Abstract
follistatin (FST), en follikulogenesen regulere protein, er funnet i relativt høye konsentrasjoner i kvinnelige eggstokkene vev. FST fungerer som en antagonist til aktivin, som ofte er forhøyet i human eggstokk-karsinom, og kan således tjene som et potensielt mål for terapeutisk intervensjon mot kreft i eggstokkene. Den brystkreft mottakelighet genet en
(BRCA1
) er en kjent tumor suppressor genet i menneskets brystkreft; men dens rolle i eggstokkreft er ikke godt forstått. Vi utførte microarray analyse på menneskelig ovarialcancer cellelinje SKOV3 som stabilt overuttrykker villtype BRCA1 og sammenlignet med tilsvarende tom vektor-transfekterte kloner. Vi fant at stabile uttrykk for BRCA1 ikke bare stimulerer FST sekresjon men også samtidig hemmer activin uttrykk. For å bestemme den fysiologiske betydningen av dette fenomen, vi videre undersøkte effekten av cellulær BRCA1 på FST sekresjon i udødelig ovarial flate epitel (IOSE) celler avledet fra enten normale humane eggstokker eller eggstokker av en ovarial cancer pasient som bærer en mutasjon i
BRCA1
genet. Knock-down av
BRCA1
i normale celler IOSE demonstrerer nedregulering av FST sekresjon sammen med den samtidig oppregulering av aktivin uttrykk. Videre knock-down av
FST
i IOSE cellelinjer, så vel som SKOV3-cellelinjen viste signifikant redusert celleproliferasjon og nedsatt cellemigrering når sammenlignet med de respektive kontroller. Dermed disse funnene tyder på en ny funksjon for BRCA1 som en regulator av FST uttrykk og funksjon i menneske eggstokkene celler
Citation. Karve TM, Preet A, Sneed R, Salamanca C, Li X, Xu J, et al. (2012) BRCA1 Regulerer follistatin Funksjon i Eggstokkreft og menneske Ovarian Surface Epitelceller. PLoS ONE 7 (6): e37697. doi: 10,1371 /journal.pone.0037697
Redaktør: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 1 juli 2011; Godkjent: 26 april 2012; Publisert: 01.06.2012
Copyright: © 2012 Karve et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Tapas Saha er takknemlig for American Cancer Society (IRG # 97-152-16-2), Fisher Senter for Familiær Cancer Center, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University for økonomisk støtte. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health Grants 1U56CA101429-01 (til Dr. Peter Shield, Deepak Kumar og Dr. Carolyn fetter). Eliot M. Rosen har vært støttet delvis av forskningsmidler fra USPHS (R01-CA150646), Susan G. Komen for Cure (KG110580), Living in Pink, og World Class Universitetet program finansiert av Kunnskapsdepartementet , Vitenskap og teknologi gjennom National Research Foundation of Korea (R31-10069). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en av de ledende gynekologisk kreft i USA med 22,280 estimerte nye tilfeller og 15.500 dødsfall i 2012 (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/ovarian; vurderes februar 2012). Høy dødelighet for eggstokkreft er i hovedsak knyttet til sent stadium diagnostisering av sykdom; nesten 60-65% av eggstokkreft tilfeller er diagnostisert når kreften allerede har spredning utover rammen av eggstokkvev. Tidlig påvisning av kreft i eggstokkene er vist i betydelig grad øke pasientens levetid til så høyt som 85% [1]. Det er således et behov for å utvikle biomarkører som kan være nyttig i påvisning av kreft i eggstokkene i tidlige stadier av sykdommen. Mest eggstokkreft skje innenfor eggstokkene overflaten epitel (OSE) og dermed undersøkelser ved hjelp av OSE celler avledet fra både normale individ og eggstokkreft kreftpasienter er avgjørende for å belyse etiologi av menneskelig eggstokkreft. Interessant, har bare 5-10% av kvinner med eggstokkreft nedarvede genetiske mutasjoner i tumorsuppressorgener som
BRCA1 Hotell og
BRCA2 Hotell som predisponerer dem til brystkreft og eggstokkreft [2], [ ,,,0],3], [4]. I tillegg er en koplingsgruppe kohortstudie som består av 214 brystkreft og bryst-eggstokk kreft familier sammen, viste at 90% av pasientene næret mutasjoner i sitt
BRCA1
genet [5]. Videre
BRCA1
mutasjon (er) bære kvinner har ca 15 ganger større risiko for å utvikle eggstokkreft sammenlignet med sine ikke-bære kvinnelige kolleger [6], [7].
