Abstract
Aim
Nyere bevis tyder på at flere kosttilskudd polyfenoler kan utøve sin chemopreventive effekt gjennom epigenetiske modifikasjoner. Curcumin er en av de mest studerte kost kjemopreventive midler for forebygging av kreft i tykktarmen, men dens virkning på epigenetiske endringer, spesielt DNA-metylering, forblir uklar. Ved hjelp av systema genom-wide tilnærminger, ønsket vi å belyse effekten av curcumin på DNA metylering endringer i kolorektal kreftceller.
Materialer og metoder
For å evaluere effekten av curcumin på DNA metylering, tre CRC cellelinjer, HCT116, HT29 og RKO, ble behandlet med curcumin. 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-CDR) og trichostatin A-behandlede celler ble anvendt som positive og negative kontroller for DNA-metylering endres, henholdsvis. Metylering status for LINE-1 gjenta elementer, DNA promoter metylering mikromatriser og genuttrykk matriser ble brukt for å vurdere globale metylering og genuttrykk endringer. Valideringen ble utført ved hjelp av uavhengige mikromatriser, kvantitativ bisulfite pyrosekvensering, og qPCR.
Resultater
Som forventet, genom-wide metylering mikromatriser avdekket betydelig DNA hypometylering i 5-aza-CDR-behandlede celler (gjennomsnitt P-verdier på 0,12), imidlertid, ikke-signifikante endringer i midlere β-verdier ble observert i curcumin-behandlede celler. Sammenlignet med mock-behandlede celler, curcumin-induserte DNA-metylering endringer inntraff i en tidsavhengig måte. I motsetning til den generaliserte, ikke-spesifikk global hypometylering observert med 5-aza-CDR, curcumin behandlingen resulterte i metylering endringer på valgt, delvis metylert loci, istedenfor fullt metylert CpG områder. DNA metylering endringer ble støttet av tilsvarende endringer i genekspresjon på både opp- og ned-regulert gener i ulike CRC cellelinjer.
Konklusjoner
Våre data gir tidligere ikke belegg for curcumin-mediert DNA metylering endringer som en mulig mekanisme for tykktarmskreft chemoprevention. I motsetning til ikke-spesifikk global hypometylering indusert av 5-aza-CDR, curcumin-indusert metylering endringene skjedde bare i en undergruppe av delvis metylert gener, noe som gir ekstra mekanistiske innsikt i den potente chemopreventive effekten av denne kosttilskudd nutraceutical.
Citation: Link A, Balaguer F, Shen Y, Lozano JJ, Leung H-CE, Boland CR, et al. (2013) Curcumin modulerer DNA Metylering i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 8 (2): e57709. doi: 10,1371 /journal.pone.0057709
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 22 august 2012; Godkjent: 25 januar 2013; Publisert: 27 februar 2013
Copyright: © 2013 Link et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende arbeidet ble støttet med tilskudd R01 CA72851 og CA129286 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, og midler fra Baylor Research Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Ajay Goel fungerer for tiden som en redaksjonell styremedlem for PLoS ONE, derimot, gjør dette ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de viktigste årsakene til dødsfall på verdensbasis, som er ansvarlig for ca. 10% av total kreftrelatert dødelighet [1]. Omtrent 3-5% av alle CRC skyldes nedarvede genetiske defekter og opp til 25% av pasientene kan ha en viss grad av familiality for denne sykdommen, men de fleste av CRC forekomme i en sporadisk måte i fravær av en dokumentert familiehistorie. Økende bevis indikerer at i tillegg til genetisk ustabilitet fenotyper som for eksempel kromosomalt og mikro ustabilitet, epigenetiske endringer som omfatter DNA-metylering endringer, histon modifikasjoner og forandringer i miRNA uttrykk, kan spille en viktig rolle i initiering og progresjon av CRC [2] – [ ,,,0],4].
