Abstract
Bakgrunn
Aktivering av autofagi har blitt grundig beskrevet som en pro-overlevelsesstrategi, noe som bidrar til å holde cellene i live etter berøvelse av næringsstoffer /vekstfaktorer og andre stressende cellulære forhold . I tillegg til cellebeskyttende effekter, kan autophagy følge celledød. Autophagic vakuoler kan observeres før eller i løpet av celledød, men rolle autophagy i dødsprosessen er fremdeles kontroversiell. En kompleks samspill mellom autofagi og apoptose har kommet frem i lyset, tatt i betraktning at mange gener som p53 og BCL-2 familiemedlemmer, er delt mellom disse to banene.
metodikk /hovedfunnene
i denne studien viste vi en potent og irreversibel cytotoksisk aktivitet av stallen Curcumin derivat
bis
-DeHydroxyCurcumin (bDHC) på humane tykktarmskreftceller, men ikke på menneskelige normale celler. Autophagy utløses av bDHC før celledød som demonstrert av økt autophagosome formasjon -measured ved elektronmikroskopi, fluorescerende LC3 puncta og LC3 lipidation- og autophagic flux -measured ved å forstyrre LC3-II omsetning. Oppbyggingen av poly-ubiquitinmolekyler og ER-stress skjedde oppstrøms autofagi induksjon og resulterte i celledød. Cellesyklus og Western blot analyser markert aktivering av en mitokondriell-avhengig apoptose, som innebærer kaspase 7, 8, 9 og Cytokrom C frigivelse. Ved hjelp av farmakologiske hemninger og RNAi eksperimenter, viste vi at ER-stress indusert autofagi har en viktig rolle i å utløse bDHC-celledød.
Konklusjon /Betydning
Våre funn beskrive mekanisme som bDHC fremmer svulst selektiv hemming av spredning, gir utvetydig bevis på rollen til autofagi i kontrast spredning av tykktarmskreftceller
Citation. Basile V, Belluti S, Ferrari E, Gozzoli C, Ganassi S, Quaglino D, et al. (2013) bis-dehydroksy-Curcumin Triggere mitokondrie-Associated celledød i menneske Colon kreft celler gjennom ER-stress indusert Autophagy. PLoS ONE 8 (1): e53664. doi: 10,1371 /journal.pone.0053664
Redaktør: Regine Schneider-Stock, Institutt for patologi, Tyskland
mottatt: 12. juni 2012; Godkjent: 03.12.2012; Publisert: 11 januar 2013
Copyright: © 2013 Basile et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-MFAG (tilskudd nummer 6192 til CI) og Fondazione Cassa di Risparmio di Vignola til CI og EF. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
apoptose, også kjent som type i celledød, er det best beskrives mekanismen for celledød, og er morfologisk kjennetegnet ved cellekrymping, membran blebbing, nukleær kondens og dannelse av apoptotiske legemer [1]. En energiavhengig kaskade av molekylære hendelser som koordinerer den apoptotiske prosess, som kan skilles i to hovedveier: den ekstrinsiske reaksjonsvei død reseptoren og den indre mitokondrie reaksjonsvei. De to veier synes å være koblet sammen, og påvirket hverandre, og begge utløse aktivering av kaspaser 3, 6 og 7, proteaser som målretter hundre proteiner og som fører til celle riving [2].
Dess apoptose, autophagy har vært beskrevet som et alternativt selv-ødeleggende cellulær prosess. Autophagy har vært lenge kjent for å tilveiebringe celleoverlevelses følgende næringsstoffer /vekstfaktorer mangel eller andre stressende forhold, og bare mer nylig har det vært knyttet til celledød. Også kjent som type II celledød, er autophagy aktivering karakterisert ved tilstedeværelse av autophagic vakuoler i cytoplasma, og utvidelse av det endoplasmatiske retikulum (ER) og Golgi-apparatet [3]. Dobbel-membraned autophagic vesikler kapsle cytoplasma og organeller, og etter deres fusjon med lysosomer, autophagolysosomes degradere innholdet [4]. Den klassiske autofagi pathway fungerer nedstrøms av mTOR (mammalian target of rapamycin) kinase. Når dette Ser /Thr kinase er forbundet i mTORC1 proteinkompleks, er det i stand til å undertrykke autophagic maskineri. 16 Autophagy-relaterte (ATG) proteiner har blitt beskrevet til å delta i den autophagy sti [5], og de fleste av dem spiller en rolle i den komplekse prosessen med dobbel-membraned vesikler dannelse og vekst, nedstrøms for mTORC1 [6]. Selv om inhibering av mTORC1 veien er den best kjente mekanisme som autophagy induseres, kan mange andre signaleringskaskader og transkripsjonelle arrangement være involvert i aktivering av autophagic prosessen. Spesielt forskjellige kinaser styre ulike trinn av denne katabolsk prosess, slik som AMP-aktivert proteinkinase, Akt, mitogen-aktivert protein kinase (ERK, JNK og p38) og proteinkinase C [7].
