Abstract
Pennogenyl saponiner er de aktive forbindelsene ifølge stort antall plantearter, og følgelig mange polyherbal formuleringer. Derfor har stor interesse vært vist i sin karakterisering og i etterforskningen av deres farmakologiske og biologiske egenskaper, spesielt kreft. Dette studiet er rapporter om evaluering av cytotoksiske effekter og forklaring på de molekylære virkningsmekanismer av de to pennogenyl saponiner (PS 1 og PS 2) isolert fra
Paris quadrifolia
L. jordstengler på menneskers livmorhals adenokarsinom cellelinje HeLa . For å bestemme levedyktigheten av cellene som ble behandlet med forbindelsene som vi brukte sanntidsanalyser celleproliferasjon og funnet at pennogenyl saponiner PS 1 og PS 2 sterkt hemmet tumorceller vekst med IC50-verdier på 1,11 ± 0,04 pg /ml og 0,87 ± 0,05 ug /ml, henholdsvis. Den strømningscytometri-analyse indikerte at de to forbindelsene induserte apoptose i en doseavhengig måte og redusert mitokondriemembranpotensialet i HeLa-celler i tidlig stadium av apoptose. Kvantitativ PCR og Western blot-analyse viste at de to saponiner betydelig øket mRNA-ekspresjon av FADD og BID samt indusert caspase-8 via økt fra procaspase-8 bearbeiding i de behandlede celler. Resultatene av denne studien tyder på at både den ytre død receptor og indre mitokondrielle trasé er involvert i programmert celledød
Citation. Stefanowicz-Hajduk J, Bartoszewski R, Bartoszewska S, Kochan K, Adamska A, Kosinski I, et al. (2015) Pennogenyl saponiner fra
Paris quadrifolia
L. Frem Ytre og indre vei av apoptose i Human livmorhalskreft HeLa celler. PLoS ONE 10 (8): e0135993. doi: 10,1371 /journal.pone.0135993
Redaktør: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 16 april 2015; Godkjent: 28 juli 2015; Publisert: 21 august 2015
Copyright: © 2015 Stefanowicz-Hajduk et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data . er innenfor papir
Finansiering: Denne forskningen ble støttet av den polske departementet for vitenskap og høyere utdanning i henhold til tildelings Nr N N405 669140 (til JR Ochocka) og fra kvalitet – fremme tilskudd under Leading National Research Centre (vet) program for årene 2012-2017. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, decicion å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
steroide saponiner er den gruppen av sekundære metabolitter som finnes i stort antall monocotyledonous planter. Derfor er de bestanddeler av mange plante narkotika og folke medisiner, spesielt av Orient opprinnelse [1] hvor vanlige kilder til saponiner er arter fra
Lilje
familien. En av de viktige saponin bærende slekten fra denne familien er
Paris hoteller, som inkluderer over tjue plantearter. Disse artene inneholder hovedsakelig pennogenyl og diosgenyl glykosider [2] som er fysiologisk aktive forbindelser [3, 4] og spiller en viktig rolle i behandlingen av neoplasmer, hemostatiske forstyrrelser, betennelse og soppinfeksjon [5-7]. I folkemedisinen, de er gunstig i behandlingen av traumatiske skader, slangebitt, abscess, parotitis og mastitt.
Mye oppmerksomhet er betalt til den cytotoksiske aktiviteten til pennogenin saponiner isolert fra
Paris polyphylla
[8-10]. Disse komponentene viser betydelige antiproliferative aktiviteter på lever, bryst og prostata kreft celler [11, 12]. Nyere data indikerer at pennogenyl glykosider har en anti-metastatisk virkning på melanomceller [13] og
in vivo
anticanceraktivitet mot leverkreft [14]. Styrken på disse effektene på kreftceller er mangfoldig og er strengt knyttet til kjemiske strukturen saponin forbindelser som er mest kjent [10, 15-17].
