Abstract
PTEN, en phosphoinositide-3-fosfatase, serverer dobbeltroller som en tumor suppressor og regulator av cellulær anabole /katabolsk metabolisme. Tilpasning av en redoks-følsom cysteinyl tiol i PTEN for signaloverføring av hydrogenperoksyd kan ha overlagret en sårbarhet for andre mediatorer av oksidativt stress og inflammasjon, spesielt reaktive karbonylforbindelser art, som er vanlig forekommende biprodukter av arachidonsyre peroksydasjon. Bruke MCF7 og HEK-293 celler, rapporterer vi at flere reaktive aldehyder og ketoner, f.eks elektrofil α, p-enals (akrolein, 4-hydroksy-2-Nonenal) og α, p-enones (prostaglandin A
2, Δ12-prostaglandin J
2 og 15-deoksy-Δ-12,14- prostaglandin J
2) kovalent endre og inaktivere cellular PTEN, med påfølgende aktivering av PKB /Akt kinase; fosforylering av Akt underlag; økt celleproliferasjon; og økt kjernefysisk β-catenin signalering. Alkylering av PTEN av α, β-enals /enones og interferens med sin beherskelse av mobilnettet PKB /Akt signal kan fremheve hyperplastisk og neoplastiske lidelser forbundet med kronisk betennelse, oksidativt stress, eller aldring
Citation. Covey TM, Edes K, Coombs GS, Virshup DM, Fitzpatrick FA (2010) Alkylering av tumorsupressorproteinene PTEN Aktiverer Akt og β-catenin Signa: En mekanisme Linking Inflammasjon og oksidativt stress med kreft. PLoS ONE 5 (10): e13545. doi: 10,1371 /journal.pone.0013545
Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 8 juli 2010; Godkjent: 30 august 2010; Publisert: 21 oktober 2010
Copyright: © 2010 Covey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Research Project Grant R01 AI 26730 (Frank A. Fitzpatrick), forskningsprogram Prosjekter PA1 CA73992 Prosjekt 4 (David M. Virshup) og Prosjekt 5 (Frank A. Fitzpatrick), og Small Grant Program R03 MH082387 -01 (Gary S. Coombs, David M. Virshup og Frank A. Fitzpatrick). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betennelse og kreft er intrikat knyttet [1], [2]. «Ulmende» inflammasjon [3], også kalt para-inflammasjon [4], forekommer i mange typer av pre-maligne og maligne tumorer, f.eks kolorektal adenom og adenocarcinoma hvor innholdet av inflammatoriske leukocytter og den inflammatoriske enzymet cyklooksygenase-2 (COX-2) påvirkning progresjon, prognose og overlevelse [5], [6]. Ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAIDs) som hemmer COX-2 kan forebygge enkelte, men ikke alle, kreft [7]; og noen NSAIDs, for eksempel sulindak sulfone, opptre uavhengig av COX og prostaglandin E
2 (PGE
2) hemming [8]. Andre NSAIDs, f.eks celekoksib, kan paradoksalt nok øke tumorprogresjon hos APC
Min /+ mus som modell intestinal tumorigenesis [9]. Mens COX-2 og metabolitten PGE
2 er utvilsomt viktig, kan para-betennelse forbedre tumorigenesis av mekanismer som er ufullstendig forstått. Medfødte immunmekanismer er førsteklasses kandidater for undersøkelse.
Vanligvis medfødte immun betennelse består av en «såret» fase å utslette patogener, og en «healing» fase for å reparere og regenerere skadet verten vev [10]. Overgangen mellom fasene avhenger gradvis utmattelse av inflammatoriske mediatorer og konvertering av enkelte pro-inflammatoriske mediatorer, f.eks PGD
2, inn i anti-inflammatorisk metabolitter, Δ12-PGJ
2 [11], [12], [13]. Elementer av den betente området selv, f.eks reaktive oksygenforbindelser (ROS), albumin, fibroblaster og nøytrofile, orkestrere denne konverteringen [14], [15], [16], [17]. For eksempel, reaktive oksygenarter (ROS) forårsake ikke-enzymatisk peroksydasjon av essensielle fettsyrer, som arakidonsyre (AA) [18]. AA hydroperoksyder omdanne lett til reaktive produkter inneholdende en α, β-umettet karbonyl [19], [20] som inneholder akrolein (2-propenal) [21], [22], 4-hydroksy-2-Nonenal (4-HNE) [23], og cyklopentenon prostaglandiner (cyPGs), PGA
2 og Δ12-PGJ
2 [24]. Kovalent modifisering av NFkB og IKKα /p-proteiner ved disse a, ß-umettet karbonylgrupper metabolitter (dvs. protein alkyleringsresultater) ser ut til å være en «bryter» for å avslutte betennelse [25]. Etter dette presedens, hypotese vi at alkylering kan også fungere som en «bryter» for å starte reparasjon og regenerering av vev skadet av betennelse.