i motsetning til genetiske defekter, epigenetiske forandringer er mer dynamisk og kan påvirkes av aldring, miljø, livsstil og kostholdsfaktorer, som antas å spille en viktig rolle i utviklingen av over to tredjedeler i alle humane cancere [5] – [7]. Avvikende DNA metylering som består av både samlings
hypermethylation
av promoter CpG øyer som resulterer i transcriptional stanse av gener, og global
hypometylering
av DNA som forenkler kromosom ustabilitet og Aneuploidy, og er en av de mest omfattende studert epigenetiske hendelser i kreft [8] – [11]. Videre, gitt at DNA metylering endringer er potensielt reversible, og ofte foran genetiske hendelser i flertrinns kolorektal kreftutvikling, gir en spennende og lovende mulighet for kreft forebygging og behandling [12] -. [17]
Basert på dette konseptet , epigenetisk terapi blir nå undersøkt, med mål om å hindre kreftceller fra å anskaffe avvikende DNA metylering og bidra til å gjenopprette «normale» DNA metylering og genuttrykksmønster til viktige kreftrelaterte gener. Følgelig har nukleosidanaloger slik som 5-azacytidin og 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-CDR) er identifisert som potent DNA-metyl-transferase (DNMT) inhibitorer. Innlemmelse av disse nukleosidanaloger direkte inn DNA under replikering samt proteosomal nedbrytning av DNMT1 enzym som katalyserer
de novo
hypermethylation utgjør to viktige mekanismer som er ansvarlige for sine demethylating aktiviteter [18] – [20]. Det er en økende forståelse for at reversering av avvikende DNA-metylering mønstre i kreftceller kan være effektiv for dens behandling og forebyggelse [21]. Flere slike nukleosidanaloger blir nå undersøkt for behandling av hematologiske maligniteter og er i tidlig stadium kliniske studier for andre faste ondartede sykdommer; Dessverre har den brede anvendelighet av disse midler vært hemmet av toksisitet og uheldige bivirkninger. Videre er den ikke-spesifisitet som tillater den globale hypometylering av til og med fullt metylert gener og resulterer i kromosomal ustabilitet begrenser bruken av disse forbindelser som potensielle kjemopreventive midler [8], [10]. I et forsøk på å søke alternative chemopreventive strategier, har flere fytokjemikalier dukket opp som potensielt potente valg på grunn av mangel på signifikante effekter profiler [22]. Videre data tyder på at forstyrrelser i diettnæringsmidler slik som folat og selen kan påvirke DNA-metylering, både
in vitro
og
in vivo
, som et resultat av en inhibering av DNMT1 protein ekspresjon og enzymatisk aktivitet [23]. Diett polyfenoler, slik som (-) – epigallocatechin-3-gallat (EGCG) fra grønn te og genistein fra soyabønner, har også blitt vist å hemme DNMT aktivitet i kreftcellelinjer [24], [25]. DNMT hemmende aktivitet er forbundet med demetylering og reaktivering av flere metylering-forstummet gener som
p16, RARβ, MGMT, MLH1, BTG3 Hotell og
GSTP1
i humane kreftceller, noe som tyder på en mulig chemopreventive effekt på grunn av epigenetisk modifikasjon indusert av disse kosttilskudd plante [25], [26]. Men fortsatt den variable demethylating effekten av polyfenoler dårlig forstått fordi de fleste publiserte studier har rapportert data for bare håndfull av gener, og mange av disse epigenetiske effekter har ikke vært reproduserbare i uavhengige studier [27], [28].
Curcumin (diferuloylmethane), et naturlig stoff som stammer fra krydderet gurkemeie (
Curcuma longa
), har vært brukt til behandling av ulike inflammatoriske sykdommer i tradisjonelle indiske og kinesiske systemer av medisin. De siste tiårene har en omfattende og grundig kroppen av publisert vitenskapelig litteratur viste at chemopreventive effektene av curcumin blir formidlet av en rekke molekylære mekanismer, herunder direkte eller indirekte interaksjon med ulike transkripsjonsfaktorer, enzymer og regulatoriske proteiner som spiller en sentral rolle i viktige kreftrelaterte prosesser som inflammasjon, spredning, overlevelse, migrasjon, angiogenese, invasjon og metastasering [22]. Bevis for effektiviteten av curcumin som kreft eller chemopreventive agent har blitt trukket fra hundrevis av studier foretatt i cellekultursystemer, dyremodeller og mennesker [29]. Nyere studier har begynt å gjenkjenne curcumin effekt ved modulering av epigenetiske prosesser i kreftceller, hvor curcumin har vist seg å være et histon acetyltransferase (HAT) inhibitor [30], [31], så vel som en potensiell DNMT1 inhibitor, noe som resulterer i hypometylering av ulike gener inkludert RARβ2 i livmorhalskreftceller [32] – [34]. Men rollen som curcumin som en DNA hypomethylating forbindelsen har ikke blitt systematisk undersøkt som foreløpig, og dens demethylating potensialet har ikke blitt gjengitt i sin helhet i andre studier [32], [33].