rollen til autophagy i celleoverlevelse i stedet for celledød er avhengig av celle og vev sammenheng, så vel som av arten av stress stimulus [8]
apoptotisk og autophagic celledød er ikke gjensidig utelukkende veier:. de kan indusere celledød samtidig og samarbeide (for en oversikt se [9]). Autophagic morfologi av cellene er observert like før eller celledød; selv, om autofagi er den mekanismen som cellene faktisk dø og om celledød blir utført av autofagi eller med autofagi er fortsatt diskutert [10].
Skillet mellom apoptotiske og autophagic celledød er enda mer komplisert ved to betraktninger: i) en rekke cellulære påkjenninger utløsende signaltransduksjonsveiene kan utløser både apoptose og autofagi og ii) mange proteiner nødvendige for autofagi er også involvert i apoptotisk-celledød, for eksempel ATG5, transkripsjonsfaktoren p53 og Bcl-2-familiemedlemmer.
p53 er et velkjent oncosuppressor, aktivert etter en rekke av spennings stimuli, og er ansvarlig for transkripsjonsregulering av både pro- og anti-apoptotiske gener. Mens de pro-apoptotiske gener som Bax, Puma og Noxa er oppregulert, anti-apoptotiske seg, som BCL-2α, blir nedregulert ved kjerne p53. Også cytoplasmisk lokalisert p53 er blitt vist å være viktige i regulering av apoptotisk respons, ved å indusere Bax oligomerisering på mitokondrier, eller ved å frigjøre de pro-apoptotiske BH3-bare proteiner fra deres anti-apoptotiske partnere Bcl-2 /Bcl-XL [11] .
rollen til p53 i tumor undertrykkelse er også tilskrevet sin aktivitet i å regulere autofagi. p53-mediert aktivering av autophagy fører til celledød ved transaktivering av autophagy-induserende protein DRAM og inaktivering av mTOR veien [12], [13]. I opposisjon, farmakologisk hemming og inaktivering av p53 foreslå en negativ regulering av autofagi gjennom transkripsjonsuavhengige mekanismer [14].
I tillegg til p53, de BCL-2 familiemedlemmer er vanlige spillere av apoptose og autofagi. De er viktige i reguleringen av den ytre mitokondriemembranen permeabilization (MMP), som er ansvarlig for frigjøringen inn i cytoplasma av proteiner som medierer celledød, såsom Cytokrom C Bcl-2-proteiner er blitt vist å inhibere autofagi ved å forstyrre Bcl -2 /BCL-XL-Beclin-1-komplekser [15]. Det er ikke klart hvordan BCL-2 proteiner delta i apoptotiske
versus
autophagic prosessen, men de to forskjellige funksjoner kan bli bestemt av protein lokaliseringer på mitokondriene i stedet ER [16]. Relative nivåer av BCL-2 og Beclin-en dukket opp blant de aktuelle cellulære faktorer som kontrollerer om autofagi bidrar til kreft hemming eller overlevelse (anmeldt i [17]).
Ulike naturlige produkter og narkotika er i stand til å fremkalle kreft celle døden ved aktivering av autofagi, eller ved å målrette de samme veiene som autofagi [18]. Tamoxifen, Imatinib, resveratrol og Curcumin er eksempler på molekyler som utøver sin cytotoksisk aktivitet mot kreftceller
via
induksjon av autophagic celledød [17], [18].