Til tross for de mange phytochemical studier, er det ganske få forskning som forsøker å utforske mekanismene for pennogenyl saponiner virkning på tumorcellene, hovedsakelig på grunn av deres lave innhold i planter [9, 13, 14].
den foreliggende studien undersøker mekanisme av cytotoksiske virkninger av de to pennogenyl saponiner (PS) isolert fra
Paris quadrifolia
L. på menneskelige livmor adenokarcinomceller (HeLa). De saponiner ble hentet fra
Paris hoteller, jordstengler og kjemisk identifisert i vår tidligere studie [18]. Strukturen av forbindelse PS 1 ble bestemt som pennogenin 3-
O
-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside
and sammensatte PS 2 som pennogenin 3-
O
-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside. Disse forbindelsene har sterke antitumor egenskaper på de testede celler. Imidlertid mekanismene for deres cytotoksiske virkning, i henhold til vår kunnskap, forblir delvis belyst [19]. En av de mulige mekanisme som spiller en rolle ved inhibering av HeLa-celler spredning er induksjon av apoptose via aktivering av kaspaser er knyttet til den iboende signalveien [19]. I vår studie, postulerer vi at både de pennogenyl saponiner indusere apoptose også gjennom aktivering av død reseptor-mediert veien.
Materialer og metoder
Material
Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), penicillin, streptomycin, L-glutamin, DMSO, PBS, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) fargestoff ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
isolering og kjemiske egenskapene til de to undersøkte pennogenyl saponiner fra
P
.
quadrifolia
jordstengler ble utført og beskrevet tidligere [18]. De frysetørrede Forbindelsene ble oppløst i DMSO ved en konsentrasjon på 1 mg /ml.
Cellelinje kultur
Den humane cervikale adenokarsinom-cellelinje (HeLa S3) og humane keratinocytter (HaCaT) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). Cellelinjer ble dyrket i DMEM supplementert med 10% (v /v) FBS, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, og ble holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator.
MTT analyse
levedyktighet av cellene ble bestemt ved hjelp av MTT analysen. Cellene ble sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 2×10
3 celler /brønn og ble behandlet i 24 timer med forbindelser PS 1 og PS 2 i konsentrasjonsområdet 0.1-10.0 ug /ml. DMSO ble tilsatt til kontrollceller ved en sluttkonsentrasjon på 1,0% (v /v), som ble knyttet til den maksimale konsentrasjon av løsningsmidlet forbindelsene som anvendes i forsøket. Etter behandling, ble MTT (0,5 mg /ml) tilsettes til mediet, og cellene ble inkubert i 3 timer ved 37 ° C. Absorbansen av formazanet oppløsningen ble målt ved 570 nm med en plateleser (epoke, BioTek Instruments, USA). Resultatene er uttrykt som IC50 middelverdier (± SD, standardavvik) på minst to uavhengige forsøk.
xCELLigence celleproliferasjonsanalyse
For sanntids overvåking av celle levedyktighet, brukte vi xCELLigence system (ACEA biovitenskap, USA). Cellene ble sådd ut ved en densitet på 2×10
4 /brønn inn i E-plate 16 (ACEA Biosciences, USA) inneholdende 100 ul medium per brønn. Når cellene angitt log fase, forbindelsene PS 1 PS og 2 ble tilsatt til endelige konsentrasjoner på 0,1 til 10,0 ug /ml. En endelig DMSO-konsentrasjon i brønnen ikke overstige 1,0% (v /v). Cellene ble inkubert med forbindelsene og overvåket i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Den RTCA programvare v. 1.2.1 ble brukt for å beregne den halve maksimale inhiberende konsentrasjon (IC50) verdier. Alle forsøkene ble utført i to eksemplarer, i tre uavhengige gjentas.
Trypan blå assay
-celler (1×10
5-celler /brønn) ble inkubert med de testede forbindelsene ved en konsentrasjon på 1,0 -5,0 ug /ml. Etter 24 timer ble cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av 0,2% (v /v) trypanblått-oppløsning (sluttkonsentrasjon) og celleteller (Countess Automated Cell Counter, Life Technologies, USA). Forsøkene ble gjentatt minst to ganger.