Følgelig i denne studien, utførte vi en omfattende og systematisk analyse for å undersøke effekten av curcumin på DNA metylering i tykktarm kreft celler. Genome-wide DNA metylering analyser og samtidig genuttrykk profilering studier ble utført på CRC cellelinjer som ble behandlet med kort og lang sikt curcumin behandling. Heri, viser vi at curcumin modulerer DNA metylering endringer i kreftceller; i tillegg er slike endringer ofte bekreftes med tilsvarende endringer i genuttrykk. Til slutt gir vi roman bevis, som i motsetning til global hypometylering indusert av 5-aza-CDR, DNA metylering endringer knyttet til curcumin behandling forekommer bare i en undergruppe av hovedsakelig delvis metylert gener, og i en tidsavhengig måte.
Materialer og Metoder
Cell Kultur
Tre menneske CRC cellelinjer, HCT116 (mikro ustabil eller MSI), RKO (CpG Island metylering fenotype eller CIMP) og HT29 (mikro stabil eller MSS ), ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler ble dyrket i IMDM-medium (Invitrogen, Rockville MD) under standard betingelser med 10% føtalt bovint serum og 5% CO
2 ved 37 ° C. Cellelinjen autentisitet ofte ble bekreftet ved å analysere ulike genetiske og epigenetiske markører hver 6-8 måneder.
Curcumin Behandling
Curcumin (Sigma-Aldrich, MO, USA) aksjer ble fremstilt ved å oppløse det i dimetylsulfoksid (DMSO) ved 10 mM, og små aliquoter ble lagret ved -20 ° C inntil bruk. For å bestemme effekten av curcumin på DNA metylering, ble alle tre CRC-cellelinjer utsatt for 7,5-10 mikrometer curcumin for kortsiktig (6 dager, STC) eller langsiktig (240 dager; LTC) behandling. Fersk curcumin-inneholdende kulturmediet ble byttet ut annenhver dag i løpet av behandlingen. Kontroll cellelinjer uten curcumin behandling ble dyrket med hvert sett av behandlinger for samme varighet.
5-aza-CDR og TSA Behandling
5-aza-CDR behandling ble utført som beskrevet tidligere [ ,,,0],35]. I korte trekk ble 5-aza-CDR oppløst i PBS (pH 7,5) ved 5 mM og små alikvoter ble holdt frosset ved -20 ° C. Tjuefire timer etter såing, ble CRC-celler behandlet med 2,5 uM 5-aza-CDR (Sigma-Aldrich, MO, USA) i 24 timer, og cellene ble høstet etter 48 timer. Trichostatin A (TSA) ble oppløst i etanol ved 0,3 pM. Celler ble sådd ut like og etter vekst over natten ble behandlet med TSA i 24 timer. Celler ble pelletert og lagret ved -80 ° C inntil analyse.