Curcumin, den aktive komponenten funnet i rhizome av
Curcuma longa
, har vist terapeutisk aktivitet mot forskjellige tumorer. Det kan hemme initiering, progresjon og svulst celle overlevelse [19]. Spesielt musemodeller og kliniske studier vist sin chemopreventive potensial for kolorektal kreft [19]. I tykktarmskreft cellelinjer, hemmer Curcumin celleproliferasjon ved å fremkalle en G2 /M cellesyklus arrest eller apoptose når det brukes i høye doser [20], [21]. Videre har modulering av cellulær apoptotiske reaksjonsveier ved Curcumin har nylig blitt observert på kreftceller fra pasienter med kolorektal kreft [22].
Microarray studier viste at Curcumin-indusert apoptose er regulert av flere signalveier [23], [24]. Curcumin opp-regulerer pro-apoptotiske proteiner (Bax, Bim, Bak, Puma og Noxa) og nedregulerer anti-apoptotiske de (Bcl-2 og Bcl-XL) i ulike kreftceller, utløser frigjøring av cytokrom C og aktiveringen av caspase 3 [24]. I human melanom, HL-60 leukemi og gastriske celler, aktiveres Curcumin apoptose gjennom Fas-receptor /kaspase 8 sti [25], [26], [27]. I tillegg til den apoptotiske aktivitet, induserer Curcumin ER stress i forskjellige humane tumorceller, blant hvilke liposarkom celler [28], ikke-småcellet lungecancerceller [29] og leukemiceller [30].
autophagy prosess tar del i den anti-proliferative og apoptotiske aktiviteter Curcumin, både
in vitro Hotell og
in vivo
: i kreftceller og i en xenograft mus modell, Curcumin og metabolitten Tetrahydrocurcumin hemme veksten av ondartede celler ved aktivering autophagic-celledød
via
Akt /mTOR /p70S6K signalering og ERK1 /2 trasé [31], [32], [33]. I glioma initiere celler, Curcumin administrering fører til tumor undertrykkelse på grunn av autofagi-indusert differensiering hendelser [34].
Til tross Curcumin hemming av viktige molekylære stier av tumorigenesis, kliniske studier lav biotilgjengelighet, distribusjon begrenset vev og rask metabolisme [35]. 90% av Curcumin brytes ned raskt i nøytrale og basiske betingelser gjennom oksidasjon, reduksjon, glukuronidering og sulfatering [28], [29]. For å overvinne disse begrensningene, har naturlige og syntetiske analoger blitt syntetisert, hvorav
bis
-DeHydroxyCurcumin (bDHC) (Fig. 1A, venstre panel). Celler administrering av bDHC i 72 timer ved IC50-konsentrasjoner resulterte i en liten reduksjon av anti-proliferativ aktivitet sammenlignet med curcumin i androgen-avhengige og-uavhengig prostatacancercellelinjer og i østrogenavhengige og-Uavhengig brystkreft-cellelinjer [36], [37].
A. Venstre panel: Oppbygging av bDHC. Høyre panel: Dose-respons-effekt av bDHC på celle levedyktighet på 24 timer behandling, sammenlignet med kontroll og DMSO-behandlede celler. B. PI /FACS-analyse av cellesyklusutvikling etter DMSO, Curcumin (10 uM) og bDHC (30 uM) behandlinger for 16 og 24 timer (venstre og høyre panel, henholdsvis). De angitte hendelser er hjelp av ti uavhengige forsøk (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). C. PI /BrdU bivariate FACS analyse av 16 og 24 timer behandlinger med DMSO, Curcumin og bDHC. Analyse ble gated å utelukke SubG1 befolkningen. D. Venstre panel: Prosentandelen av Annexin V positive celler på 24 timer behandling med bDHC er i forhold til DMSO og curcumin-behandlede celler. Data er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter – /+ SD. Midtre panelet: PI /monoparametric cellesyklusanalyse av bDHC-behandlede celler
versus
bDHC-celler utgitt i 24 timer i frisk medium. Hendelser er angitt som hjelp av tre uavhengige forsøk (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). Høyre panel: γ-H2AX uttrykk nivåer
versus
aktin i celler behandlet med bDHC i 24 timer
I denne rapporten undersøkte vi tumor-selektiv hemmende effekt av bDHC på. proliferasjonen av humane kolorektale cancerceller. Sammenlignet med Curcumin, er bDHC mer aktiv i å indusere en irreversibel cytotoksisk effekt i HCT116 og LoVo-celler, men ikke i humane normale celler.