follistatin ( FST), en autokrin enkeltkjedet glykoprotein blir uttrykt i nesten alle humane vev slik som nyre, hjerne, livmor, bryst og med den høyeste konsentrasjonen som finnes i humant ovarievev [8]. Moden, finnes utskilt form av FST protein i tre isoformer; full lengde, mellomliggende og korteste bestående av 315, 303 og 288 aminosyrer henholdsvis [9]. FST, opprinnelig isolert fra follikulær væske ble funnet å samvirke med aktivin, et medlem av den transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) superfamilien. Aktivin har vist seg å regulere celleproliferering, differensiering, angiogenese, så vel som apoptose, og kan således være muligens er involvert i regulering av ovarial tumorvekst [10]. Forhøyede nivåer av aktivin detekteres ikke bare i de fleste av epitel-opprinnelse ovarietumorer men også i serumprøvene samlet opp fra de epiteliale kreftpasienter eggstokkene. Høye nivåer av activin antas å være ansvarlig for å fremme sykdomsutvikling og er prediktive for verste sykdom prognose for eggstokkreft pasienter [10]. FST binder seg til activin i en antagonistisk måte og forhøyet uttrykk av celle FST kan fører til cytobeskyttelse rolle i eggstokkene kreftpasienter. En fersk studie har vist at transient transfeksjon med villtype (wt)
FST
ble vist å hemme metastase i liten celle lungekreft cellelinjer [11]. I motsetning til dette, betydelig høyere (P 0,05) konsentrasjoner av FST er rapportert i eggstokkkreftpasienter sammenlignet med alderstilpassede friske frivillige
medlemmer av TGF-ß-superfamilien er blitt vist å modulere veksten av. normale menneskelige eggstokkene epitelceller
in vitro product: [12], [13]. Således har de mutasjonene i TGF-ß-reseptorer eller deres intracellulære signalmolekyler som Smad proteiner blitt implisert i utviklingen av flere typer kreft [14], [15], [16], [17], [18], inkludert human ovariecancer [19], [20], [21]. Et annet medlem av TGF-ß-superfamilien, inhibin, er en funksjonell antagonist av aktivin og har vist seg å modulere veksten av normal human ovarial epitelial [22], [23]. Inhibiner, produsert av menneskelige gonadene, spille avgjørende rolle i å dempe activin-regulert signalering i menneskelig gonodal system [22]. Inhibin aktiveres ved nærværet av en ko-faktor, beta-glykan, som i sin tur konkurrerer med aktivin til å binde med aktivin reseptorer (Atria og ActRIIB), således antagonisering aktivin-regulert signalkaskade [24]. Videre har total inhibin blitt foreslått som en potensiell serum markør for epitelisk opprinnelse human ovarian cancer. I tillegg follistatin relatert gen protein (FLRG), som viser en sterk homologi med FST, og er blitt vist å interagere og blokkere funksjonen av TGF-ß-superfamilien ligander inkludert aktivin, benmorfogenetisk protein (BMP) -2, BMP-6 , BMP-7, og GDF-8. FLRG er først og fremst uttrykt i hjerte, lunge, nyre, og morkaken og kan bli stimulert av TGF-SS, activin og Smad proteiner [25]. FLRG uttrykk er rapportert å være svært variabel i flere cancerlinjer og vev. En fersk studie viste at nedregulering av FLRG hemmer human brysttumorvekst [26].