MTT-analysen Levedyktighet
Virkningene av curcumin på cellelevedyktigheten ble bestemt i et MTT-assay, som er basert på 3- (4- , 5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid-opptak. Celler (2 x 10
3 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater i 24 timer før behandling curcumin. Etter 72 timer med curcumin behandling, ble MTT-løsning tilsatt til hver brønn og inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Celler ble inkubert med SDS-buffer (10%) med 0,01 M HCl over natten, og absorbansen ble målt ved 570 nm ved anvendelse av et spektrofotometer. Uavhengige eksperimenter ble utført tre ganger i tre eksemplarer.
bromdeoksyuridin (BrdU) Proliferation Assay
celleproliferasjon analyser ble utført ved anvendelse av kolorimetrisk ELISA-celleproliferasjon, BrdU-sett (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ved å følge produsentens instruksjoner. I korthet, 2 x 10
3-celler ble dyrket i 96-brønners plater og behandlet med curcumin i 72 timer. Spredning indeksen ble målt ved BrdU inkorporering følge produsentens instruksjoner. Forsøk ble utført i tre eksemplarer i 3 uavhengige eksperimenter.
Plating Effektivitet
For å teste for plating effektivitet, celler ble sådd ut i en lav tetthet i 6-brønners plater og behandlet ved hjelp av behandling protokollen beskrevet ovenfor i 12-16 dager til individuelle celler dannet tydelig synlige kolonier. Deretter ble cellene fiksert med 10% formalin og farget med 0,1% krystallfiolett. Etter vasking, platene ble lufttørket og digitale bilder ble tatt. Uavhengige eksperimenter ble utført tre ganger i tre eksemplarer
DNA Extraction, Bisulfite Modifikasjon og Metylering Profiling (infinium Metylering analyse)
DNA ekstraksjon ble utført med DNeasy Blood Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Genomisk DNA var bisulfit modifisert (EZ DNA metylering Gold Kit, Zymo Research, vennligst legg by /stat) som beskrevet tidligere [35]. For å analysere effekten av curcumin på DNA metylering, utførte vi DNA metylering profilering bruker infinium metylering analysen med HumanMethylation27 BeadChip mikromatriser (Illumina, San Diego, CA), som er i stand til samtidig å analysere metylering status for 27,578 individuelle CpG områder som dekker over 14 000 gener [36]. Hele genomet forsterkning, merking, hybridisering og skanning ble utført i henhold til produsentens instruksjoner på genomikk kjernefasilitet på Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine, Houston, TX. Metylering status ble målt som forholdet for signal fra en metylert sonden i forhold til både denaturert og unmethylated sondesignaler. Metylering forhold ble trukket ut ved hjelp av Metylering moduler i Illumina Bead Studio følgende gjennomsnittlige normalisering, og den kvantitative β-verdi varierte fra 0 (0% metylering) til 1 (100% metylering). P-verdien cut-off for detekterbare sondesignalene ble satt til 0,05. For metylering analyser, ble en Δβ-verdi på ≥0.1 (10% metylering) definert som betydelig [37].
Kvantitative metylering Analyser
Vi validerte metylering microarray data av uavhengige enkelt gen /promoter kvantitative metylering analyser. Avhengig av metylering analyse design funksjoner, brukte vi enten bisulfit pyrosekvensering (PSQ HS 96A pyrosekvensering system, Qiagen, Valencia, CA) eller sanntidsbasert qMSP for kvantitativ metylering analyser som beskrevet tidligere [37], [38]. Primer sekvenser for begge metodene er gitt i Utfyllende Tabell S1.
genuttrykk Microarray Analyser
Parallelt med metylering profilering, utførte vi mikromatriser genuttrykk analyserer følge produsentens instruksjoner og en tidligere etablert protokoll [39]. Total RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy mini-kit (Qiagen, Valencia, CA) og forsterkes ved hjelp av Illumina er TotalPrep RNA Amplification Kit. RNA integritet ble vurdert ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer. Merket cRNA ble hybridisert over natten til menneskelig HT12 V3 chips, vasket, og skannes på en Illumina BeadStation-500. Illumina er BeadStudio versjon 3.1 ble brukt til å generere signalintensitetsverdier fra skanningene, subtrahere bakgrunn, og skalere hver microarray til median gjennomsnittlig intensitet for alle prøvene (per-chip normalisering). Normalisering ble gjort ved hjelp quantiles med Lumi R-pakken. Fold-endringer ble beregnet i forhold til sine respektive kontrollene som beskrevet andre steder [35]. Oppfinnsomhet pathway analyse (IPA, oppfinnsomhet Systems, Inc. CA, USA) ble utført for å evaluere und kategorisere differensielt uttrykte gener i ulike funksjonelle veier.