Oppbyggingen av poly-ubiquitinmolekyler og induksjon av ER stress er oppstrøms signaler av autofagi, som utløser mitokondrie-avhengig apoptose. Farmakologisk og RNAi-mediert hemming av ER-stress og autofagi streker at autofagi potenserer anti-proliferativ effekt av bDHC. Våre studier viser at bDHC fungerer som en pro-autophagic cellegift, rakne sin terapeutiske potensialet i bekjempelsen selektivt svulst utvikling.
Materialer og metoder
Cell kultur og narkotika
Menneske kolorektal kreft HCT116, HCT116 /E6 og HCT116 Bax – /- ble sjenerøst gitt av Bert Vogel (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Celler ble dyrket i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM), supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS). Primære humane fibroblaster (HF) ble dyrket i DMEM 10% FCS, glutamin (2 mM) og gentamicin (55 mg /L). Lever føtale humane epitelceller WRL68 celler og tykktarm adenokarsinomceller LoVo-celler ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% FCS. Doblingstiden har blitt anslått til å være 16 timer for HCT116 og LoVo tumorceller, og 24 timer for HF og WRL68 normale celler.
Curcumin [1,7-bis [3-metoksy-4-hydroksy-fenyl] hepta-1,6-dien-3,5-dion] og bDHC [1,7-bis [3-metoksy-fenyl] hepta-1,6-dien-3,5-dion] ble syntetisert som tidligere rapportert [20 ]. Renheten av syntetiserte forbindelser, bestemt ved NMR-teknikker og forbrenningsanalyse, var 98%. Curcumin og bDHC ble tilsatt til varmt medium ved 10 uM og 30 uM konsentrasjoner henholdsvis. C3-bDHC ble administrert til cellene ved 3 uM konsentrasjon. HCT116-celler ble inkubert med Adriamycin (1,3 pM) i 48 timer. For farmakologiske hemninger, celler forbehandlet i 1 time og deretter co-inkubert med bDHC for ytterligere 16 eller 24 timer med 25 mikrometer ZVAD-FMK (Enzo Life Sciences), 5 mikrometer LEVD-FMK (Enzo Life Sciences), 3 mikrometer Wortmannin (Enzo Life Science), 2 mikrometer Cycloheximide (Sigma Aldrich), 20 mikrometer Chloroquine (Sigma Aldrich), 50 mikrometer Salubrinal (Santa Cruz). Thapsigargin (Sigma Aldrich) ble administrert til cellene i 36 timer ved en uM konsentrasjon.
cytometrisk analyse (FACS)
Flowcytometriske cellesyklusanalyse ble utført som tidligere beskrevet [20]. Indirekte fluorescens farging ble utført ved hjelp av anti-fosfor-Histone H3 (Ser10) (Cell Signaling # 9706) og mus anti-FITC (Dako # F0313) antistoffer. Cellene ble høstet etter medikamentbehandlinger, vasket to ganger med PBS 1 x, fiksert i 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C, og post-fiksert med 90% metanol o.n. ved -20 ° C. Etter permeabiliseringen med 0,25% Triton X-100 i PBS 1 x i 5 min, ble cellene farget med primært antistoff (1:25) o.n. ved 4 ° C, og sekundært antistoff (1:50) i ytterligere 2 timer ved 4 ° C. Cellene ble deretter behandlet med RNase A i 40 minutter, inkubert med propidium jodid (30 ug /ul) i ytterligere 30 minutter ved 4 ° C i mørke og analysert med cytometer.
apoptotiske celler ble identifisert ved hjelp av FACS ved hjelp Annexin V-FITC konjugat (Bender MedSystems) etter protokollen fra produsenten.
cellulært opptak studier
bDHC ble hentet fra celler og kulturmedium som tidligere rapportert [20].
Crystal Violet assay
inhibering av proliferasjon ble målt ved krystallfiolett farging og den konsentrasjon ved hvilken celleveksten hemmes med 50% (IC50) ble bestemt etter 24 timers behandling med bDHC. Etter fjerning av cellekulturmedium, ble cellemonolaget fiksert med metanol og farget med 0,05% krystallfiolett oppløsning i 20% metanol i 30 min. Etter vaskinger ble cellene tillatt å tørke. Den innlemmet fargestoff ble solubilisert i sur isopropanol (1 N HCl: 2-propanol, 01:10) og bestemt spektrofotometrisk ved 540 nm bølgelengde. Den ekstraherte fargestoff var proporsjonal celle nummer. Prosentandelen av cytotoksisitet ble beregnet ved å sammenligne absorbans av behandlede med ubehandlede celler.
akridinoransje farving
HCT116-celler behandlet med DMSO og bDHC i 8 og 16 timer. Etter dette ble cellene inkubert med akridinoransje (1 pg /ml) i 15 min ved 37 ° C, etterfulgt av visualisering med et Zeiss AxioSkop 40 fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).