Hoechst farging for apoptose analyse
Den apoptotiske virkning av forbindelsene ble analysert ved hjelp av blå fluorescerende fargestoff Hoechst 33342 (Life Technologies). HeLa-celler ble sådd i 6-brønns plater ved en densitet på 5×10
5 /brønn. Cellene ble behandlet med forbindelsene PS 1 og PS 2 løst i DMSO ved en sluttkonsentrasjon på 1 ug /ml. DMSO-konsentrasjonen ikke overstige 0,1% (v /v). Etter 24 timer ble cellene farget med endelig konsentrasjon på 0,5 ug /ml av fargestoffet i PBS i 25 minutter ved en CO
2 inkubator og så observert under et fluorescerende mikroskop (Leica, Sveits).
DNA-ekstraksjon og fragmentering assay
HeLa-celler ble sådd ut ved en densitet på 5×10
6 celler i 100 mm kulturskåler og behandlet med forbindelsene på en endelig konsentrasjon på 1,0 ug /ml. Etter 48 timer ble cellene høstet og lysert i lyseringsbuffer (1% NP-40 i 20 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5). Etter cellelysering, ble supernatanten samlet opp og behandlet med 1% SDS og RNase A (Sigma-Aldrich) ved en sluttkonsentrasjon på 50 ug /ml. Cellene ble inkubert i 2 timer ved 56 ° C. Deretter ble proteinase K (2,5 ug /ml) tilsatt til supernatanten, og prøvene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C. DNA ble utfelt med 3M ammoniumacetat og is-kald etanol til en sluttkonsentrasjon på 70% (v /v). Den oppnådde DNA-pelleten ble oppløst i TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) og underkastet elektroforese på 1,5% agarosegel med etidiumbromid.
Apoptose assay
Induksjon av apoptose ble bestemt ved binding av annexin V-fykoerytrin /7-amino-actinomycin (PE /7-AAD) til cellulær fosfatidylserin. Cellene (1×10
5) ble behandlet med de to forbindelsene ved en konsentrasjon på 0,5-5,0 ug /ml i 24 timer. Disse konsentrasjoner verdiene av saponiner ble valgt for å vise betydelige endringer i antallet av de apoptotiske celler. Konsentrasjonen av DMSO som en kontrollprøve ikke overskride 0,5% (v /v). Cellene ble høstet og farget ved hjelp av Muse Annexin V og Døde Cell Assay Kit (Merck Millipore, Tyskland), etter protokollen gitt av produsenten. Apoptotiske celler ble deretter analysert ved Muse Cell Analyzer (Merck Millipore). Forsøkene ble gjentatt minst to ganger.
Vurdering av mitokondriemembranpotensialet
HeLa-celler ble sådd ut ved en densitet på 1×10
5-celler /brønn og behandlet med de to forbindelser i et konsentrasjon på 1,0 til 10,0 ug /ml. Disse konsentrasjonene verdier ble valgt for å indikere mitokondriell dysfunksjon i den tidlige fasen av celle behandling. Konsentrasjonen av DMSO som en kontrollprøve ikke overskride 1% (v /v). Etter 3 timer med eksponering, ble cellene høstet og forberedt ved hjelp av Muse MitoPotential Kit (Merck Millipore) i overensstemmelse med produsentens protokoll. Prosentandelen av depolariserte /levende celler ble bestemt av Muse Cell Analyzer. Alle forsøkene ble gjentatt minst to ganger.
Real-time PCR
syntese av cDNA og real-time PCR reaksjoner ble utført som beskrevet tidligere [20]. Kort fortalt ble totalt RNA isolert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Nederland) etter produsentens anvisninger. Konsentrasjonen av RNA ble målt og cDNA syntese ble utført ved hjelp av Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA), i henhold til produsentens protokoll.
Real-Time PCR genuttrykk arrays.
cDNA erholdt fra cellene behandles med forbindelsene, så vel som fra cellene behandlet med kontroll kjøretøy, ble påført på den Applied Biosystems TaqMan Array Humant apoptose 96-brønners plater (Life Technologies 4.414.072). Hver plate inneholder 88 analyser for apoptose forbundet gener og 4-analyser for kandidat endogene kontrollgener. PCR reaksjoner ble satt i henhold til produsentens instruksjoner og utføres på ABI7500 Real Time PCR system. De resulterende data ble analysert med ABI 2,05 programvare basert på den komparative DCT-metoden [21]. For å validere arrays resultater, vi uavhengig analysert (med RT-PCR) alt vesentlig endret transkripsjoner samt gener med upåvirket nivåer.