Statistiske analyser
Alle data ble analysert ved hjelp av Graph Pad Prism 4.0 (San Diego, California, USA) statistisk programvare. Forskjeller mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av t-test. Forskjeller mellom mer enn to gruppene ble analysert ved hjelp av gjentatte målinger ANOVA og Bonferroni er flere sammenligninger som
post hoc
test. Tosidig p-verdier på 0,05 ble ansett betydelig
Resultater
Curcumin Hemmer celleviabilitet og spredning i CRC cellelinjer
Tidligere studier har gitt flere nivåer av bevis. for anti-kreft effekt av curcumin ved å påvirke celle-proliferasjon, apoptose, migrering og invasjon. For å bestemme effektive og ikke-giftige curcumin konsentrasjoner i vårt panel av CRC cellelinjer (figur 1A) vi først utført spredning og celle levedyktighet analyser i CRC cellelinjer eksponert for ulike konsentrasjoner av denne kosttilskudd polyphenol. Tre menneskelige CRC cellelinjer som representerer forskjellige epigenotypes menneskerettighets tykktarm kreft ble brukt: HCT116 (mikro ustabil – MSI – kreftcellelinje på grunn av germline mutasjon i
MLH1, etter misparringssystemet), RKO (MSI kreftcelle linjen forbundet med
MLH1
promoter hypermethylation i sammenheng med CpG island arrangøren metylering fenotype eller CIMP) og HT29 (mikro stabil eller MSS, cellelinje med mutant
KRAS- Hotell og
p53
gener) [40]. MTT og BrdU ble utført etter behandling med enten curcumin (0-20 uM) eller DMSO i 72 timer (figur 1 B 27 500) i behandlede celler
For å evaluere effekten av curcumin på DNA metylering vi brukte to forskjellige behandlingsmodeller. Først må vi vedtatt en vanlig brukt kortvarig behandling av CRC-celler med curcumin i løpet av en periode på 6 dager, [24]. For det andre har vi brukt lang sikt curcumin behandling i 240 dager, en modell som sannsynligvis bedre etterligner bruk av curcumin i en chemopreventative innstilling hos mennesker, og en som var antatt å bedre representere curcumin-indusert epigenetiske forandringer i kloner av celler som har gjennomgått og vedlikeholdes CpG demetylering, gitt curcumin er lavere aktivitet i forhold til kommersielt tilgjengelige DNMT hemmere. For å undersøke effekten av curcumin på CpG metylering (figur 2B), utførte vi parallelle sammenligninger mellom kort og lang sikt curcumin behandlet CRC cellelinjer. Først må vi sortert alle 27000 CpG loci i stigende rekkefølge av metylering basert på metylering status i foreldrecellelinjer (hvite prikker som kumulativt vises som en linje i figur 2), mens tilsvarende DNA metylering endringer etter både kort og lang sikt curcumin behandlinger er representert som røde og blå punkter, henholdsvis. De vertikale avstander på hver prikk fra «linjen viser resultatene fra kontrollceller» representerer nivået av enten hyper (over den hvite linje), eller hypo-metylering (under den hvite linje). Som vist i figur 2B, ble kortvarig curcumin behandling assosiert med relativt små metylering endringer i alle 3 cellelinjer, med de tilsvarende gjennomsnitts β-verdiendringer som følger; 0.389 vs. 0,393 for HCT116, 0,388 g 0,396 for RKO og 0,294 g 0,291 for HT29. I motsetning til dette ble langtids curcumin behandling assosiert med mer uttalt metylering endringer i forhold til kontrollceller (figur 2B), selv om den netto β-verdiendring var ikke signifikant forskjellig (0,399 for HCT116, 0,398 for RKO og 0,275 for HT29).