Intracellulær ATP-innhold
Fastsettelse av intracellulær ATP-innholdet ble utført ved hjelp av ATP bioluminescence analysesett CLSII (Roche), etter produsentens protokoll.
Mitokondriell membranpotensialet
Mitokondriell membranpotensialet ble målt ved å evaluere bindingen av 3,3-Dihexyloxacarbocyanineiodide (DiOC6), et kationisk fargestoff som binder seg til mitokondriene med intakte membranpotensialet. Celler ble merket etter DMSO eller bDHC inkubering i 16 og 24 timer med DiOC6 (4 nM) i 40 minutter ved 37 ° C. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS 1 x og fluorescensintensiteten ble analysert ved anvendelse av Beckman Coulter cytometer.
Immunoblotting
Cellene ble lysert i Laemmli prøvebuffer 1 x for totalcelleekstrakter. Kjernefysiske /cytoplasmiske ekstrakter ble fremstilt som rapportert i Ref. [38]. Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [20]. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: anti-p53 DO-en (Santa Cruz # sc-126), anti-fosfo-H3 (Ser10) (Millipore # 05-817), anti-H2A syre-patch (Active Motif), anti -p21 (Upstate), anti-aktin (i Santa-Cruz), anti-PARP1 (Santa Cruz # sc-8007), anti-γH2AX (Millipore, # 05-636), anti-GADD153 (F168) (Santa Cruz # sc -575), anti-tubulin (Sigma-Aldrich), anti-spaltet caspases 3, 7, 8, 9 (Cell Signaling), anti-caspase 4 4B9 (Enzo Life Sciences), anti-Bax (N-20) (i Santa Cruz # sc-493), anti-BCL-2 (Santa Cruz # sc-509), anti-BCL-XL (Santa Cruz # sc-8392), anti-LC3B (Sigma Aldrich # L7543), anti-Ub (i Santa Cruz # sc-8017), anti-ATG7 (Sigma Aldrich # A2856), anti-Beclin 1 (Sigma Aldrich # B6061) og anti-H3 (C16) (Santa Cruz # sc-8654). Kjemiluminescens deteksjonsreagensen har blitt kjøpt fra Millipore (Luminata Classico og Forte Western HRP).
Isolering av cytosoliske brøkdel av digitonin lysemetode
2.000.000 HCT116 cellene ble vasket to ganger i PBS 1 × og deretter resuspendert i digitonin lyseringsbuffer (75 mM NaCl, 1 mM NaH
2PO
4, 8 mM Na
2HPO
4, 250 mM sukrose, 190 mg /ml digitonin, proteaseinhibitorer). Hver prøve ble inkubert på is i 5 minutter og deretter sentrifugert ved 15,000 x g ved 4 ° C i 30 minutter. Supernatantene ble samlet og anvendt for Western blotting ved anvendelse av anti-Cytokrom C-antistoff (Santa Cruz # sc-13560).
Immunofluorescence
Immunofluorescens-analyse ble utført som tidligere beskrevet [20], [ ,,,0],39], ved hjelp av anti-p53 DO-en (Santa Cruz # sc-126) og anti-LC3B (Sigma Aldrich # L7543) antistoffer utvannet 1:100 i PBS + BSA 1%. p53 cellulær lokalisering ble undersøkt med Zeiss AxioSkop 40 fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland), bilder samlet inn med en AxioCam HRc kamera og AxioVision versjon 3.1 programvare pakke. Farging av endogen LC3B ble analysert ved konfokal mikroskopi (Leica DM IRE2).
plasmider og transient transfeksjon
HCT116 ble transient transfektert med BCL-2, BCL-XL eller bære plasmider med Fugene (Promega ). Menneskelig BCL-2 og Bcl-XL ekspresjonsvektorer ble vennlig levert av M. Priault (CNRS IBGC UMR 5095, Bordeaux, Frankrike) [40]. Cellene ble gjenvunnet 48 timer etter transfeksjon for Western blot og cellesyklusanalyse.