PTEN (fosfatase tensin homolog på kromosom 10) er en phosphoinositide-3-fosfatase med to fysiologiske roller: tumor suppressor og regulator av anabole /katabole cellesignalisering.
PTEN
genet er ofte mutert eller inaktivert i avansert kreft [26]. Bruke MCF7 og HEK-293 celler, rapporterer vi at reaktiv α, ß-umettet carbonyls (akrolein, 4-HNE, og Δ12-PGJ
2) inaktivere PTEN protein – ikke genet – ved alkylering. Inaktivering av PTEN av a, ß-umettet carbonyls fører til økt Akt signal, forbedret kjernefysisk β-catenin signalering, og utvidet cellulær proliferasjon. Redox signal av PTEN kan ha utviklet seg til å aktivere celler (vev) til stratify deres respons på oksidativt stress. For eksempel, forbigående hemming av PTEN av reaktivt oksygen eller karbonyl-arter, og den tilsvarende signaliserer gjennom Akt /GSK3p /β-catenin /TCF4 /Lef1 kan ha nytte verten via økende spredning og regenerering av vev skades av akutt betennelse eller oksidativt stress. Errant og vedvarende PTEN inaktivering av den samme molekylære mekanismen kan favorisere tumorprogresjon og gi en etiologisk sammenheng mellom «ulmende» betennelse og visse kreftformer, spesielt tykktarmskreft, hvor både PTEN og APC tumor suppressors begrense atom β-catenin signal [27] .
Resultater
Den α, ß-umettet carbonyls akrolein, 4-HNE og Δ12-PGJ
2 kovalent modifisere cellulær PTEN
Vi utsettes MCF-7 celler representativ α, ß-umettet karbonyl (figur 1C) eller H
2o
2, så selektivt merket noen proteiner som hadde oksidert eller karbonylerte tiol hjelp NEM-biotin (figur 1A). Vi sequestered proteiner med en biotin epitop på NeutrAvidin (NA) perler og identifisert karbonyliseres PTEN ved SDS-PAGE og immunoblotting. MCF-7-celler behandlet med 10 uM Δ12-PGJ
2, 4-HNE, eller akrolein inneholdt karbonylert PTEN i mengder som er sammenlignbare med celler behandlet med 100 pM H
2o
2 (figur 1A, NA nedtrekk) . Denne metoden skiller ikke mellom oksidert og karbonylerte tiol på PTEN. Imidlertid elektroforese under ikke-reduserende betingelser, etterfulgt av western-blotting, viste at PTEN migrerte som et diskret isoform på grunn av en oksydert disulfid [28], [29], noe som skjedde bare i celler behandlet med 100 pM H
2O
2, men ikke i celler behandlet med α, ß-umettet karbonyl (Δ12-PGJ
2, 4-HNE, acrolein) eller 15-HPETE, et lipid hydroperoksyd (figur 1B).
(A) Diagram av prosedyren for å identifisere PTEN med en oksidert eller alkylerte tiol i celler eksponert for ROS eller α, ß-umettet karbonyler. Den anti-PTEN immunoblot viser oksydert eller karbonyleres PTEN (NA Nedtrekk) i forhold til total PTEN (cellelvsat) isolert fra MCF-7-celler behandlet 30 minutter med vehikkel (DMSO), 10 uM Δ12-PGJ
2 eller 4-HNE versus 10 min med 100 mikrometer H
2o
2; et immunoblot fra et separat eksperiment viser oksydert, karbonylerte og total PTEN i celler behandlet i 30 min med bærer eller 20 uM akrolein i forhold til 10 min med 100 pM H
2o
2. (B) Anti-PTEN immunoblot av MCF-7 cellelysatene fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser. PTEN oksidert til en Cys
124-Cys
71 disulfid fremstår som en raskere trekkende arter (PTEN oksidert disulfid) bare i celler behandlet med H
2o
2. Denne arten var umulig å oppdage i MCF-7cells behandlet 30 min med DMSO kjøretøy eller 20 mikrometer hver Δ12-PGJ
2, 4-HNE, akrolein eller 15-HPETE. (C) Kjemiske strukturer av typiske α, ß-umettet karbonyler. Acrolein og 4-HNE er a, g enals; Δ12PGJ
2 er en α, β enon. Elektrobeta karboner er merket med δ
+. Blot er representative for oppnådde resultater i minst tre uavhengige eksperimenter.