Flere studier har foreslått at den målrettede terapeutiske strategier, spesielt molekylære meklere som ned-regulerer endogene activin uttrykk nivåer kan forsinke eller hemme kreft progresjon [27]. Dermed vil en mulig rolle som en FST aktivin antagonist i patogenesen av kreft i eggstokkene krever videre undersøkelse. I denne studien brukte vi foreviget eggstokkene overflaten epitel (IOSE) celler fra normal menneskelig eggstokk (IOSE 7576 og IOSE 397) og fra en eggstokkreft pasient med
BRCA1
mutasjon, IOSE 592F, for å undersøke hvilken rolle BRCA1 ved formidling av FST sekresjon i disse cellene. Vi har også bygget flere stabile BRCA1 kloner i SKOV3 eggstokkene adenokarsinom cellelinje som ectopically uttrykker BRCA1 protein (
dvs.
BRCA1-SKOV3). Vi opprinnelig utført microarray analyse ved hjelp av BRCA1-SKOV3 klone og kontrollere neo klone å identifisere tidlige biomarkører i eggstokkreft. Deretter validert vi våre resultater ved hjelp av sanntids-PCR-analyse og fant at
FST Hotell og
SMAD6
var oppregulert i BRCA1-SKOV3 klone # 19, så vel som i hele IOSE cellen linjer. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at et tap eller redusert nivå av FST sekresjon i eggstokkene celler kan potensielt tjene som en markør for menneskelig eggstokkreft kreftutvikling.
Metoder
Ekspresjonsvektorer og reagenser
villtype (wt) BRCA1 ekspresjonsplasmid ble skapt ved kloning av cDNA inn i BRCA1 pcDNA3-vektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved anvendelse av kunstig konstruerte 5 «
Hind III
og 3′
Ikke
I områder [28]. Dimetylsulfoksyd (DMSO), ß-merkaptoetanol, og alle andre kjemikalier ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO) med mindre annet er angitt.
Cellelinjer og dyrkningsbetingelser
SKOV3-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FCS), ikke-essensielle aminosyrer (100 mM), L-glutamin (5 mM), streptomycin (100 mg /ml) og penicillin (100 U /ml) (alle fra Lonza, Inc., Walkers, MD). Cellene ble holdt ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 og sub-dyrket to ganger i uken, ved hjelp av trypsin (Lonza) [29]. Stabile BRCA1-SKOV3 kloner, samt tom-vektor transfekterte (Neo) stabile kloner ble generert via transfeksjon med de aktuelle vektorer etterfulgt av valg med Geneticin (Invitrogen).
Udødelig Ovarian Surface epitel (IOSE) celler
de foreviget cellelinjer (IOSE 7576, IOSE 397 og IOSE 592F) var slags gave fra Dr.Nelly Auersperg av den kanadiske eggstokkvev Bank (University of British Columbia, Vancouver, Canada). Kort sagt ble ovarie overflate-epitelceller skrapet fra human ovarian overflate vev og dyrket i 01:01 blanding av medium 199 (Invitrogen) og MCDB 105 (Sigma) supplementert med 10% FBS, NaHCO3 (2,2 g /l), L-glutamin ( 5 mM), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (alle fra Invitrogen). Lav-passasje kulturer av isolerte menneskelige eggstokkene overflaten epitel celler ble deretter udødeliggjort ved transfeksjon med SV40 stor T antigen viruspartikler [30]. De morfologiske egenskaper og vekstmønster av IOSE cellelinjer ble sett for å etterligne overflaten på eggstokkene epitelceller i de ekstracellulære matriser. Videre IOSE celler viser sterk morfologisk likhet med de tidlige neoplastiske eggstokkceller hos mennesker og dermed fungere som en utmerket modell for
in vitro
studiene fokuserte på menneskelig eggstokkreft kreftutvikling [30], [31].