Små interfering RNA (siRNA)
HCT116-celler ble transfektert (Lipofectamine 2000, Invitrogen) med 200 nM av paret ATG7, BCN1 og ikke-målsøkende styre små interfererende RNA (Sigma Aldrich), som beskrevet av Hoyer-Hansen et al. [41]. CHOP siRNA (HSC.RNAI.N004083.10.2 fra IDT) var en slags gave A. Pietrangelo (Universitetet i Modena og Reggio Emilia, Modena, Italia). Total ekstrakter og FACS-prøver ble fremstilt etter 72 timer ved siRNA transfeksjon.
RT-PCR-analyse
RNA-ekstraksjon, retrotranscription og semikvantitative PCR ble utført som tidligere beskrevet [42], [43]. Aktin og LC3B ble amplifisert med de følgende oligonukleotider: Actin
For: 5′-GAGGCCCAGAGCAAGCGT-3 «; Actin
Rev: 5′-GCTCGAAGTCCAGGGCGACG-3 «; LC3B
For: 5′-CCTGGAGAAAGAGTGGCATTT-3 «; LC3B
Rev: 5′-GAAGGCAGAAGGGAGTGTGT-3 «
Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Celler dyrket i monolag på dekk ble løst i 1,25% glutaraldehyd i PBS 1 × 30. min RT og vasket i PBS 1 x for tre ganger. Etter dehydrering i graderte etanolløsninger, prøvene var kritisk-punkt-tørket med CO
2 ved hjelp av et kritisk punkt Dryer 010 Balzer, montert på aluminium stubber, og frese-belagt med 10 nm gull-palladium i en påføringsenhet E 500 ( Polaron). Observasjoner ble utført av Philips XL-30 scanning elektronmikroskop.
transmisjonselektronmikroskopi analyse
Cells, skrapt fra petriskåler, ble sentrifugert ved 12 000 × g for 5 «ved 10 ° C. De resulterende pellets ble fiksert over natten med 2,5% glutaraldehyd (Agar Scientific, Stensted, UK) i Tyrodes buffer, postfiksert i 2 timer i 1% osmiumtetroksyd (Agar Scientific), dehydrert og innstøpt i TLV harpiks (TAAB, Aldermaston, UK ). Semithin seksjoner som oppnås gjennom hele tykkelsen av pellets ble farget med toluidinblått og observert med et Zeiss Axiophot lysmikroskop (Oberkochen, Tyskland). Ultratynne snitt ble farget med uranylacetat og føre citrate og observert med en Jeol 1200 EXII elektronmikroskop (Jeol, Tokyo, Japan).
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
chips ble utført med kromatin fra DMSO og bDHC behandlede celler i 24 timer som beskrevet i Martens
et al.
[44]. PCR oligonukleotider ble tidligere rapportert [43].
Statistisk analyse
Resultatene er vist som middel for minst tre uavhengige eksperimenter +/- SD. Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av enveis ANOVA, etterfulgt av LSD test for å fastslå om det var forskjeller mellom ulike grupper.
Resultater
Effekter av bDHC på levedyktighet og cellecyklusprogresjonen av HCT116 cellene
full dose-respons-eksperimenter ble utført i HCT116-celler for å identifisere evnen til bDHC til å undertrykke cellevekst. bDHC cytotoksisitet ble bestemt ved krystallfiolett farging vital metode og den 50% inhiberende konsentrasjon av cellevekst (IC50) ble beregnet lik 30 uM, etter 24 timers behandling (Fig. 1A, høyre panel).
effekten av bDHC på cellesyklusutvikling ble undersøkt ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse (fig. 1B). HCT116-celler behandlet i 16 og 24 timer med bDHC og fordeling inn i cellesyklusfaser ble sammenlignet med DMSO og curcumin behandlede celler. Som tidligere vist [20], Curcumin stansede celler i G2 /M fase og halvert befolkningen i G0 /G1 og i S-fasen i løpet av 16 timer; ingen signifikant økning av SubG1 bivirkninger ble detektert. En annen måte, bDHC akkumulert celler ikke bare i G2 /M (fra ca. 23% av kontrollceller til 37% av behandlede celler), men også i SubG1 fase (fra 2,5% til 10%). Med langvarig eksponering, SubG1 hendelser litt hevet over Curcumin (fra 4% til 8,6%), mens en tydelig økning påvises med bDHC (fra 4% til 33%).