Cyclopenteneone PG-biotin analoger er modell a, b-enones at alkylatbensin PTEN
cysteinyl tiolat i PTEN aktiv område (-HC (X
5) RT-) er utsatt for oksydasjon, fordi det er en sterk nukleofil, pKa ~ 5. Denne egenskapen skal også legge til rette for alkylering av PTEN av α, ß-umettede karbonyler. Vi brukte CyPG-biotin-analoger, som har et elektrofilt β-karbon i stand til nukleofil tilsetning (Michael-reaksjon), som kjemisk modell for å teste denne hypotesen [30]. Alkylering av eventuelle cellulære proteiner av disse analoger ville innføre en biotin epitop
de novo plakater (Figur 2A). PGA
1-biotin og Δ12 PGJ
2-biotin ble begge tatt opp i MCF-7-celler og dannet kovalente addukter med -20 proteiner (figur 2B). Δ12 PGJ
2-biotin (en bi-funksjonell dienon) var mer reaktiv enn PGA
1-biotin (mono-funksjonell Enone), enige med andre som rapporterte ~20-30 protein mål modifisert av cyPG-biotin i 3T3-celler eller mitokondrier [31], [32]. Lagring av
de novo
biotinylerte cellulære proteiner på NA perler, etterfulgt av immunoblot med anti-PTEN antistoffer, viste at PTEN dannet en kovalent addukt ~ 10 ganger lettere med Δ12-PGJ
2-biotin enn med PGA
1biotin (figur 2C, kjørefelt 4 vs spor 3).
(A) Michael tillegg reaksjon mellom PTEN og en Δ12-PGJ
2-biotin analog. Etter behandling av celler med cyPG-biotin, ble proteiner med en
de novo
biotin epitop sequestered på neutravidin perler (NA nedtrekk), deretter fraksjonert ved SDS-PAGE for immunoblotting. (B) Anti-biotin immunoblot av proteiner fra lysater av MCF-7-celler behandlet med DMSO (kolonne 1), 10 uM PGA
1-biotin (spor 2), og 10 uM Δ12PGJ
2-biotin (spor 3). Δ12-PGJ
2 biotin dannet en kovalent addukt med proteiner lettere enn PGA
1-biotin (pilspisser). (C) Anti-PTEN immunoblot av cellulær PTEN det dannes en kovalent addukt med cyPG-biotin (NA Nedtrekk) i forhold til total PTEN (cellelvsat) fra MCF-7-celler behandlet med DMSO (spor 1), 1 eller 10 uM PGA
1-biotin (sporene 2, 3), og en eller 10 uM PGJ
2-biotin (kolonnene 4, 5). Blot er representative for oppnådde resultater i minst tre uavhengige eksperimenter.
Den α, ß-Enone, Δ12-PGJ
2, forstyrrer PTEN undertrykkelse av Akt kinase
vekstfaktorer, insulin og andre stimuli rask PI3-K for å gjøre PIP
3, som rekrutterer PKB /Akt kinase til cellemembranen hvor PDK1 /2 phosphorylates Akt Thr
308 og Akt Tjen
473 rester, henholdsvis [33], [34], [35]. PTEN nedregulerer PKB /Akt aktivering av metabolizing PIP
3 til PIP
2 [36]. α, kan ß-umettet carbonyls at alkylatbensin cellular PTEN forstyrre sin undertrykkelse av Akt kinase. En representativ α, ß-enon, Δ12-PGJ
2, forårsaket en konsentrasjons og tidsavhengig økning i fosfo (T
308) Akt i MCF-7-celler. Så lite som ca. 2 uM Δ12-PGJ
2 forårsaket en halv-maksimal respons (figur 3A). Økninger i cellulær fosfo (T
308) Akt kunne påvises ved 10 minutter var maksimal ved 30 min, og holdbart for 120 min (figur 3B). Δ12-PGJ
2 økt dannelse av fosfo (T
308) Akt uten å endre dannelse av fosfo (S
241) PDK1 (kinase som fosforylerer T
308 av Akt), og uten endre PTEN protein uttrykk (Figur 3C). Disse data tyder på at Δ12-PGJ
2 forstyrret PTEN evne til å beherske aktivering av Akt kinase. I samsvar med denne fortolkning, co-behandling av celler med cyPGs pluss 50 uM LY294002, reduserte nivåer av fosfo (T
308) Akt ved å hemme PI3-K, ved spissen av PI3-K /→ PDK1 /2 → Akt kinase kaskade (figur 3C, baner 3 vs 2, og 6 mot 5). Videre 1fiM av ulike PGA og PGJ isomerer, og andre α, ß-enones direkte hemmet isolert PTEN enzym [Tabell 1]. Den elektrofile β karbonet cyPGs er essensielt for inhibering, ettersom et strukturelt like, men ikke-elektrofil cyPG, PGB
1, var inaktive.
