale celler ble anvendt for eksperimentene.
A549 og SCC25 kreftceller ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av DCA i nærvær eller fravær av sulindac sulfon (SulS) i 48 timer. SulS ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 250 pM for A549 kreftceller og 75 uM for SCC25 kreftceller. Cellelevedyktigheten ble overvåket ved MTS-analyse som beskrevet i Metoder. Den cellelevedyktighet er uttrykt som% av kontroll (celler ikke behandlet med sulindak sulfon). Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet (SEM), uttrykt som% av den midlere verdi av tre paralleller fra et representativt eksperiment. Celle viabilities er illustrert for A549 kreftceller (A) og SCC25 kreftceller (B). ♦, -SulS; ▪, + SulS. * P 0,05, ** p 0,005, *** p. 0,0005
celleviabilitet analysen
A549 kreft og lunge normale celler ble sådd på 3 × 10
3-celler per brønn mens SCC25 kreftceller og normale keratinocytter ble sådd ut på 7,5 x 10
3-celler per brønn i en 96-brønns plate. Cellene ble dyrket i 18-20 timer ble mediet kassert i aseptiske forhold, og erstattet med friskt kulturmedium inneholdende de angitte medikamentkombinasjoner. Hvor indikert 500 pM sulindac ble anvendt med A549 kreft og lunge normale celler og 100 uM sulindac ble anvendt sammen med SCC25 kreft og normale keratinocytt-celler. Platene ble inkubert i 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Dyrkningsmediet ble fjernet og cellene ble grundig skylt i 1 x PBS. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved hjelp av CellTiter 96 Aqueous One celleproliferasjonsanalyse (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. Analysen benytter en tetrazolium-forbindelse som omdannes til et vannoppløselig formazan ved innvirkning av cellulære dehydrogenaser stede i metabolsk aktive celler [24]. Den formazan ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 490 nm ved anvendelse av en kolorimetrisk mikrotiterplateleser (SpectraMax Plus; Molecular Devices). Bakgrunn absorbans ble trukket fra hver prøve.
Intracellulær Måling av ROS
A549 og SCC25 kreftcellelinjer ble belagt som ovenfor. Etter den 48 timers behandling, ble cellene inkubert med 50 pM av dichlorodihydrofluorescein diacetat (H
2DCFDA, Molecular Probes) i indikatorfritt medium i 30 minutter ved 37 ° C. Celler ble skylt med PBS og ROS-nivåene ble visualisert ved fluorescens mikroskopi. Bildene ble tatt ved hjelp av Qcapture programvare og behandlet i Adobe photoshop. Bildeanalyse ble utført ved hjelp av slidebook programvare. Data oppnådd fra et representativt eksperiment ble anvendt for kvantifisering av DCF-positive celler som målt ved hjelp av den grønne fluorescens på grunn av oksidert DCF.
toppfelter (A) illustrerer resultatene for A549 kreftceller, mens bunnfeltene ( B) viser resultatene for SCC25 kreftceller. Cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av narkotika og behandlet for fluoriserende mikroskopi som beskrevet i Metoder. Omfanget av intracellulære ROS-nivåer er illustrert som intensiteten til grønn fluorescens observert i celler behandlet med ingen medikamenter (underfeltene A1 og B1), sulindac alene (underfeltene A2 og B2), DCA alene (underfeltene A3 og B3) og sulindak og DCA kombinasjonsbehandling (sub-paneler A4 og B4). Flere uavhengige felt ble photomicrographed og representative felt for hver tilstand vises.