En celle syklus profilen ble deretter opprettet av utføre PI /BrdU biparametric analyse og bruk av selektiv gating unntatt SubG1 befolkningen (fig. 1C). Som forventet, Curcumin halvert S fase befolkning og doblet G2 /M celler. I tillegg til Curcumin, bDHC-behandlede celler viste en klar reduksjon av tidlig S populasjon (fra ca. 33% til 5,9% og 4,8% etter 16 og 24 timer, henholdsvis) og en akkumulering av G2 /M-arrangementer (fra ca. 25% til ca 42% og 50%, etter 16 og 24 timer), mens påvist vesentlige endringer i G0 /G1 prosent.
For å diskriminere mellom G2 og mitotiske populasjoner ble cellene dual undersøkt med PI og en spesifikk antistoff mot mitotisk markør phospho-histon H3Ser10 ved hjelp av flowcytometri (fig. S1 A). Mens om lag 90% av 4n celler var positive til fosfor-histon H3Ser10 følgende Curcumin behandling, ble bare ca 2% detektert som mitotisk befolkning på bDHC administrasjon.
Sammenligningen mellom monoparametric og biparametric analyser (Fig. 1B og Fig . 1C) fremhevet at den viktigste effekten av bDHC behandling er en G2 blokk etter 16 timer og celledød på 24 timer.
cytotoksisk aktivitet av bDHC ble undersøkt ved SEM-analyse (fig. S1B). Dype morfologiske endringer av overflaten, for eksempel tap eller forstørret microvilli, membran «blemmer» og apoptotiske legemer var tilstede i bDHC behandlede celler. Dessuten ble en sterk økning av Annexin V-positive celler detektert etter 24 timers bDHC administrering (61%) sammenlignet med DMSO (7%) og Curcumin (24%) behandlede celler (Fig. 1D, venstre panel), noe som tyder på aktiveringen av en apoptotisk celledød.
for å undersøke om den er reversibel bDHC-vekst arrest, ble HCT116-celler behandlet i 24 timer med bDHC deretter vasket for å fjerne døde hudceller og utgitt i 24 timer inn frisk medium. En irreversibel virkning på cellenes levedyktighet ble observert, med en klar opphopning av SubG1 hendelser (38%) og ingen økning i en annen fase av cellesyklusen (fig. 1D, midtre panel).
I likhet med HCT116, menneskelige kolon adenokarsinom Løvø celler viste en tydelig økning av SubG1 hendelser følgende bDHC administrasjon i 24 timer (fra 2,6% i DMSO til 27,7% i bDHC behandlede celler) (fig S1C).
Jevnt med utseendet på celler med hypodiploid SubG1 DNA-innhold, bDHC utløste fosforyleringen av histon varianten H2AX (γ-H2AX), hvis funksjon er knyttet til DNA-fragmentering i løpet av apoptose [45], både i HCT116 og LoVo-celler (fig. 1D, panel til høyre og fig. S1C rett panel).
bDHC induserer celledød i HCT116-celler, men ikke i menneskelige normale celler
neste lurte på om bDHC hadde en svulst-selektiv aktivitet. Ikke-transformerte humane fibroblaster (HF) og hepatiske føtale humane epitelceller normale celler (WRL68), hvis doblingstiden er 24 timer, ble behandlet i 24 og 48 timer med bDHC 30 mM og vekst undertrykkende aktivitet ble deretter undersøkt ved hjelp av FACS (Fig. 2A og B , venstre og midtre paneler). I HF-celler, bDHC induserte en progressiv akkumulering av S (fra 19,8% til 21,9% og fra 11,4% til 17% i løpet av 24 og 48 timer, henholdsvis) og G2 /M-arrangementer (fra 16,8% til 24,7% i løpet av 24 timer, fra 8,5% til 34,5% i løpet av 48 timer). bDHC administrasjon til WRL68 resulterte i en økning av både S og G2 /M arrangementer i tillegg, men forskjellig fra HF-celler, ble maksimal effekt påvist etter 24 timer (fra 14% til 20,6% i S-fasen, og fra 19,1% til 33,7% i G2 /M fase). Interessant, verken HF eller WRL68 celler ble forpliktet til apoptotisk celledød og sammenhengende, ble det ikke observert økning av γ-H2AX uttrykk på bDHC behandling (Fig. S1D).