(A) immunoblot av fosfo (T
308 ) Akt i forhold til total Akt i lysater fra MCF-7-celler behandlet 30 minutter med 0-20 uM Δ12-PGJ
2. Den søylediagram som viser økningen i fosfo (T
308) Akt /total Akt (middel verdier ± S.E.M.) fra n≥3 separate forsøk. (B) Immunoblot av fosfo (T
308) Akt i forhold til total Akt i lysatene fra MCF-7-celler behandlet med 20 uM Δ12-PGJ
2 i 0-120 min. Den søylediagram som viser økningen i fosfo (T
308) Akt /total Akt (middel verdier ± S.E.M.) fra n = 4 separate eksperimenter. (C) immunoblot av total Akt, fosfo (T
308) Akt, PTEN, fosfo (S
241) PDK1 fra lysater av MCF-7-celler som ble behandlet 30 minutter med 20 uM Δ12-PGJ
2 (kolonne 2, 3) og 20 uM PGA
1 (felt 5, 6) i nærvær av PI3-K-inhibitor 50 uM Ly294002 (spor 3, 6) eller DMSO kjøretøy (kolonne 2, 5). (D) Immunoblot av fosfo (T
308) Akt i forhold til total Akt i lysatene fra MCF-7-celler ble behandlet i 4 timer med bærer, de cyclopentenones – PGJ
2, Δ12-PGJ
2, og 15-deoksy-Δ12-PGJ
2, eller deres forløper PGD
2. For (C) og (D), blotter er representative for resultatene oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
Struktur-aktivitets eksperimenter viste at ulike J-serien cyPGs, inkludert PGJ
2 , Δ12 PGJ
2 og 15-deoxy- Δ12, 14-PGJ
2, økt fosfo (T
308) Akt i MCF-7-celler, sammenlignet med vehikkel eller deres forløper PGD
2 (Figur 3D). PGA
1 hadde en beskjeden effekt på cellulær Akt fosforylering (figur 3C, spor 5), som korresponderer med dens svakere kovalent modifikasjon av cellulær PTEN (figur 2C, felt 3).
Aktivert fosfo (T
308 /S
473) Akt kinase kan fosforylere ulike protein underlag som regulerer celleproliferasjon og skjebne [35]. Fosforylering av Akt substrater med en RxRxx-fosfo-S /T-epitop, falt sammen med økt fosfo (T
308) Akt i MCF-7-celler behandlet med 10 uM Δ12-PGJ
2 (figur 4A). Akt kinaseaktivering også sammenfaller med Akt-avhengig proliferasjon i MCF-7-celler behandlet med 1-10 uM Δ12-PGJ
2 (figur 4B). Dette funnet er konsistent med rapporterte bifasisk handlinger cyPGs, der de øker spredning av dyrkede celler på ~ 1 mikrometer [37], [38], mens de redusere spredning eller forårsake apoptose ved å endre andre protein mål på -50 mikrometer [39 ].