JC-1 Farging å overvåke mitokondriemembranen potensial
Mitokondriell membranpotensialet ble bestemt ved bruk av JC-1 fargestoff ( molekylære prober). De A549 og SCC25 cancercellelinjer ble platet som ovenfor. Etter den 48 timers behandling, ble cellene inkubert med 5 ng /ml JC-1 fargestoffet i indikatoren fritt medium i 30 minutter ved 37 ° C. Celler ble skylt med PBS og visualisert ved fluorescens mikroskopi. Normale mitokondrier aktivt å ta opp JC-1 fargestoff i en potensiell avhengig måte og danner J-aggregater, noe som gir en rød fluorescens. Avbrudd og påfølgende tap av mitokondriemembran potensielle fører til økt grønn fluorescens i cytosol på grunn av monomert JC-1, som bestemmes ved å følge utseendet av grønn fluorescens ved hjelp av et FITC-filter (Zeiss Axiovert invertert mikroskop-40 CFL). Bilde fangst, foredling og analyse ble utført som ovenfor. Data oppnådd fra et representativt eksperiment ble anvendt for kvantifisering av JC-1-grønn-positive celler.
toppfelter (A) illustrerer resultatene for A549 kreftceller, mens bunnplatene (B) viser resultatene for SCC25 kreftceller. Mitokondriemembranpotensialet tap ble detektert ved en forandring i JC-1-fordeling som resulterer i en økning av grønn fluorescens (se Metoder). De eksperimentelle betingelser for JC-1 farging og fluorescens mikroskopi er forklart i detalj i henhold til metoder og behandlingsregimer er vist nedenfor panelene. Ubehandlede celler (underfeltene A1 og B1), celler behandlet med sulindak (underfeltene A2 og B2), celler som ble behandlet med DCA (underfeltene A3 og B3), og celler behandlet med sulindak og DCA (underfeltene A4 og B4). Flere uavhengige felt ble photomicrographed og representative felt for hver tilstand vises.
Effekt av ROS Scavengers på celleviabilitet i nærvær av sulindak og DCA
A549 og SCC25 kreft cellelinjer ble platet som beskrevet ovenfor. Å skatte ROS, enten 2 mM N-acetylcystein (NAC) eller 2 mM Tiron (4,5-dihydroksy-1,3-benzenedisulfonic syre dinatriumsalt) ble tilsatt sammen med sulindak og DCA i 48 timer ved 37 ° C. Cellelevedyktigheten ble overvåket ved MTS-analysen og statistisk analyse utført som nevnt ovenfor.
TUNEL-farging for å overvåke celler gjennomgår apoptose
TUNEL assay ble utført i 96-brønners plater ved å bruke kolorimetrisk blind tunel assay kit (Promega) etter produsentens protokoll. Den A549 og SCC25 kreftcellelinjer ble belagt som ovenfor og behandlet i 48 timer uten narkotika, sulindak, DCA, eller legemiddelkombinasjonen. I etterfølgende behandling, ble cellene fiksert med formalin og permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i PBS. Celler ble inkubert med rekombinant terminal deoksynukleotidyl transferase (TdT) og biotinylerte nukleotider. Endogene peroksydaser ble blokkert med 0,3% H
2o
2 før inkubasjon med pepperrot-peroksydase-streptavidin (HRP-streptavidin) som binder seg til de biotinylerte nukleotider innlemmet i nicked ender til stede i celler som gjennomgår apoptose. HRP-streptavidin merkede celler ble detektert av hydrogenperoksyd og diaminobenzidin (DAB). Celler som viser mørk brun nukleær farging er tegn på apoptose.
A549 og SCC25 kreft celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av DCA i fravær (grå bar) eller tilstedeværelse av sulindak (svart felt) eller tilstedeværelse av sulindak og N-acetylcystein (stripete bar) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble overvåket ved MTS-analyse som nevnt i fremgangsmåtene. Den cellelevedyktighet er uttrykt som% av kontroll (celler ikke behandlet med sulindac). Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet (SEM), uttrykt som% av den midlere verdi av quadruplicates fra et representativt eksperiment. Inhibering av kreftcellevekst skjedde i en doseavhengig måte ved kombinasjonsbehandling av DCA og sulindac (svarte søyler) i begge A549 kreft (A) og SCC25 kreftceller (B). Men denne forbedrede drapet ble forhindret da N-acetylcystein var til stede med stoffet kombinasjonsbehandling (stripete barer i A og B).
