Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er et medlem av ErbB familien av reseptor tyrosin kinaser. EGFR er aktivert ved binding til f.eks epidermal vekstfaktor (EGF), som fører til celleoverlevelse, proliferasjon og migrasjon. EGFR overaktivering er assosiert med tumorprogresjon. Vi har tidligere vist at lave doser UVB belysning av kreftceller som overuttrykker EGFR før tilsetning av EGF stanset EGFR-signaleringsreaksjonsveien. Vi her viser at UVB belysning av det ekstracellulære domene av EGFR (sEGFR) induserer protein konformasjonsendringer, disulfidbro brudd og dannelse av tryptofan og tyrosin-fotoprodukter som dityrosine, N-formylkynurenine og kynurenine. Fluorescens-spektroskopi, sirkulær dikroisme og termiske studier bekrefter forekomsten av konformasjonsendringer. En immunoanalyse har bekreftet at UVB-lys induserer strukturelle endringer i EGF-bindingssetet. Et monoklonalt antistoff som konkurrerer med EGF for binding sEGFR ble anvendt. Vi rapporterer et klart bevis på at UVB-lys induserer strukturelle endringer i EGFR som hemmer den riktige binding av en EGFR-spesifikt antistoff som konkurrerer med EGF for binding av EGFR, noe som bekrefter at 3D-strukturen til EGFR-bindende domene led konformasjonsendringer ved UV-belysning. Irradiansen brukes i samme størrelsesorden som den integrerte intensiteten i solens UVB-serien. Den nye teknologien fotoniske deaktiverer en nøkkel-reseptor, og er mest sannsynlig anvendes for behandling av forskjellige typer kreft, alene eller i kombinasjon med andre behandlinger
relasjon:. Correia M, Thiagarajan V, Coutinho I, Gajula GP, Petersen SB, Neves-Petersen MT (2014) Modulerende strukturen av EGFR med UV-lys: Nye muligheter i kreftbehandling. PLoS ONE 9 (11): e111617. doi: 10,1371 /journal.pone.0111617
Redaktør: Federico Quaini, Universitetet-Hospital of Parma, Italia
mottatt: 18. mai 2014; Godkjent: 06.10.2014; Publisert: 11.11.2014
Copyright: © 2014 Correia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. MC erkjenner støtte fra «Fundaço para en Ciencia e Tecnologia» (FCT) for doktorgradsstipend (SFRH /BD /61012/2009) som støttes av «Programa Operacional potencial Humano «(POPH) innenfor rammen av» Quadro de referencia estrategica Nacional «(QREN) og co-finansiert av European Social Fund (» Fundo Social Europeu «, FSE). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ErbB familien av reseptor tyrosin kinaser (RTK) spiller en sentral rolle i regulering av normale cellulære prosesser som celle overlevelse, spredning og migrasjon [1], [2] og har en avgjørende rolle i utvikling og progresjon av kreft [3]. Epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR, ErbB1) er et medlem av denne familien [4]. EGFR å binde til ligander som for eksempel epidermal vekstfaktor (EGF) eller transformerende vekstfaktor alfa (TGF-α) fører til reseptor-dimerisering og til aktivering av det intracellulære tyrosinkinase-domene [1], [2]. Det ekstracellulære domene av EGFR (sEGFR, oppløselige ekstracellulære område av EGFR) omfatter 4 underdomener: 2 store homologe bindingsdomener (I og III), og 2 er homologe furin-liknende cystein-rike domener (II og IV). Domener I, II og III har blitt funnet å være direkte involvert i ligandbinding og dimerdannelse at forut for mekanismen for signaloverføring ved RTK’er [1], [5], [6]. Progresjon av kreft har blitt korrelert med økningen i antall EGFR-molekyler på celleoverflaten [7]. Høy uttrykk for EGFR er vanligvis forbundet med invasjon, metastaser, sent stadium sykdommen, kjemoterapi motstand, hormonbehandling motstand og dårlig allmenn terapeutisk utfall. EGFR overekspresjon har blitt funnet å være en sterk prognostisk indikator i hode og hals, eggstokk, cervical, blære og øsofagale kreft, en beskjeden prognostisk indikator i bryst, kolorektal, gastrisk og livmorkreft og en svak prognostisk indikator i ikke-små-celle lunge kreft [7]. EGFR er målet for mange chemotherapeutical tilnærminger fordi EGFR aktivisering resultater i cellesignalkaskader som fremmer tumorvekst. Inhibering av EGFR-funksjon er derfor en rasjonell behandling tilnærming. Typiske chemotherapeutical midler er EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer som konkurrerer med ATP på det intracellulære tyrosinkinase-domene, og monoklonale antistoffer (mAbs) som hindrer ligandbindende eller reseptor-dimerisering. Blokkering bindingen av EGF til EGFR kan avskaffe kreft spredning, invasjon, metastase, angiogenese og hemming av apoptose [8].