Affymetrix oligonukleotid mikromatriser
Affymetrix microarray-analyser ble utført ved Georgetown University Lombardi kreftsenter Genomics og Epigenomics Shared Resources kjernefasilitet. RNA-isolering, cDNA-syntese, gen-chip hybridiseringer, og dataanalyse ble utført som beskrevet tidligere [32]. Den tomme vektoren og stabil BRCA1 klonen i SKOV3-celler som ble brukt til å generere mikroarray data grundig beskrevet i vår tidligere manuskript [32]. Genet sjetonger brukes for disse eksperimentene var Human Genome U133 Plus 2.0 Array. All microarray data var MIAME (Minimum informasjon om en microarray eksperiment) kompatibel og rådata er blitt deponert i Gene Expression Omnibus database (GEO) som beskriver i vår tidligere manuskript [32]. Sjonsnummer for innsending er GSE30296. Hierarkisk clustering av utvalgte gener ble gjort som før [32].
Transient transfections
prolifererende SKOV3 celler ble transfektert natten med de angitte ekspresjonsvektorene (4-6 mikrogram av plasmid DNA per brønn en 6-brønns plate eller 20-25 pg pr 100 mm skål) ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som tidligere beskrevet [29], [33]. Neste dag ble cellene vasket med 1 x PBS, etterfulgt av inkubasjon med ferskt kulturmedium for opp til 24-48 timer for genekspresjon.
Lie interfererende (si) RNA-behandling
asynkront prolifererende celler var forbehandlet med genspesifikke siRNA (100 nM i 72 timer) under anvendelse av SIPORT Amine (Ambion, Foster City, CA). Effektiviteten av knock-down ble bekreftet via immunoblotting for mål-protein (er). Følgende sirnas ble brukt i denne studien: kontroll siRNA [ON-TARGET
pluss
Non-måls siRNA (Cat # D-001810-01, Dharmacon, Chicago, IL)]; FST spesifikke siRNA ble innhentet fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; BRCA1-spesifikke siRNA [pott på to tilpassede syntetisert siRNA fra Dharmacon (sekvenser 5 «→ 3» CAGCTACCCTTCCATCATA og CTAGAAATCTGTTGCTATG)]. Både FST og BRCA1 siRNA var målrettet mot ORF av de respektive genene
Semi-kvantitativ revers transkriptase -. Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) analyse
Semi-kvantitative RT-PCR-analyser ble utført som beskrevet tidligere [29]. I korthet ble cellene behandlet som angitt ovenfor, og total RNA ble ekstrahert ved bruk av RNase Easy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Aliquoter av total RNA (50 ng) ble reverstranskribert ved anvendelse av 50 enheter av Superscript III revers transkriptase (Invitrogen) i et reaksjonsvolum på 20 ul. Semi-kvantitativ PCR-amplifikasjon ble utført ved å bruke 1 pl alikvot fra hver prøve av den transkribert cDNA, ved hjelp av varm-start Taq-polymerase (Denville, South Plainfield, NJ). DNA ble først denaturert i 5 minutter ved 95 ° C, og så forsterket ved hjelp av sykluser med 30 sek ved 95 ° C, 30 sek ved den bestemte glødetemperatur, og 1 min ved 72 ° C, og endelig 10 minutters inkubering ved 72 ° C . Syklusen Tallet ble justert slik at alle reaksjoner var innenfor det lineære området av PCR-produkt forsterkning. Forover og revers primere brukt, annealing temperaturer og forventede størrelser av PCR-produktene er vist i tabell 1. Kvantitativ bety analyse fra minst tre uavhengige eksperimenter er representert sammen med standard feil av måling (± SEM).
Kvantitativ sanntids-PCR (Q-PCR) analyse
Q-PCR ble utført av ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) med SYBR Grønn PCR Master blande reagensen (Applied Biosystems) i et 25 pl reaksjonsvolum. 10 ng av cDNA-prøver med egnede genspesifikke primere ble benyttet for hver PCR-analyse. Syklus terskelverdier ble automatisk justert, og brette endringer for hvert par av genspesifikke primere ble bestemt. Q-PCR primere er oppført i tabell 1 og ble hentet fra Real Time Grunning, LLC., Elkin Parker, PA.