Western Blot analyse
Celler ble dyrket til 70 % konfluens, behandlet med spesifiserte narkotika for de angitte varighet, og cytosoliske fraksjoner ble isolert ved hjelp av cytosol /mitokondrier fraksjone kit (Calbiochem, Gibbstown, NJ) etter produsentens protokoll. I korthet ble cellene høstet ved forskjellige tidspunkter og ble deretter sentrifugert ved 600 x g i 5 min ved 4 ° C. De pelleterte cellene ble suspendert i den medfølgende buffer og inkubert i 10 minutter på is. Cellene ble deretter homogenisert ved anvendelse av en glass douncer og homogenatet ble sentrifugert ved 700 x g i 10 minutter ved 4 ° C for å sedimentere kjerner og cellerester. Supernatanten ble sentrifugert ved 10 000 x g i 30 minutter ved 4 ° C for å oppnå den mitokondrielle pelleten og supernatanten ble ansett som den cytosoliske fraksjon. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av en standard Bradford assay.
Seksti mikrogram av totalt protein ble lastet og separert på en 4-12% NuPage Bis-Tris-geler (Invitrogen, Eugene, OR) og overført til en PVDF-membran som ble probet med de primære antistoffer. De primære antistoffer, JNK, pJNK, cytokrom
c
, og PARP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ble brukt på 1:1000 fortynning. p-aktin, (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, California), ble brukt på 1:4000 fortynning. Pepperrot peroksidase konjugert sekundært antistoff ble anvendt, og båndene ble visualisert ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens-metoden (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
toppfelter (A) illustrerer resultatene for A549 kreftceller, mens bunnplatene (B) viser resultatene for SCC25 kreftceller. Omfanget av celler som gjennomgår apoptose ble overvåket ved TUNEL-farging av celler behandlet med ingen medikamenter (underfeltene A1 og B1), sulindac alene (underfeltene A2 og B2), DCA alene (underfeltene A3 og B3), og sulindac og DCA (sub-paneler A4 og B4). Cellene ble behandlet med de angitte stoffene som er nevnt i panelene, som utsettes for TUNEL-farging, og bearbeidet for fluoriserende mikroskopi som beskrevet i Metoder. Flere uavhengige felt ble photomicrographed og representative felt for hver tilstand vises. Brown-fargede celler indikerer celler gjennomgår apoptose.
Ligation-mediert PCR baserte DNA ladde analysen til Monitor Omfang av celler gjennomgår apoptose
For å bekrefte omfanget av apoptose, ligation- mediert PCR basert nukleosomale DNA ladde assay ble utført som beskrevet [25]. Den A549 og SCC25 kreftcellelinjer ble sådd på 5 × 10
4 og 1 x 10
5 celler per brønn i 35 mm retter. De A549 kreft celler ble behandlet i 48 timer med en) uten stoff, b) 500 uM sulindak, c) 20 mM DCA, og d) 500 pM sulindac pluss 20 mM DCA. På samme måte ble SCC25 kreftceller behandlet med de ovenfor angitte fire forskjellige medikamentkombinasjoner bortsett fra at sulindac og DCA ble anvendt ved 100 nm og 10 mM konsentrasjoner, respektivt. Etter behandling ble samlet cellulært DNA ekstrahert, ligert til adapteren konstruert av 27-mer 5′-GACGTCGACGTCGTACACGTGTCGACT-3 «og 12-mer 5′-AGTCGACACGTGTAC-3». Etterfølgende ligering kan DNA ble oppvarmet for å frigjøre den 12-mer, fylt med Taq-polymerase, utsettes for semi-kvantitativ PCR, og analysert på en 1,2% agarosegel sammen med størrelsesmarkører.