Måling av uttrykket med kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR).
for ytterligere å bekrefte uttrykk for bestemte gener, brukte vi bestemte TaqMan prober (BAX analyse id Hs00180269_m1; BCL2 analyse id Hs00608023_m1; GAPDH analyse id Hs02758991_g1; 18S rRNA analyse id Hs99999901_s1; FADD analyse id Hs04187499_m1; BID analyse id Hs00609632_m1; TNFSF10 analyse id Hs00921974_m1; DEDD2 analyse id Hs00370206_m1; BAD analyse id Hs00188930_m1) og TaqMan One-Step RT-PCR Master MixReagents (Life Technologies) som beskrevet tidligere [22]. De resulterende data ble analysert med ABI 2.05 programvare basert på komparative relativt standardkurve metoden [23].
Western Blot analyse
HeLa-celler ble behandlet med de to forbindelsene PS 1 og PS 2. etter behandling ble cellene høstet og lysert i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Den totale proteinkonsentrasjon ble bestemt ved Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, USA). Prøvene ble separert elektroforetisk ved hjelp av prestained SDS-PAGE-geler (Bio-Rad Laboratories) og overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membraner. Membranene ble holdt ved 4 ° C over natten i 3% BCA (Sigma-Aldrich) i PBS /Tween-20 og deretter inkubert med primære antistoffer ved en av følgende: p-aktin (ab 1801, Abcam, UK), Bud (ab 32060, Abcam), BCL-2 (ab 59348, Abcam), caspase-8 (sc-81661, Santa Cruz Biotechnology, USA). Etter vasking med PBS /Tween-20, ble membranene inkubert med geite-anti-kanin-IgG eller med geit anti-mus IgG HRP-konjugert sekundært antistoff (Bio-Rad Laboratories). Immundeteksjon ble utført med en forbedret chemiluminescence (ECL) deteksjon kit (Bio-Rad Laboratories). Protein merker ble analysert ved anvendelse av ChemiDoc system utstyrt med bilde Lab programvare v. 4.1 (Bio-Rad Laboratories).
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som middelverdier ± standardavvik (SD) . Statistiske sammenligninger av resultatene ble vurdert ved hjelp av t-test.
Resultater
Den saponin forbindelser PS 1 og PS 2 redusert HeLa og HaCaT celler levedyktighet
Effekten av
P
.
quadrifolia
pennogenyl saponiner på cellene levedyktigheten ble undersøkt ved den xCELLigence system som er basert på elektronisk impedansmåling av sensorelektrodene i E-platebrønner, og tillater kontinuerlig, kvantitativ overvåkning av celler [24]. Endringer i celler levedyktighet, nummer, morfologi og graden av adhesjon påvirke elektrode impedans som er beskrevet av en parameter kalt celleindeks (CI) [25, 26]. CI benyttes for å beregne IC50-verdien i hvert målepunkt av forsøket.
HeLa-celler ble behandlet med forbindelsene PS 1 og PS 2 (0,1 til 10,0 ug /ml) i 24 timer. Systemet tillates å vurdere IC50-verdier for hver av forbindelsene. Eksponering av HeLa-celler til saponiner resulterte i en betydelig reduksjon i celleviabilitet. Etter behandling med forbindelsen PS 1 PS og 2, de oppnådde IC50-verdiene var 1,11 ± 0,04 pg /ml og 0,87 ± 0,05 pg /ml, henholdsvis (tabell 1).
IC50-verdiene fra xCELLigence system ble oppnådd på grunnlag av den sigmoidal dose-respons-formel og beregnes ut fra gjentatte eksperimenter (n = 3). For å bekrefte resultatene fra xCELLigence system, utførte vi MTT-analyse ved å bruke det samme konsentrasjonsområde av de to saponiner (0,1 til 10,0 ug /ml) på HeLa og HaCaT-celler. Cellene ble behandlet i 24 timer, og de registrerte IC50-verdiene for forbindelsene ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter (tabell 1).