Western blotting
Celler ble behandlet som indikert og helcellelysater var forberedt som tidligere beskrevet [34]. Kort sagt ble etter behandling vaskes cellene med 1 x PBS og lysert ved hjelp av radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer (ROCHE, Indianapolis, IN) supplementert med fullstendig Mini, EDTA-fri protease inhibitor cocktail tablett (Roche) på is i 10 min. De lyserte celler ble rystet ved 4 ° C i 20 min, fulgt av sentrifugering ved 12.000 x g i 20 min. Aliquoter av protein (50 ug) i 4X LDS (litium-dodecyl-sulfat) prøvebuffer (Invitrogen) ble analysert på de forhåndsstøpt 4-12% Bis-Tris (BT) geler (Invitrogen). Den fraksjonerte proteiner ble så overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA) og blokkert i en time i 5% ikke-fettholdig melk i 1X PBS-Tween 20. Membranene ble deretter inkubert med angitte primære antistoffer, og etterfølgende med artsspesifikke pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz). Utslettet proteiner ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (Santa Cruz). De primære antistoffene som ble brukt var: BRCA1 (C-20, Santa Cruz, 1:200); FST (K-19, Santa Cruz, 1:100); Actin (C-11, Santa Cruz, 1:400), og activin (ab89307, Abcam, Cambridge, MA, 1:1000).
follistatin analysen
Kvantitativ påvisning av celle FST nivåer var utføres ved hjelp av Menneskelig Quantikine immunoassay FST-sett (R lysert ved å bruke en lysis-buffer bestående av fluorescerende CyQuannt GR fargestoff, og den totale fluorescens av de migrerte celler ble kvantifisert ved anvendelse av en Victor 1420 fluorescens mikroplateleser (Perkin-Elmer Wallac, Inc., Waltham, MA) med dobbelt bølgelengde (480-520 nm ). De observerte fluorescensenheter (FU) er direkte proporsjonal med antall celler migrert; høyere observert fluorescens høyere cellemigrasjon. En standardkurve ble konstruert for hver cellelinje ved hjelp av en trinnvis celletetthet i henhold til produsentens instruksjoner, og data innhentet fra standardkurven fra hver cellelinje (behandlet /ubehandlet) er representert som betyr ± SEM.
Cell spredning analysen
FITC BrdU flyt kit fra BD Pharmingen (San Jose, California) ble brukt til å utføre celleproliferasjonsprosesser analyser med IOSE cellelinjer som per produsentens instruksjoner. I korthet, ble 10 uM av BrdU tilsatt til asynkront voksende celler i logaritmisk fase for en time til puls cellene. Cellene ble deretter fast og permeabilized bruker BD cytofix /Cytoperm buffer (følger med settet), og deretter behandlet med DNase å avsløre BrdU. FITC-antistoff ble så brukt til å detektere BrdU, og deretter cellene ble utsatt for et strømningscytometer FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA) og parametrene var satt i henhold til produsentens instruksjoner. FACS analyse ble gjort i flowcytometri og celle sortering delte ressurser på Lombardi Cancer Center, Georgetown University. Data innhentet var representert som betyr ± SEM av prosent BrdU merkede cellene.