i situ
Lokalisering av cytokrom
c
av immunfluorescens
Intracellulær plasseringen av cytokrom
c
ble overvåket ved immunfluorescens ved hjelp av CBA077 InnoCyte ™ Flowcytometriske cytokrom
c
Slipp Kit i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble de SCC25 cellene sådd ut på 3,5 x 10
5 celler pr 35 mm glassbunn fatet og behandlet med de angitte midler i 15 timer. Celler ble skylt i 5 ml 1 x PBS og permeabilisert på is i 10 min i 300 ul buffer som følger. Cellene ble fiksert ved romtemperatur i 20 minutter i 500 pl av 4% paraformaldehyd. I etterfølgende vasking og blokkering, ble cellene inkubert med 250 ul av anti-cytokrom c-antistoff (1:500 fortynning) i 1 time ved RT. Etter vasking ble cellene inkubert med 300 ul av FITC-IgG (1:300 fortynning) i 1 time ved RT. Til slutt, ble cellene farget med 300 ul av DAPI (1 mg /ml) i 10 min ved RT. Celler ble visualisert ved hjelp av et Olympus invertert fluorescerende mikroskop. Bilder ble tatt og behandlet som nevnt ovenfor. Flere felt ble analysert og representative mikrografer som viser lokalisering mønstre av cytokrom
c
under hver behandling tilstand ble oppnådd. Kvantitative verdier er presentert i teksten.
A. SCC25-celler ble behandlet i 48 timer med sulindac (100 uM) og de indikerte konsentrasjoner av DCA og der det er angitt 20 uM av JNK-inhibitor, SP600125. ♦, No stoffet; ▪, sulindak; ▴, sulindak og SP600125. Cellelevedyktigheten ble overvåket ved MTS-analyse som nevnt i fremgangsmåtene. Feilstolper er standard feil av gjennomsnittet (SEM), uttrykt som% av den midlere verdi av quadruplicates fra et representativt eksperiment. Se teksten for detaljer. Statistisk analyse mellom ♦, No addisjon og ▪, Sul; * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005. Statistisk analyse mellom ▪, Sul og ▴, sulindak og JNKI;
$ p 0,05,
$$ p 0,005,
$$$ p 0,0005. B. Representative vestlige blotter som viser effekten av sulindak og DCA på nivåene av total JNK, phopsho-p46JNK og phopsho-p54JNK. p-aktin-nivåer ble anvendt som en intern kontroll. Cytosoliske fraksjoner fra SCC25-celler ble isolert ved den 12 h tidspunkt, og nivåene av JNK og fosfo-JNK ble bestemt ved Western blotting. I SCC25 cellelinje, viste total JNK to forskjellige band på 46 og 54 kDa.
Statistisk analyse og bestemmelse av kombinasjons Indekser
Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM for cellen levedyktighet analyser. For statistisk analyse, ble Minitab statistisk programvare som brukes til å utføre t-test og verdier med p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. For å fastslå den synergistiske virkning av sulindak og DCA på A549 og SCC25 kreftcellelinjer, ble en kvantitativ analyse av dose-virkningsforhold utført for å bestemme kombinasjonsindeksene [26]. Både sulindac og DCA ble testet alene på A549 og SCC25 celler ved de konsentrasjoner som indikert. For A549-celler, ble et forhold på 01:50 ble opprettholdt i den sulindac: DCA medikamentkombinasjoner i området fra 0,2 mM: 10 mM til 1 mM: 50 mM, respektivt. For SCC25-celler, ble et forhold på 1:100 opprettholdes for sulindac: DCA medikamentkombinasjoner i området fra 0,05 mM: 5 mM til 0,3 mM: 30 mM, respektivt. Våre eksperimentelle resultater og bestemt kombinasjon indeksverdier er inkludert i teksten.