Den anvendte kontrollprøve med DMSO hadde ingen inhibering effekt på cellene. Våre resultater viser at de to pennogenyl saponiner hadde en doseavhengig og tidsavhengig aktivitet (figur 1 og figur 2). Levedyktigheten av HeLa-celler ble redusert i løpet av inkubasjon av cellene med forbindelsene. I vesentlig grad endrer i cellene adhesjonen ble observert etter 5 timer etter behandling av cellene med saponiner. Den celler levedyktighet også reduseres sammen med høyere konsentrasjoner av PS 1 og PS 2.
Cellene ble inkubert med pennogenyl saponiner PS 1 (A) og PS 2 (B) ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer. De numeriske etikettene på kurvene representerer den økende konsentrasjonsverdiene av forbindelsene (0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ug /ml, henholdsvis).
IC50-verdiene for de saponiner ble beregnet på grunnlag av dose-responskurvene på celle index ved xCELLigence systemet. Feilstolpene representerer standardavviket.
De samme forsøk ble utført på ikke-tumorcellelinje kontroll-human keratinocytter. IC50-verdiene var 1,01 ± 0,01 ug /ml for forbindelsen PS 1 og 0,94 ± 0,04 pg /ml for PS 2 (tabell 1).
Sanntids cellulær analyse og MTT-analysen indikerte kraftigere cytotoksiske effekt av saponin PS 2 på de studerte cellene. Videre ble denne effekten bekreftet av trypanblått eksklusjon analysen.
Effekt av saponiner-indusert celle apoptose
For å bekrefte apoptotisk effekt av de to pennogenyl forbindelser, HeLa celler (etter å ha blitt behandlet for 24 timer) ble farget med annexin V-PE /7-AAD og analysert av Muse analysator. Prosentandelen av apoptotiske celler økte på en doseavhengig måte. De samlede apoptotiske satser (total prosentandel av tidlige og sene apoptotiske celler) for forbindelsen PS 1 var 10,71%, 41,35% og 62,48% for konsentrasjoner 0,5, 3,0 og 5,0 ug /ml, henholdsvis. De apoptotiske priser for det sammensatte PS 2 var 13,80%, 57,37%, 76,12% for konsentrasjoner 0,5, 3,0 og 5,0 mg /ml, henholdsvis (figur 3).
Cellene ble analysert ved flowcytometri hjelp annexin V -PE /7-AAD fargemetoden. Fordelingen av apoptotiske celler ble bestemt i prøven av ubehandlede celler (A), og etter inkubering av cellene med 0,5% DMSO (B), forbindelsen PS 1 (CE) og PS 2 (FH) i en konsentrasjon på 0,5, 3,0 og 5,0 ug /ml, henholdsvis. Cellene ble behandlet i 24 timer, og det totale omfang av apoptose (apoptose sats) ble bestemt i forhold til DMSO-kontroll (I). Hver prøve ble kjørt i triplikat. Feilfelt representerer standardavvik. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen er markert med en «*» (p 0,05).
å estimere endringer i kromatin fordelingen inne i cellene behandlet med de to forbindelser, vi gjorde visualisering av cellulære atomkjerner med Hoechst 33342 fargestoff. Etter farging ble de kromatin kondensasjon og atom fragmentering i HeLa-celler observert sammenlignet med kontrollcellene inkubert med DMSO (figur 4). Eksperimentet bekreftet induksjon av apoptose i celler behandlet med saponiner.
Nuclear kromatin tilstand ble undersøkt med Hoechst 33342-farging etter eksponering av cellene til 1 ug /ml av forbindelsen PS 1 (A) og PS 2 ( B) i 24 timer (konsentrasjon verdi relatert til IC50-verdiene av saponiner). Cellene ble behandlet med saponinene viser kondensert kromatin i forhold til kontrollcellene inkubert med 0,1% DMSO (C). Piler representerer apoptotiske celler.