A. PI /FACS-analyse av HF cellesyklusprogresjon etter DMSO og bDHC behandlinger i 24 og 48 timer (til venstre og midtre panel, henholdsvis). PI /monoparametric cellesyklusanalyse av bDHC-behandlede celler
versus
bDHC utgitte celler (høyre panel) (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). B. venstre og midtre plater: Analyse av cellesyklusutvikling av WRL68 celler etter 24 og 48 timer etter behandling med DMSO eller bDHC. Høyre panel: PI /FACS monoparametric analyse av WRL68 celler behandlet med bDHC i 48 timer og deretter sluppet ut i frisk medium for ytterligere 24 timer (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). C. Kvantitativ evaluering av bDHC konsentrasjon av UV-vis spektroskopi. Øvre venstre panel: bDHC utvinnes fra cellelysater av HCT116 (•) og HF (▴) celler etter 24 timers behandling ved forskjellige konsentrasjoner (10, 20 og 30 uM). bDHC utvinnes fra celle pellets (ng) ble henvist til totale cellulære proteiner (mg), fastsatt ved bruk av Bradford-metoden. panel øvre høyre: Sammenligning av cellulært opptak (20 og 30 mikrometer konsentrasjoner) i HCT116 (svarte histogram) og HF celler (grå histogrammer). Nedre panel: bDHC utvinnes fra dyrkningsmedier etter inkubasjon av HCT116 (•) og HF (▴) celler med bDHC ved 10, 20 og 30 uM konsentrasjon. Alle data ble normalisert på kontroll (DMSO). Drug Beløpet ble bestemt ved å lese absorbans ved λ
maks = 393 nm. Rapporterte verdier er et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter -. /+ SD
For å undersøke stabiliteten av cellesyklus blokade indusert i normale celler, ble HF celler behandlet med bDHC i 48 timer, deretter vasket og utgitt i stoff-fri medium i 24 timer. I motsetning HCT116 ble HF celler gått fra G2 /M til G1 fase (fra 48% til 56,3% etter utgivelsen), og ingen økning av SubG1 oppdaget (Fig. 2A, panel til høyre). Den reversible effekter av bDHC på normale celler ble enda mer tydelig i WRL68 celler, som cellesyklus distribusjon etter 48 timer, og etter utgivelsen i frisk medium perfekt overlappet det av kontrollceller (Fig. 2B, midtre og høyre panel).
Disse data antyder at bDHC reversibelt blokkerer cellesyklusprogresjon av ikke-maligne celler uten å indusere apoptose.
med det formål å rakne arten av bDHC selektivitet mot tykktarmskreftceller heller enn normale celler, utførte vi videre studier for å beregne variasjonen av cellulært opptak som en funksjon av behandlingskonsentrasjon i HCT116 og HF-cellelinjer. Data ble normalisert og presenteres som ng /mg av totalt protein (fig. 2C, øvre panel) og kulturmediet restmengder (ug) (fig. 2C, nedre panel). Medikamentopptak økte på en doseavhengig måte i begge cellelinjer, men HCT116 viste en signifikant høyere opptak i forhold til HF-cellelinje ved 30 pM: 4575 ± 40
versus
2979 ± 21 ng /mg totalt protein ( fig. 2C, panel øverst til høyre).
bDHC-indusert celledød er en caspase avhengig prosess
for å utforske bidrag caspases om gjennomføringen av apoptose, vi pre-ruges HCT116-celler med den brede caspase inhibitor ZVAD før behandling celler med bDHC i 24 timer (fig. 3A, venstre panel). En dramatisk fall av SubG1 bivirkninger ble observert samtidig til en progressiv akkumulering av celler i S og G2 /M-faser (fra 11,7% til 24,5% i S-fase og fra 16% til 40% i G2 /M, ved ZVAD forbehandling) . Inhiberingen av apoptose ved ZVAD fastslått en tydelig reduksjon av fosforylert H2AX (fig. 3A, panel til høyre og fig. S2A). Actin ble brukt som lasting kontroll. Actin ble brukt som lasting kontroll. Actin ble brukt som lasting kontroll. Actin ble brukt som lasting kontroll.