Resultater
sulindak og DCA Årsak Forbedret Killing av A549 og SCC25 kreftceller, men ikke normale celler
for disse studiene testet vi en kombinasjon av sulindak og DCA på A549 og SCC25 kreftceller. Cellene ble inkubert med hver forbindelse alene eller i kombinasjon i 48 timer før bestemmelse av levedyktighet (se Metoder). En sulindac doseresponskurve under disse betingelser indikerte at A549 og SCC25 kreftceller kan tåle en maksimal konsentrasjon på 500 uM og 100 uM av sulindac, henholdsvis, uten å stille noen betydelig dreping (data ikke vist), og disse konsentrasjoner ble anvendt i alle studier. DCA, når tilsatt, ble anvendt i konsentrasjoner fra 0 til 40 mM, som angitt. Vi brukte disse konsentrasjonene basert på tidligere rapporter, som indikerte at over 5 mm er nødvendig for å forårsake mitokondriell dysfunksjon
in vitro
eksperimenter [27]. Som vist i figur 1A, DCA alene (uten sulindac) er noe giftig for A549 kreftceller, spesielt ovenfor konsentrasjoner på 20 mM, men i nærvær av sulindac der forsterkes dreping av disse celler ved DCA konsentrasjoner over 5 mM. I tilfelle av de SCC25 kreftceller noe tap av cellelevedyktighet med DCA alene ble registrert selv ved DCA konsentrasjoner under 10 mM (figur 1B). Imidlertid, i nærvær av sulindac var det igjen en markert økning i celledød som var helt tydelig mellom DCA konsentrasjoner på 2-10 mM. Tidligere har vi vist at kombinasjonen av sulindak og et oksidasjonsmiddel var selektiv for kreftceller, og ikke å forbedre drepingen av normale celler [7]. Sulindac og DCA heller ikke forbedre drepingen av normal lunge og hud celler under de anvendte eksperimentelle betingelser, som vist i figurene 1C og D. Det skal bemerkes at MRC-5 (lunge normal) celler er spesielt følsomme for DCA, så rapportert tidligere [28], av grunner som ikke er kjent.
for å bekrefte at det var en synergistisk effekt når stoffet kombinasjonen ble brukt, bestemt vi kombinasjons indeksene ved å utføre en kvantitativ analyse av dose-effekt-forholdet [ ,,,0],26] på to forskjellige kreftcellelinjer (figur S1). Kombinasjonsindeksene var 0,84 for A549 og 0,73 for de SCC25 kreftcellene, henholdsvis. En verdi mindre enn 1,00 indikerer en synergistisk kreftdrepende effekt (figur S2).
Den sulindak Effect er ikke på grunn av sin NSAID aktivitet
I tidligere studier med sulindak og et oksidasjonsmiddel ble det vist at den forbedrede og selektiv dreping av kreftceller ved sulindac og et oksidasjonsmiddel ikke var relatert til den kjente NSAID evne til sulindac. For å bestemme rollen til COX-inhibering et sulindac metabolitt, sulindac sulfon, kan benyttes, ettersom det ikke hemmer COX 1 eller 2, [7], [29]. Som vist i figur 2, ved anvendelse av både A549 (A) og SCC25 (B) kreftceller, en kombinasjon av sulindac sulfon og DCA viste en lignende drepende effekt som sett ovenfor med sulindak. Disse resultatene indikerer at den sulindac forbedrede kreft drepende effekt, i nærvær av DCA ikke er relatert til dets kjente anti-inflammatorisk aktivitet.
Kombinasjonen av sulindak og DCA generere ROS
synergistisk effekt på levedyktighet observert med sulindak og dichloroacetate med både A549 og SCC25 kreftceller er påfallende lik tidligere studier ved hjelp av en kombinasjon av sulindak og TBHP [7]. For å avgjøre om ROS produksjon var involvert i den selektive drap observert i de foreliggende studier, produksjon av ROS, ved hjelp av indikatorfarge H
2DCFDA (se Methods), ble bestemt i kreftcellelinjer som er utsatt for sulindak og DCA. Resultatene er oppsummert i figur 3. Figur 3A viser resultatene med A549 kreftceller. Det er klart fra resultatene som er vist i figur 3A som ubehandlede A549 kreftceller (panel A1), eller celler behandlet med sulindak alene (panel A2), eller DCA alene (panel A3), viser bare noen få positivt fargede celler. Imidlertid, når cellene ble utsatt for både sulindac og DCA (panel A4), en stor økning i positivt fargede celler for ROS (grønn fluorescens) er sett, viser at tilstedeværelsen av både sulindac og DCA resulterer i dannelse av signifikante nivåer av ROS. Som vist i figur 3B lignende resultater er sett med SCC25 kreftceller. Sulindac eller DCA alene resultere i en liten økning i ROS-produserende celler (panel B2 og B3), men en stor økning i ROS-produksjonen er igjen observert når begge stoffer er tilsatt (panel B4). Kvantifisering ved hjelp av SCC25 celler viser at antall DCF-positive celler (se metoder) er 9-10 x mer når cellene blir behandlet med sulindak og DCA i forhold til hver av stoffene alene (se figur S3A). Det fremgår av disse resultatene og tidligere studier som ROS produksjon kan være en vanlig funksjon i den forbedrede drap av kreftceller når sulindak brukes i kombinasjon med forbindelser som påvirker mitokondrienes funksjon.