Videre er resultatene som er tilstede i figur 5 viser uskadet DNA i kontrollcellene, mens forbindelsene behandlede celler viste DNA-fragmentering karakteristisk for apoptotiske kjerner.
baner 1 og 1 a representere DNA av ubehandlede celler; baner 2, 2A – celler behandlet med 0,1% DMSO (ctrl); spor 3 – celler behandlet med forbindelsen PS 1; felt 4-celler behandlet med forbindelsen PS 2. Cellene ble inkubert med forbindelsene ved en konsentrasjon på 1 ug /ml i 48 timer (konsentrasjon verdi relatert til IC50-verdier av forbindelsene). M-DNA ladder (Thermo Scientific).
Den pennogenyl forbindelser PS 1 og PS 2 modulert mitokondriemembranen potensial (ΔΨm) av HeLa-celler
Tap av mitokondrie indre transmembrane potensialet er en pålitelig indikator på mitokondriell dysfunksjon og mobil helse. Denne effekten er ofte observert å være assosiert med de tidlige stadiene av apoptose. Etter behandling av HeLa-celler med de undersøkte forbindelser, ble tilstanden av mitokondrielle membraner av cellene estimeres ved Muse system. Kontrollcellene viste høy fluorescens på grunn av opphopning av det fluorescerende fargestoff innenfor indre membran av intakte mitokondriene. Cellene ble inkubert med økende konsentrasjoner av saponiner viste en nedgang i fluorescens. Prosentandelen av depolariserte /levende celler som ble behandlet med forbindelsen PS 1 var 9,20%, 14,48%, 35,52% for konsentrasjoner 1,0, 5,0 og 10,0 ug /ml, henholdsvis. Verdiene for forbindelsen PS 2 var 8,98%, 35,82%, 47,26% for konsentrasjoner 1,0, 5,0 og 10,0 ug /ml, henholdsvis (fig 6). De oppnådde resultater viser at mitokondrier spille en rolle i induksjon av apoptose i celler behandlet med de to undersøkte saponiner.
Fordelingen av cellene som gjennomgår tap av mitokondriell potensial ble bestemt etter inkubering av ubehandlede celler (A), cellene med 1,0% DMSO (B), forbindelsen PS 1 (CE) og PS 2 (FH) i en konsentrasjon på 1,0, 5,0, 10,0 ug /ml, henholdsvis. Cellene ble behandlet i 3 timer, og graden av mitokondriell celle depolarisering ble bestemt i forhold til DMSO-kontroll (I). Hver prøve ble kjørt i triplikat. Feilfelt representerer standardavvik. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen er merket med en «*» (p 0,05).
De to pennogenyl saponiner økt mRNA uttrykk for FADD og BID i HeLa celler
For å finne ut omfanget av de testede forbindelsene på apoptotiske reaksjonsveier, ble ekspresjonen av 88 relaterte gener testes med qPCR (qPCR human apoptose array). Blant de undersøkte analysene fra denne matrise, for videre eksperimenter to grupper av gener ble valgt ut-av gener hvis ekspresjon ble betydelig endret, og de med ekspresjon sammenlignbar med kontrollgruppen. For å bekrefte resultatene fra PCR-matriser ble sanntids kvantitativ PCR brukt. Analysen viser endringer av mRNA uttrykk for Fas-assosiert død domene (FADD) og BH3 samspill domene død agonist (BID) etter behandling med de to saponiner (Fig 7). I tillegg er det mRNA-nivået av BCL2 tilhørende X-protein (BAX) en signifikant økning i HeLa-celler som var inkubert med forbindelsen PS 1 i 24 timer. Videre, som vist i figur 7, mRNA ekspresjon av død effektor- domene inneholdende 2 (DEDD2), B-celle lymfom protein 2 (BCL2), BCL2 antagonist av celledød (BAD) og tumornekrosefaktor (ligand) superfamilien, delen 10 (TNFSF10) var sammenlignbar med kontrollgruppen.
cellene ble stimulert med forbindelser PS 1 PS og 2 i en konsentrasjon på 1,0 og 0,5 ug /ml, respektivt, og inkubert i 24 timer. De mRNA nivåene ble målt i real-time PCR eksperimenter. Hver prøve ble kjørt i duplikat, og den relative mengde av mRNA ble normalisert til 18S-rRNA-innhold og uttrykt som en fold-endring i forhold til kontrollen (0,1% DMSO). Feilfelt representerer standardavvik. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen er markert med en «*» (p 0,05).