Statistisk analyse
Det ble statistisk analysert ved «En måte variansanalyse (ANOVA) via Tukey Test», data som er en parvis sammenligning av gjennomsnitts reaksjoner på de ulike behandlingsgruppene ved hjelp SigmaStat statistisk programvare (Ver 3 for windows). En verdi på P 0,05 eller mindre ble betraktet som signifikant for alle forsøkene
Resultater
Stall uttrykk for BRCA1 i SKOV3 cellelinje
I motsetning til brystkreft, er det ingen godt. vitskape retningslinjer knytte
BRCA1
mutasjoner og individets predisposisjon for å utvikle eggstokkreft. Her har vi brukt menneskelig eggstokkreft cellelinje (SKOV3) som forelder eggstokkreft cellelinje og genererte flere stabile kloner som ectopically uttrykt wtBRCA1 (BRCA1-SKOV3) og tom bakgrunn vektor, pcDNA3 (Neo). Som vist i figur 1A, # 4, # 18 og # 19 kloner av BRCA1-SKOV3 viser en signifikant økning i ekspresjonen av BRCA1 (P 0,05) sammenlignet med foreldre SKOV3-celler, så vel som tilsvarende Neo kloner. Den densitometrisk analyse fra tre uavhengige Western blot er vist i figur 1B som middel ± standard feil av måling (SEM). Dermed vil generasjon SKOV3 sub-cellelinjer med stabil BRCA1 uttrykk videre bistå i å forstå effekten av BRCA1 i menneskelig ovarialcancer.
(A) Flere stabile linjer ble opprettet ved hjelp av overekspresjon av BRCA1 og dens bakgrunn vektor, pcDNA3 i SKOV3 ovarialcancer celler. Expression nivåer av BRCA1 er vist i alle cellekloner. Foreldre indikerer ikke-transfekterte SKOV3 celler bare. Densitometrisk analyse fra tre uavhengige immunoblot er gitt i (B). Feil barer er SEM. * Representerer P 0,05 (i forhold til foreldre)
Differensial genuttrykk grunn av BRCA1 overekspresjon i SKOV3 celler
På bakgrunn av BRCA1 uttrykk for # 19 klone av BRCA1-SKOV3 (. heretter omtalt som BRCA1-SKOV3 klone # 19) ble valgt, og sammen med # 3 av Neo klone (heretter omtalt som Neo klone # 3) for Affymetrix microarray analyse. RNA fra tre separate kultur passasjer av BRCA1-SKOV3 klon # 19-celler og Neo klon # 3-celler ble isolert og utsatt for mikromatriseanalyse (se metoder for detaljer). Deretter konstruerte vi et hierarkisk gruppering av genekspresjon som var signifikant (P 0,05) er endret i BRCA1-SKOV3 klon # 19-celler og sammenlignet med Neo klon # 3-celler. Vi har observert over 10 brette opp-regulering i 274 gener, og mer enn fire ganger ned-regulering i 279 gener for BRCA1-SKOV3 klon # 19-celler sammenlignet med Neo klon # 3 (se tabell S1, så vel som tilsvarende varmekartet på fig S1 ). Ved hjelp av denne microarray data, Oppfinnsomhet Pathway analyse viste at BRCA1 overekspresjon i SKOV3 celler (BRCA1-SKOV3 klone # 19) modulerer flere kritisk viktig signal og metabolske veier (se tabell S2 for oppregulert gener og tabell S3 for nedregulert gener i BRCA1-SKOV3 klone # 19). Listen av gener ble ytterligere redusert til utvalgte 40 gener basert på om lag 3 fold-endring i uttrykket nivåer i forhold til kontroll, og med betydelige p-verdier (P 0,05). De utvalgte grupper av gener ble funnet å være hovedsakelig ansvarlig for cellevekst, cellesyklusprogresjon og oksidativt stress respons, som var av primær interesse for denne studien. Hierarkisk clustering var slengt bruke disse valgte 40 gener datasett for oppregulert (rød) eller nedregulert (grønn) gener grunn wtBRCA1 overekspresjon i BRCA1-SKOV3 celle klon # 19 (figur 2). De resulterende to klynger av gener sammen med sin fold-endring og p-verdi er gitt i panel av figur 2. høyre