curcumin fremkalte ikke global DNA Metylering endringer
for å evaluere effekten av curcumin på globale DNA metylering forandringer, vi utplassert to uavhengige tilnærminger. Først må vi analyserte metylering status for LINE-1 elementer, som fungerer som surrogatmarkører for global metylering, ved hjelp av kvantitativ sulfitt pyrosekvensering [41]. Vi fant ut at etter kort- og langtidsbehandling med curcumin LINE-1 metylering nivåene var sammenlignbare med ubehandlede kontroller, mens de i 5-aza-CDR behandlet cellelinjer viste betydelig nedgang i LINE-en metylering (figur 3A). For det andre, ved hjelp av infinium metylering array-data, visualisert vi globale CpG loci tetthet mønstre ved hjelp av tetthets plott. Som ventet ble 5-aza-CDR behandling assosiert med en klar dreining av metylering tetthet linje mot unmethylated staten, mens ingen åpenbare endringer i mønstre global metylering tetthet ble funnet i CRC cellelinjer som ble behandlet med curcumin – en observasjon som er forenlig med vår linje-1 metylering resultater som viser et fravær av globale metylering endringer indusert av curcumin (figur 3B).
(A) HCT116, RKO og HT29 ble behandlet med 5-aza-CDR og curcumin og LINE-en metylering status ble bestemt ved bruk bisulfit pyrosekvensering. (B) For å vurdere endringer i globale metylering mønstre, ble tetthet tomter beregnet for kontroller, 5-aza-CDR og curcumin behandlet cellelinjer ved hjelp infinium global metylering mikromatriser. Mens 5-aza-CDR var ansvarlig for en vridning av CpG metylering mot hypometylering, metylering mønster av cellene etter at curcumin behandling forble uendret. Forkortelser: 5-aza-deoksycytidin (5-aza-CDR), kortsiktige curcumin behandling (STC), lang behandling med curcumin (LTC)
Validering av curcumin-indusert DNA metylering Endringer i. CRC cellelinjer
Som beskrevet ovenfor, ble langvarig eksponering for curcumin assosiert med mer signifikante metylering endringer i forhold til kortsiktige behandlet CRC cellelinjer. Derfor, for validering, smalere vi vårt fokus på effektene av langvarig curcumin behandling ved hjelp av to ulike strategier. Først spilte vi en uavhengig genom-wide metylering microarray analyse (Infinium®) med matchet uavhengig bisulfitt modifiserte DNA-prøver fra curcumin og kontrollcellelinjer. Som beskrevet ovenfor, ble en Δβ-verdi på 0,1 (tilsvarende 10% metylering) anvendt som cut-off-terskel for differensielt metanoldenaturert loci. Figur 4A viser antall differensielt denaturert loci etter langtids curcumin behandling som ble delt mellom begge sett av metylering mikromatriser. Totalt fant vi en høy grad av korrelasjon mellom de to forsøkene (HCT116-LTC: R
2 = 0,9669, p 0,0001, RKO-LTC: R
2 = 0,9508, p 0,0001, HT29-LTC: R
2 = 0,9089; p 0,0001, RKO 5-aza-CDR: R
2 = 0,9569; p 0,0001, RKO-TSA: R
2 = 0,9484; p 0,0001). Følgelig fikk vi bekreftet at langsiktig curcumin behandlingen ble assosiert med DNA metylering endringer på 1436 loci for HCT116, 814 for RKO og 3051 for HT29 (figur 4A). For det andre, vi lykkes validert metylering endringer på flere tilfeldig utvalgte loci inkludert
KM-HN-1, PTPRO, WT1 Hotell og
GATA4, etter bruk av en qMSP analyse i både curcumin og 5-aza-CDR behandlede tykktarmskreftcellelinjer (figur 4b). Med unntak av UCHL-1 (β-verdi på 0-9), alle validert loci hadde β-verdi mellom 0,3-0,8.
(A) For å validere forandringene i DNA-metylering, ble prøvene gjen -analyzed med en infinium microarray hjelp uavhengig bisulfite endret genomisk DNA. Figuren representerer antall CpG loci som viste CpG metylering endringer med en Δβ-verdi på ≥0.1 i begge forsøkene. 5-aza-CDR og TSA behandlede celler ble brukt som positive og negative kontroller av validering. (B) Kvantitativ MSP (qMSP) ble utført for å validere metylering endringer i HCT116. Relativ metylering ble beregnet ved normalisering av metylering status av curcumin og 5-aza-CDR behandlede celler til kontroller. (C) Den Venn-diagram viser at CpG metylering endringene overlapper mellom HCT116, RKO og HT29 etter behandlingen med curcumin.