(A) immunoblotter av fosfo (T
308) Akt, total Akt, og flere fosfoproteiner med (K /R) -X- (K /R) -xx- (S /T), et motiv gjenkjennes og fosforylert med aktivt fosfo (T
308) Akt, i lysater fra MCF-7-celler behandlet 0 og 10 uM Δ12-PGJ
2. (B) Relative proliferasjonen av MCF-7-celler (gjennomsnitt ± SEM, n = 4) ble behandlet med 0, 1, og 10 uM Δ12-PGJ
2 alene (▪), eller i nærvær av 10 uM inhibitor IV (▪), en Akt kinase inhibitor. (C) immunoblotter av fosfo (S
473) Akt, total Akt; fosfor (S
9) GSK3p, total GSK3p; og β-catenin og tubulin i lysatene fra HEK 293-celler etter behandling for 0,1, 3, 6 og 16 timer med 6 pM Δ12PGJ
2, 6 uM 4-HNE eller 20 uM akrolein. For (A) og (C), blot er representative for resultatene oppnådd i tre uavhengige eksperimenter.
α, ß-umettet karbonyler føre til en tidsavhengig cellulær akkumulering av fosfo (S
473) Akt kinase (aktiv) → fosfo (S
9) GSK3p (inaktiv) → β-catenin og en økning i kjernefysisk β-catenin signale
GSK3p konverterer β-catenin til fosfo (S
33/37 /T
41) β-catenin, som er raskt eliminert av 26S proteasomet [40]. GSK3p opptrer i forståelse med tumor suppressor APC. I celler med mutert APC, eller når Wnt ligander stimulerer celler med villtype APC, unnlater GSK3p å fosforylere β-catenin, som gjør det mulig å samle, omgås andre atomtranskripsjonsfaktorer og uttrykke sine mål gener (f.eks
c-myc
,
cyclin D1
) [41]. PTEN kan blokkere β-catenin opphopning /signalering ved å begunstige retensjon av aktiv GSK3P og inaktive PKB /akt-kinase i noen [42], [43], men ikke alle eksperimentelle systemer [44], [45]. Følgelig bør inaktivert PTEN øke β-catenin signal ved å favorisere oppbevaring av inaktive fosfo (S
9) GSK3p og aktiv fosfo (S
473) Akt kinase. Vi derfor en hypotese om at disse elektro meklere kan påvirke ß-catenin signaliserer gjennom denne mekanismen. For å undersøke dette nærmere, brukte vi HEK 293 celler som har en intakt ß-catenin signalveien. Vi fant ut at de forskjellige a, ß-umettet carbonyls at alkylerte PTEN (6 mikrometer Δ12 PGJ
2, 6 mM 4-HNE og 20 mikrometer akrolein) alle forårsaket en tidsavhengig økning i fosfo (S
473 ) Akt (dvs. aktiv Akt kinase), med en tilsvarende økning i fosfo (S
9) GSK3p (dvs. inaktiv GSK3p) og β-catenin (figur 4C). For å avgjøre om a, p-umettede carbonyls forbedret kjernefysisk β-catenin signalering, brukte vi HEK 293 celler konstruert for å stabilt uttrykke WNT3A og SuperTopFlash (STF) reporter genet [46]. Disse cellene, kalt STF3A celler, og dermed hemmelig WNT3A, en autokrint /parakrint stimulans for FZD reseptorer som bremser APC-avhengig nedbrytning av β-catenin (figur 5A). Nuclear β-catenin signalisering i STF3A celler er proporsjonal med deres luciferase-ekspresjon (aktivitet), og de er responsive til DKK1, en WNT antagonist som hemmet β-catenin signalisering i STF3A celler på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 5B).
(A) STF3A celler havn en stabilt integrert transgen som uttrykker WNT3A (). Når utskilt, utløser WNT3A autokrint /parakrint stimulering av Fzl reseptorer () som hemmer APC-avhengig omsetning på β-catenin (). Hvis β-catenin ikke er fosforylert av GSK3p, kan det hope som et β-catenin: LEF dimer () og binder seg til arrangører på stabilt integrert β-catenin: luciferasereportergenet (SuperTop Flash) (). Luciferaseaktivitet i cellelysater er proporsjonal med atom β-catenin signalering. (B) Kjerne β-catenin signale (luciferase luminescens) i STF3A-celler (2 x 10
4 celler /brønn) dyrket i 24 timer i medium inneholdende 0, 10 eller 30 ng /ml DKK1 (middel + SD, n = 3). DKK1, en wnt antagonist, hemmet β-catenin signalering (C) Kjerne β-catenin signalisering i STF3A celler (2 x 10
4 celler /brønn) dyrket i 24 timer i medium inneholdende 20 uM av cyPGs; α, β-enals eller primære PG-er. Flere reaktive elektro forbedret β-catenin signal av ~2-4 fold. Histogram representerer den midlere + SEM, n = 4.