sulindak i kombinasjon med DCA resultater i en tap av mitokondriemembranen potensial
Hvis ROS produksjon er involvert i sulindak /DCA forbedret drepende effekt man forventer at produksjonen av ROS av legemiddelkombinasjonen vil påvirke mitokondriefunksjon. For å bestemme dette, ble mitokondriemembranpotensialet målt ved hjelp JC-1-farging, som beskrevet i Metoder. Et tap av membranpotensialet er angitt ved en økning av grønn fluorescens som beskrevet i Metoder. Et typisk resultat er oppsummert i figur 4. Både A549 og SCC25 kreftceller ble utsatt for sulindac og DCA enten alene eller i kombinasjon i 48 timer og farget med JC-1 for å overvåke den mitokondrielle membranpotensiale. Figur 4A viser resultatene med A549 cancercellelinje. I fravær av ethvert medikament, mitokondriene vises intakt og bevare sine membranpotensialet som antydet med lite grønn fluorescens (panel A1). I nærvær av sulindac alene (panel A2) eller DCA alene (panel A3) er det en liten økning i grønn fluorescens, noe som indikerer et visst tap av mitokondriemembranpotensialet. Imidlertid, når både sulindac og DCA er tilstede er det en slående tap av mitokondriemembranpotensialet som vist ved en stor økning av grønn fluorescens (panel A4). Vi har observert samme mønster når flere uavhengige områder ble analysert ved fluorescens mikroskopi. Figur 4B viser lignende resultater med de SCC25 kreftceller. Nok en gang et betydelig tap av mitokondriemembranpotensialet bare ble sett når cellene ble utsatt for både sulindac og DCA (panel B4). Kvantifisering av effekten er vist i figur S3b. Det kan sees at prosent av JC1-grønne positive celler når stoffet kombinasjonen ble brukt er 3-4 × at sett med enten stoffet alene.
ROS er innblandet i drapet av kreftceller ved kombinasjon av sulindak og DCA
for å gi mer direkte bevis på at ROS produsert er involvert i den forbedrede drap av kreftceller ved sulindak og DCA, har vi brukt to kjente ROS åtseletere, N-acetylcystein (NAC) og Tiron ( se Methods). Resultatene ved bruk av NAC er vist i figur 5. Figur 5, panel A, viser at ved både 20 og 30 mM DCA, den forbedrede dreping av A549 kreftceller ble observert i nærvær av sulindac, er i stor grad forhindret hvis NAC (2 mM) er presentere i løpet av de 48 timers inkubasjon. Svært like resultater er sett med SCC25 kreftceller, som vist i figur 5, panel B. Sammenlignbare resultater ble oppnådd når Tiron ble anvendt i stedet for NAC (figur S4).
sulindac og DCA Killing av kreftceller Innebærer apoptotisk død
resultatene ovenfor (figur 3, 4, 5) viser at den forbedrede drapet på kreftcellelinjer innebærer mitokondriell dysfunksjon, som tyder på at den observerte celledød er via apoptose. Tidligere studier har indikert at sulindac og dets derivater er proapoptotiske medikamenter [5], [6]. Det er også rapporter som DCA kan føre til celledød ved apoptose [20], [23]. For å bestemme hvorvidt drap av cancerceller ved en kombinasjon av disse to stoffer, mediert av ROS, innebærer apoptotisk død vi utført TUNEL-farging for å måle apoptose (se Metoder). Flere replikater ble testet for sulindac og DCA alene, eller i kombinasjon, for TUNEL-farging eksperimenter. Et typisk resultat er vist i figur 6, hvor toppfeltene (figur 6A, paneler A1-A4) representerer resultatene med A549 kreftceller og bunnfeltene (figur 6B, paneler, B1-B4) viser resultatene med SCC25 cancer