En varme kart som viser vesentlige endringer i en gruppe utvalgte gener som skyldes overekspresjon av wtBRCA1 i SKOV3 ovarialcancer celler. Tre uavhengige mikroarray analyser ble utført. To grupper ble påvist, en på grunn av nedregulering av gener (grønn) og annen på grunn av opp-regulering av genene (rød). Ganger endring og p-verdiene av genene i klyngene er gitt på høyre
FST, en motstander av activin, er ansvarlig for tidlig eggstokk utvikling.; men ikke mye er kjent om den cellulære regulering av FST i menneskelig eggstokkvev. Forhøyet FST nivå i menneskelige eggstokkene celler er foreslått å være cytoprotective mot eggstokkreft kreftutvikling. Vi har observert 51,6 ganger høyere ekspresjon av FST i BRCA1-SKOV3 klon # 19 sammenlignet med Neo klon # 3-celler. Inhibin ble også funnet å være signifikant (P 0,05) oppregulert (11,6 ganger) i BRCA1-SKOV3 celler. Flere studier har antydet den potensielle rolle inhibin som en biomarkør for kreft i eggstokkene av epitelial opprinnelse [35]. Noen få studier foreslår inhibin som et serum markør i eggstokkene kreft avdekket at inhibin nivåer er forhøyet i ca 70-80% av eggstokkreft pasienter mucinous type, og i 15-35% av ikke-mucinous typen epitelial eggstokkreft tilfeller [36] [37]. Studier har videre vist at i de post-menopausale kvinner, kan total inhibin kombineres med CA-125 for effektiv diagnosen eggstokkreft epitelial kreftutvikling [35].
I tillegg har vi funnet ut at flere andre medlemmer av TGF β familie slik som TGF-SS2, TGF-ßR1, TGF-ßR3 og en hemmende SMAD, SMAD6, ble også oppregulert i BRCA1-SKOV3 klon # 19 (figur 2). Dermed blir hierarkiske clustering tilnærming var ikke bare i stand til å bekrefte antall av tidligere kjente mulige markører i eggstokk-kreft, men også avdekke flere andre putative molekylære mål som kan være av interesse for utforming av målrettet behandling av human ovarian cancer.
Validation av Affymetrix microarray resultatene etter semi-kvantitativ RT-PCR
Vi har brukt RT-PCR for å validere resultatene fra microarray analyse. Tre individuelle stabile kloner for hver Neo og BRCA1-SKOV3 cellelinjer ble brukt for å utføre semikvantitativ RT-PCR. Vi fant en signifikant korrelasjon (P 0,05) mellom microarray og RT-PCR resultater. Figur 3A viser representative mRNA uttrykk de angitte genene i alle grupper av celler. Figur 3B viser kvantitativ estimering av mRNA uttrykk for alle de gener under undersøkelse basert på minst tre uavhengige eksperimenter. I alle tilfeller, mRNA-ekspresjon av FST var signifikant (P 0,05) høyere i BRCA1-SKOV3 kloner sammenlignet med Neo-kloner, å validere resultatene observert i mikromatriseanalyse, selv om det er nødvendig å merke seg at graden av folden-endringen er variabel ; muligens på grunn av forskjell i følsomheten av disse to teknikker. BRCA1-SKOV3 klone # 19 viste maksimal oppregulering av BRCA1 blant de stabile cellelinjer; derfor alle påfølgende eksperimenter ble utført ved bruk av denne klon, som vist ovenfor, og ble sammenlignet med Neo klon # 3. I tillegg RT-PCR også bekreftet oppregulering av SMAD6 i BRCA1-SKOV3 klon # 19 (figur 3A). Videre undersøkte vi effekten av transient ekspresjon av BRCA1 i foreldre SKOV3-celler. Resultatene er vist i figur 3C er i overensstemmelse med resultatene som ble observert på figur 3A og 3B. FST mRNA-ekspresjon ble funnet å være signifikant (P 0,05) høyere hos BRCA1 overuttrykt SKOV3-celler når sammenlignet med bakgrunnsvektor transfekteres (pcDNA3) samt sperre SKOV3-celler. I tillegg ble mRNA uttrykk for SMAD6 også forhøyet i de wtBRCA1 overekspresjon celler (figur 3C). Densitometri av ekspresjonen av genene av interesse fra minst tre uavhengige eksperimenter er vist i figur 3D.