Flere reative karbonyl-metabolitter, hver med en elektrofil α, β enon eller enal substituent, forsterket ekspresjon av β-catenin: luciferase reporter-genet i STF3A celler (figur 5C). Luciferaserapportørplasmid aktivitet økte med ~4-fold over baseline (p 0,01) i STF3A celler inkubert med Δ12 PGJ
2 eller 4-HNE; ved ~3-fold (p 0,01) i celler med annen PGJ-analoger, akrolein eller 4-on; og ved ~1.5 ganger (p 0,05) i celler med PGA
2. I samsvar med vår mekanistisk hypotese, verken PGB
2 eller MDA hatt en påviselig effekt. PGB
2 er et cyPG, men tautomeri hindrer ladningen de-lokalisasjon som kreves for å skape et elektro β karbon, noe som er nødvendig for protein alkylering. MDA (β-hydroksy-acrolein) penetrerer cellemembranen dårlig fordi det er 99% ionisert ved fysiologisk pH ~7.4 anvendt i våre forsøk. Verken PGE
2 eller andre primære PG metabolitter av COX-1 eller -2 hadde noen effekt på kjernefysisk β-catenin signal i STF3A celler. Vi gjør oppmerksom på at ektopisk over-uttrykk for EP-reseptorer i HEK 293 celler var nødvendig for å lokke fram noen PGE
2 mediert β-catenin signal [47]. Den svake responsen på PGE
2 og andre PG-er i figur 5C kan gjenspeile de konstituerende nivåer av EP, FP, DP eller IP-reseptorer i STF3A celler eller rask metabolisme av PGS, eller begge deler.
Forbedret β- catenin signal i STF3A celler var konsentrasjonsavhengig mellom 2-20 mikrometer for akrolein, 4-HNE og Δ12 PGJ
2 (Figur 6A). Nedbryting av cellulær GSH til -10% av baseline ved behandling med 100 mikrometer BSO forsterkes β-catenin signalering, f.eks i STF3A celler behandlet med 2 og 6 mikrometer Δ12 PGJ
2 (figur 6B). Dette er konsistent med rollen til redusert glutation i konjugering av reaktive metabolitter, og beskyttelse av redox-sensitive proteiner fra alkylering [20].
(A) Kjerne β-catenin signale (luciferase luminescens) i STF3A celler ( 2 x 10
4 celler /brønn) dyrket i 24 timer i medium som inneholdt 0, 2, 6 og 20 pM hver av akrolein (□), Δ12 PGJ
2 (▪) og 4-HNE (▪). (B) Kjerne β-catenin signalisering i STF3A celler (2 x 10
4 celler /brønn) dyrket i 24 timer i medium som inneholdt 0, 2 eller 6 pM av Δ12 PGJ
2 alene (▪) eller Δ12 PGJ
2 pluss 100 mikrometer BSO. GSH nivåer falt med 79% og 88% ved 6 og 24 timer etter behandling celler med BSO; 92-95% av celler var fremdeles levedyktige ved 24 timer. Barer representerer gjennomsnitt ± SEM fra n≥3 separate forsøk.
Diskusjoner
PTEN
tumor suppressor genet er ofte mutert eller inaktivert i avansert kreft [26 ], [48]. PTEN er en phosphoinositide-3-fosfatase som metaboliserer PIP
3 til PIP
2 [36], og dermed teller regulerende PKB /Akt, en serin /treonin kinase proto-onkogen som styrer anabole vekst og spesifikasjon av celle skjebne [33], [34], [35]. PTEN, i seg selv, blir regulert post-translasjonelt ved fosforylering [49], acetylering [50], og reversibel oksydasjon av sin katalytiske cystein
124 rest [28], [29]. Oksydasjon av cellulær PTEN kan involvere H
2o
2 avledet fra NADPH oksidase [51], superoksiddismutase [52], eller enzymatisk peroksidasjon av arakidonsyre (AA) av COX-1, COX-2 eller 5-LOX [53]. Alle disse enzymene er vanligvis over-uttrykkes og aktiveres av inflammasjon eller neoplastisk transformasjon. PTEN oksydasjon, og en hvilken som helst betjening patofysiologi, varierer med graden av cellulær eksponering overfor reaktive oksygenarter (ROS). I disse studiene demonstrerer vi at kjemien som muliggjør oksydasjon av PTEN kan også lette dets alkylering av elektrofil α, ß-enals og α, p-enones [19], [20].