Effekter av saponiner på proteinet ekspresjon av Bcl-2, Bud og procaspase-8
for ytterligere å belyse mekanismen av apoptose i HeLa-celler behandlet med forbindelsene, undersøkte vi protein ekspresjon av Bcl-2, Bud og procaspase-8. Cellene ble inkubert med saponiner i en konsentrasjon på 1 ug /ml og kontrollprøven (0,1% DMSO) i 5 h (punkt i tid når endringene i protein-nivåer var signifikant). Ekspresjonen av proteiner ble påvist ved Western blot.
β
aktin ble brukt som en intern lasting kontroll. De oppnådde resultater viser at saponiner behandling reduserte proteinnivået av Bcl-2 (figur 8A), mens Bid ekspresjon ble øket sammenlignet med kontrollprøven (figur 8B). For å bekrefte rollen til ytre vei av apoptose indusert av forbindelsene, ble endringene i procaspase-8 ekspresjon nivå detekteres. Figur 8C viser betydelig reduksjon i proteinnivået i de behandlede HeLa-celler.
HeLa-cellene ble inkubert med forbindelsen PS 1 PS og 2 i en konsentrasjon på 1,0 ug /ml (konsentrasjonen verdi relatert til IC50 verdiene av saponiner) i 5 timer og ekspresjon av proteiner i de behandlede celler ble bestemt ved Western blot-analyse. PS 1 og PS 2 minsket Bcl-2 (A) og procaspase-8 (55 kDa) (C) protein nivå og øket Bud (B) protein ekspresjon i celler. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og hver proteinnivå var relatert til 0,1% DMSO kontrollprøve. Feilfelt representerer standardavvik. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollgruppen er merket med en «*» (p 0,05).
Diskusjoner
Paris
jordstengler har lenge vært brukt av kinesere som et middel for blødning, mikrobiell infeksjon og inflammasjon [27, 28]. I tillegg har rotstokker blitt mye brukt i kreft forebygging og terapi i tradisjonell medisin [29]. De mange studier har vist at ekstrakter fra
Paris
arter og deres viktigste aktive komponentene-steroide saponiner besitter antitumor egenskaper mot ulike cellelinjer [11, 19, 29-34]. Det er imidlertid bare noen få papirer, som forsøker å utforske mekanismene for cytotoksisk effekt av pennogenyl saponiner, har blitt publisert så langt [11, 14, 19].
I denne studien undersøkte vi effekten av to
P
.
quadrifolia
pennogenyl saponiner på menneskers livmorhalskreft cellelinje HeLa. De testede forbindelser oppviste signifikant antiproliferativ aktivitet mot de humane celler. Resultatene oppnådd i forsøket med RTCA system Resultatene viser at begge saponiner demonstrere en doseavhengig og tidsavhengige inhiberende virkning på proliferasjonen av HeLa-celler. Forbindelsen PS 2 har noe sterkere aktivitet enn PS 1, som kan være forårsaket av forskjeller i molekylet strukturer av saponiner (en ytterligere rhamnose rest i PS 2 sukkerkjede Fig. 9). Analysene av forholdet mellom bioaktivitet av saponiner og kjemiske strukturen tyder på at en del sukker spiller en rolle i aktiviteten av steroid-molekylet [32, 35, 36]. Saponiner med samme steroide delen viser ulike antikrefteffekt. Forbindelser med flere sukkerdelene har sterkere aktivitet mot celler [12].
eksperimenter utført for å bestemme hva slags celledød indikere at de to pennogenyl saponiner indusert apoptose. Apoptose er karakterisert ved typiske morfologiske og biokjemiske kjennetegn, inkludert celle krymping, nukleær DNA-fragmentering og membran blebbing [37]. Det ble ikke observert Alle disse endringene i de celler inkubert med de to testede pennogenyl saponiner. Analysen av cellene behandles med forbindelsene og farget med det fluorescerende fargestoff viser atom fragmentering og dannelsen av kondenserte kjerner. Våre data oppnådd i forsøket med elektroforetisk separasjon av DNA ekstrahert fra de behandlede celler støtte disse observasjonene.