(A) Former stabile kloner av både Neo (pcDNA3-SKOV3) og wtBRCA1 (BRCA1-SKOV3) ble høstet for semikvantitativ RT-PCR-analyse som beskrevet under «Metoder». Bånd tilsvarende de respektive genene er angitt på høyre side. (B) PCR-bånd fra tre uavhengige eksperimenter for hver indikerte gener ble kvantifisert ved densitometri og mRNA-nivåer ble normalisert til aktin. (C) prolifererende SKOV3-celler ble transient transfektert enten med wtBRCA1 eller bakgrunn pcDNA3-vektoren og de isolerte RNA ble analysert ved semi-kvantitativ RT-PCR. Resultatene ble kvantifisert som beskrevet ovenfor og representert ved stolpediagram (D). Feil barer er SEM. * P. 0,05 (i forhold til hver kontroller)
BRCA1 regulerer FST sekresjon i SKOV3 ovarian carcinoma celler
FST er utskilt av eggstokkene follikulær væske i den ekstracellulære regionen, og er avgjørende for tidlig eggstokk utvikling [38].
In vitro
eksperiment med dyrkede eggstokkceller stille differensial nivåer av FST sekresjon i kulturmediet avhengig cellen behandlinger og kulturforhold. Således, et fortynnet medium tjener en god kilde for å måle sekresjon og ekspresjon av FST i en bestemt celletype. Figur 4A viser en standardkurve erholdt med det rensede FST-proteinet, som ble anvendt for å kvantifisere mengden av utskilte FST i prøvene som undersøkes. Våre resultater viser at BRCA1 ekspresjon i SKOV3-celler viser omtrent to ganger høyere utskilt FST sammenlignet med pcDNA3-transfekterte celler (figur 4B). I tillegg utførte vi tilsvarende kvantitativ FST-analyse ved hjelp SKOV3 cellene der i BRCA1 ble slått ned av BRCA1-spesifikke siRNA. Figur 4C viser minst 50% reduksjon i FST ekspresjon i BRCA1 knock-down-celler sammenlignet med celler behandlet med kontroll siRNA. Deretter utførte vi den samme FST analysen med de stabile BRCA1 cellekloner i SKOV3-celler som beskrevet tidligere. BRCA1-SKOV3 klone # 19 celler viste økt FST sekresjon enn neo-klone # 3, som forventet (figur 4D). Videre har vi også undersøkt utskilte nivåer av FST i de stabile linjer følgende nedregulering av BRCA1 i samme. Nedregulering av BRCA1 i enten Neo klon # 3 (figur 4E) eller BRCA1-SKOV3 klon # 19 (figur 4F) signifikant (P 0,05) hemmet utskillelsen av FST i cellekulturmedium, sammenlignet med deres respektive kontroller. Protein ekspresjonsnivåene av BRCA1 i alle de ovennevnte prøver er vist i figur 4G. Data fra denne kvantitative FST analysen tyder på at induksjon i cellulære BRCA1 nivåer i sin tur stimulerer ekstracellulære FST sekresjon i menneske eggstokkreft celler.
(A) Standard kurve ble generert med renset humant FST som angitt i «metoder» som ble anvendt for å kvantifisere ukjente FST-konsentrasjonene i de angitte eksempler. SKOV3-celler ble transfektert som før, enten for BRCA1 overekspresjon (B) eller for BRCA1 underexpression (C), og FST-bestemmelser (se fremgangsmåter) ble utført med fortynnet kulturmediet. Det samme FST Analysen ble utført med de stabile kloner som indikert (D) samt med de stabile cellene der uttrykk for BRCA1 ble slått ned av BRCA1-siRNA (E-F). Feil barer er SEM. * P 0,05 (i forhold til hver kontroll).