Curcumin-indusert Metylering Endringer forekommer i en gen- og cellelinje-spesifikk måte
Vi neste spørsmål ved om curcumin-indusert DNA-metylering endringer observert i våre eksperimenter er gen- eller cellelinje-spesifikke. Tatt i betraktning de genetiske og epigenetiske forskjeller mellom ulike CRC cellelinjer analysert i denne studien, fant vi i en-til-en-sammenligninger at alle 3 cellelinjer delt i opp til 30% CpG loci viss grad av metylering endringer etter curcumin behandling. Imidlertid observerte vi at bare 68 CpG loci ble hypomethylated i alle 3 cellelinjer, noe som tyder på cellelinjespesifikke forskjeller i DNA-metylering indusert av curcumin (figur 4C). Deretter ønsket vi å se om curcumin-indusert metylering endringer er tilfeldig, eller om det er et bestemt mønster til denne epigenetisk modifikasjon. For å besvare dette spørsmålet vi nok en gang arrangert metylering resultater fra alle 27.000 CpG steder i stigende rekkefølge, og kledde disse resultatene med middelverdien Δβ-verdiendring på curcumin behandlede celler (figur 5). I tillegg til både hypo- og hyper-metylering av ulike CpG nettsteder knyttet til curcumin behandling, observerte vi et unikt mønster av curcumin-indusert metylering endringer som klart skilte seg fra den 5-aza-CDR en i alle 3 cellelinjer. Som vist på figur 5, mens 5-aza-CDR-indusert-hypometylering ble påvist i det hele tatt CpG loci, var curcumin behandling forbundet hovedsakelig med metylering forandringer på CpG områder som var delvis metylert, en observasjon som støtter en gen-spesifikk demetylering av dynamisk metylert CpG loci som er mål for curcumin-indusert epigenetisk modifikasjon.
Den godkjente CpG loci av cellelinjene ble bestilt i stigende rekkefølge. Figuren representerer størrelsen og plasseringen av curcumin rammede CpG loci i forhold til kontroll-cellelinjer. Den grå kurve representerer fordelingen av CpG loci i stigende rekkefølge. De svarte strekene representerer AB- ^-verdier
(βcontrol-βtreatment) som samsvarer med kontrollceller. Behandlingen med curcumin ble assosiert med både hyper- og hypometylering endringer, hovedsakelig i delvis metylert CpG loci, mens 5-azaCdR behandling var ansvarlig for ikke-selektive hypometylering.
Curcumin-indusert DNA Metylering Endringer forbinder med tilsvarende endringer i genuttrykk
for ytterligere å forstå den biologiske betydningen av DNA-metylering endringer indusert av curcumin, analyserte vi genuttrykk profiler i CRC cellelinjer før og etter langtids curcumin behandling. For denne analysen, utførte vi korrelerende analyse mellom genom-wide metylering resultater og genuttrykk data. Heri valgte vi alle CpG loci som hadde en metylering endring på minst 10% (eller en Δβ-verdi ± 0,1) og et uttrykk endring på minst 1,5 ganger mellom kontroll og behandlede celler curcumin. Ved hjelp av disse kriteriene, identifiserte vi 235 gener i HCT116, 108 gener i RKO og 543 i HT29 celler (figur 6). Oppfinnsomhet Pathway Analyser (IPA) viste at gener med samtidig DNA metylering og genuttrykk endringer er ofte involvert i flere viktige cellulære reguleringsprosesser inkludert narkotika eller lipid metabolisme, molekylære transport, kreft biologi, cellesignalering, inflammatorisk respons og cellesyklus. Detaljerte kategorier av slike gener i HCT116 cellene er presentert i tabell 1. Derfor våre data tyder på at metylering endringer indusert av curcumin har en direkte innvirkning på transkripsjon av ulike gener som deltar i viktige biologiske prosesser som kan være medvirkende til curcumin-mediert kreft