PTEN illustrerer tilpasningen redoks-responsive tioler for cellesignalisering, så vel som deres potensielt sikkerhets til biprodukter fra oksidativt stress og inflammasjon. PTEN er inaktivert av to karakteristiske redoks-mediert prosesser: 1) intra- eller intermolekylær disulfid dannelsen av ROS og 2) tiolat karbonyleringskatalysator (Michael tillegg) ved elektrofil α, ß-umettet carbonyls (Figur 1-3). Hydrogenperoksyd (H
2o
2), en prototypisk ROS, hemmer cellulær PTEN ved direkte oksydasjon av sin katalytiske Cys
124 til en sulfensyre-mellomprodukt, som deretter danner et inaktivt, intra-molekylær Cys
124-71 disulfid [28], [29]. Våre data viser at flere representative, elektrofile karbonyl-arter (α, ß-enals og α, ß-enones), som kan forekomme endogent som biprodukter av lipidperoksidasjon i løpet av betennelse eller oksidativt stress, alkylat og inaktiverer PTEN. Inaktivering av PTEN av redoks-medierte fremgangsmåter fører til en økning i aktiviteten av proto-onkogen Akt. Hyperaktive av Akt øker spredning og overlevelse av mange forskjellige kreftformer.
Signa av H
2o
2 spenner over et vidt patofysiologisk kontinuum [54] og en tilsvarende rolle for reaktive elektro virker troverdige. Reaktive karbonyl-arter, slik som akrolein, 4-HNE og Δ12PGJ
2 representerer et sub-sett av elektrofiler som vanligvis produseres under oksidativt stress og inflammasjon. Disse funnene kan ekstrapolere til elektro agenter mangler en karbonyl men inneholder andre elektrontiltrekkende grupper, og vi referere til dem generelt som «reaktive elektro». Først som H
2o
2, oppstår reaktive elektro
in vivo
ved betennelse og oksidativt stress [16], [18], [19], [22]. For det andre reaktive elektro kovalent modulere andre proteiner som regulerer viktige signalprosesser; dvs. LKB1 /STK11 [55], NFKB [56], og IKKβ. Tredje, H
2o
2 og reaktive elektro begge stammer fra en kombinasjon av spontane og enzymatiske prosesser, som ofte sammenfaller i betent vev [57]. H
2o
2 stammer fra superoksid anion, O
2
– den primære metabolitten av NADPH oksidase. Spontan og enzymatisk dismutering konverterer O
2
– i H
2o
2. Likeledes genererer spontan og enzymatisk lipidperoksydasjon akrolein og 4-HNE [18], [57]. cyPGs stamme fra lipid endoperoxide PGH
2, hovedmetabolitten av COX-1 og -2. Enzymatisk og spontan spalting av endoperoxide obligasjoner konverterer PGH
2 inn PGE
2 og PGD
2; albumin /serum bevirker da deres dehydratisering til PGA
2, PGJ
2, og deres isomerer [14], [16], [24].
spekulativ, viser det seg at ROS og reaktive elektro (H
2o
2, akrolein, 4-HNE, Δ12 PGJ
2) kan ha både utviklet seg til å spille ulike roller i medfødt immunitet: 1) tilintetgjøre patogener og 2) å løse betennelse. Analogt til inaktivering av NFkB og IKKαβ, midlertidig inaktivering av PTEN tumor suppressor protein ved sin alkylering, og tilhørende aktivering av PKB /Akt kinase proto-onkogener, kan bidra til å normal morfologi og histologi ved akutt betent vev ved å slippe sin begrensning på celleproliferasjon, anabole vekst og skjebne spesifikasjon [34], [35]. I vanlige situasjoner reparasjon og oppløsning skal hjelpe avslutte medfødte immun betennelse (figur 7,). Imidlertid kan denne mekanismen også konferere uunngåelig risiko hvis PTEN ble inaktivert errantly eller vedvarende. Videre reaktive elektro også inaktivere andre kjente kreftdempere, inkludert p53 [30] og LKB1 /STK11 [55]. Denne kombinerte og vedvarende inaktivering av tumor-suppressorer kan bidra vesentlig til inflammasjon assosiert tumorigenesis og deretter forlenger syklus av tumorassosiert para-betennelse (figur 7). Totalt sett, våre data og modell på linje med den observasjon at svulster er sår som ikke leges [58]. I denne situasjonen kan tumorprogresjon utlede dels fra mal-tilpasning av en molekylær mekanisme som utviklet seg til å si opp og løse medfødte immun betennelse.