Tidlig kjennetegn på apoptose er tap av plasmamembranen asymmetri hvor molekyler av fosfatidylserin blir translokert fra den indre til den ytre overflaten av cellemembranen, slik at en avhengig fosfolipid-bindingsprotein (annexin V) kan lett binde dem [38-40]. I vår studie observerte vi betydelig økning i befolkningstallet av apoptotiske HeLa celler inkubert med de undersøkte saponiner og denne effekten viste en doseavhengig mønster.
De viktigste trasé som induserer apoptose er de ytre død reseptor sti og egenverdi mitokondrier pathway [41-43]. De ytre signalveier er knyttet til membrandødsreseptorer som tilhører tumor nekrose faktor (TNF) reseptor genet super [44, 45]. Til dags dato er det fettsyresyntetase ligand /reseptor (Fasl /FasR) og TNF-α /TNFR1 modeller best karakteriseres seg. Kobling av Fasl til FasR resulterer i induksjon av apoptose i sensitive celler gjennom rekruttering av adapter molekylær FADD og en FADD-assosiert procaspase-8 til døden reseptor [45-49]. En død indusere signaliserer komplekse DISC former, som fører til celledød [50]. Våre data viser at de to pennogenyl forbindelsene signifikant øket mRNA-ekspresjon av FADD i de behandlede cellene. I tillegg er forbindelsen PS 1 og PS 2 indusert caspase-8 som vist via økt fra procaspase-8-behandling i forbindelsene behandlede HeLa-celler. Aktivering av caspase-8 generert på DISC er noen ganger ikke tilstrekkelig til å generere en caspase signalkaskade sterk nok for gjennomføring av celledød. I dette tilfelle kreves det signal forsterkning via mitokondrier avhengig apoptotiske reaksjonsveier [51]. Proteinet som knytter caspase signalkaskade og mitokondriene er BCL-2 familiemedlem Bud. Den aktiverte form av Bud (tBid) translocates til mitokondriene hvor det fungerer med proapoptotiske proteiner Bax og Bak for å starte utgivelsen av proapoptotiske faktorer fra mitokondriene [52]. I vår studie observerte vi høy økning i BID mRNA og protein uttrykk i HeLa celler inkubert med de testede forbindelser. Interessant, mRNA uttrykk for BAX var mye høyere for PS 1-behandlede celler.
Handlingen i Bud og Bax motvirkes av antiapoptotic BCL-2 familiemedlem som BCL-2 som kan hemme mitokondrie proapoptotiske hendelser [53]. Bcl-2-familien av proteiner påvirkninger på mitokondriemembranen permeabilitet [41, 45, 53] og deltar i dannelsen av porer i membranen. Permeabilitet overgang (PT) er alltid etterfulgt av avbrudd i mitokondrie indre trans potensial ΔΨm [54, 55]. Tap av potensialet blir ofte observert å være assosiert med de tidlige stadiene av apoptose [56-58]. Vår analyse viser at den Bcl-2-protein ekspresjon ble redusert i cellene behandlet for begge forbindelsene.
Videre våre forsøk viser at de to pennogenyl saponiner depolarisert membranpotensialet betydelig i HeLa-celler på en doseavhengig måte . Dette bekrefter involvering av den indre mitokondriene veien i celle apoptose.
I denne studien, analyserte vi mekanismene for antitumor-virkningen av de to saponiner og konkluderer med at både den ekstrinsiske reaksjonsvei død reseptoren og intrinsiske reaksjonsvei spiller en rolle i den apoptotiske virkning av forbindelsene i HeLa-celler. De spesielle signalveier i celledød kreve ytterligere undersøkelser særlig ettersom de to pennogenyl komponenter isolert fra
P
.
quadrifolia
jordstengler kan være en potensiell medikament i behandlingen av menneskelige livmorhalskreft.