Betennelse er en kritisk komponent for tumorprogresjon. Mange kreft oppstår fra nettstedene til infeksjon, kronisk irritasjon og betennelse. Svulsten mikromiljøet, som består i stor grad av betennelsesceller, spiller en stor rolle i neoplastiske prosessen, fremme spredning, overlevelse og migrasjon. Vi viser her at reaktive karbonylforbindelser arter som vanligvis produseres under betennelse kovalent endre og inaktivere PTEN tumor suppressor. Viktigere, kan mekanismen vi beskriver også ekstrapolere til: 1) andre elektro arter som genereres av inflammasjon, oksidativt eller xenobiotisk belastning (dvs. andre α, ß umettede aldehyder og ketoner, allyliske eller vinyl epoksider, kinoner, chlorhydrins, kloraminer, vinyl sulfoner, og 2) andre medlemmer av PTP super som er redoks sensitive. Disse studiene utvide vår forståelse av de mekanismer som betennelse bidrar til initiering og progresjon av kreft.
Materialer og metoder
Material
Vi brukte minimum essensielt medium (MEM) , kosttilskudd, storfe insulin, gentamicin, menneskelige embryonale nyre HEK-293 celler, og HEK-293 celler som inneholder Epstein Barr virus kjernekraft antigen 1 genet (HEK-EBNA1) (Invitrogen, Carlsbad, California); MCF-7 celler (HTB-22, American Type Culture Collection, Manassas, VA); PGS, cyPG-biotin analoger og WST spredning analysesett (# 10008883) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan); Komplett ™ proteasehemmer blanding (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN); lyseringsbuffer 0,6% Igepal CA-630 i PBS (Promega; Madison, WI); NeutrAvidin konjugerte perler, NEM-biotin og geit anti-biotin polyklonale antistoffer (# 31852) (Pierce Chemical, Rockford, IL); en PI3-K-hemmer, LY294002 (# 9901), polyklonale antistoffer mot PTEN (# 9552), Akt (# 9271), fosfo (Thr
308) Akt (# 9375), fosfo (S
473 ) Akt (# 9271), fosfo (S
9) GSK3p (# 9336), GSK-3β (# 9332), fosfo (Ser
33/37 /Thr
41) β catenin ( # 9561S) K /RxK /RxxS /T (PO
4) epitoper (# 9614) og fosfo (S
241) PDK1 (# 3061) (cellesignalisering Technologies; Danvers, MA); β-catenin (# C19220) (BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ); HRP (pepperrot peroksidase) konjugerte sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner og Western Lightning ™ Chemiluminescence reagenser (Perkin-Elmer, Waltham, MA); PTEN enzym analysesett (# 17-351) (Upstate bioteknologi, Lake Placid, NY); Akt inhibitor IV (# 124011) (Calbiochem, San Diego, CA); akrolein (# 01680), krotonaldehyd (# 262668), L-Buthionine-sulfoksiminforbindelser (BSO) (B2515), H
2o
2 30% løsning (H-1009), malondialdehyde (Fluka Cat. # 63287) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); DKK-en (# 1096-DK-010) (R Cellene ble frosset ved -80 ° C i 15 min; overføres til vakuum og inkubert i 1 time, 25 ° C med 1 ml av O
2-fri ekstraksjonsbuffer (50 mM NaHPO
4, pH 7,0, 1 mM EDTA, 10 mM NEM [N-etyl maleimid], 10 mM IAA [jodeddiksyre], 1% Triton X-100, 5 mM NaF, 50 ug /ml leupeptin og 50 pg /ml aprotinin). Denne behandlingen selektivt alkylerer alle reduserte tioler i PTEN, men ikke oksydert tioler eller thioler modifisert ved Michael-addisjon med reaktive elektrofiler. Prøvene ble vasket i 1 ml O
2-fri ekstraksjonsbuffer deretter overført til et 15 ml konisk rør. Etter tilsetning av SDS til en sluttkonsentrasjon på 1% volum /volum, ble blandingen holdt i 2 timer ved 25 ° C i mørke, og proteiner ble utfelt med TCA [trikloreddiksyre], 10% volum /volum i 1 time.