Vi har tidligere rapportert at UVB lys (280 nm, 0,35 W /m
2 for 30 min) av kreftceller som overuttrykker EGFR førte til arrestasjonen av EGFR signalveien [9]. Proof-of-concept er dokumentert på cellelinjer A431 (human epidermoid carcinoma celler) og Cal39 (utledet fra menneskelige vulva plateepitelkarsinom celler). Irradiansen brukt var lavere enn det totale UVB solinnstråling [10]. UVB hindret EGF-indusert aktivering av EGFR, avskaffe fosforylering av EGFR intracellulære domenet og andre sentrale nedstrøms signaliseringsproteiner så som AKT (proteinkinase B) og mitogen aktivert proteinkinaser (ERK1 og 2). AKT spiller en nøkkelrolle i f.eks glukosemetabolisme, apoptose, celleproliferasjon, transkripsjon og cellemigrasjon. AKT er involvert i celleoverlevelsesreaksjonsveier ved inhibering av apoptotiske prosesser [11] – [16]. ERK kinaser opptre på en signalkaskade som regulerer cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og cellesyklusprogresjon [17].
En av de mulige årsakene til den observerte UV lys indusert arrestasjonen av EGFR signalveien er UVB indusert fotokjemi, som fører til konformasjonsendringer i EGFR som mest sannsynlig hindrer den riktige binding til EGF. Vår tidligere arbeid på UVB indusert fotokjemi i proteiner (bølgelengder brukes 275-295 nm) [18] – [22] støtter denne hypotesen. UVB eksitasjon av aromatiske rester i proteiner som fører til avbrudd av disulfidbroer, og til dannelse av fotoprodukter, slik som N-formylkynurenine (NFK), kynurenine (Kyn) [23], [24] og dityrosine (DT) [25] – [27] (se figur 1). Slike reaksjoner vil mest sannsynlig forårsake strukturelle endringer i proteiner som kan svekke deres aktivitet [22]. Proteiner som er rike på aromatiske rester og disulfidbroer er sannsynlig å ha sin struktur betydelig svekket ved langvarig UVB eksitasjon. sEGFR er svært rik på disulfidbroer i forhold til den naturlige overflod gjennomsnitt av disulfidbroer i proteinstrukturer av størrelsen på sEGFR, slik det vil bli vist i resultatdelen. Det% av disulfid-broer i sEGFR er omtrent 13 ganger høyere enn ventet for et protein av dens størrelse. De forventede gjennomsnittlige resultater har tidligere blitt rapportert av vår gruppe etter en omfattende analyser av funksjonene i disulfidbroer stede i 131 ikke-homologe enkelt kjede proteinstrukturer [28]. Videre er det ekstracellulære domene av sEGFR har 40 aromatiske rester og 25 disulfidbroer per monomer og mange av de aromatiske rester er i umiddelbar nærhet av disulfidbroer (se figur 2). Derfor er det sannsynlig at UV-belysning av dette proteinet vil føre til disulfidbro brudd og til fotoprodukter. Denne hypotesen vil bli testet i vår nåværende papir.
(A) Crystal struktur av EGFR ekstracellulært domene (1ivo.pdb, kjetting A) [1]. De disulfidbroer og aromatiske rester atomer vises som CPK: SS broer i gult, Trp i grønt, Tyr i fiolett (Prøv 246 og Tyr 251 vises i rosa) og Phe i cyan. Bare 18 av 25 SS broer, 5 av 6 Trp rester, 13 av 16 Tyr rester og 17 av 18 Phe rester vises siden noen rester mangler i PDB fil. (B) Krystallstruktur av en 01:01 kompleks mellom human EGF og den dimere form av EGFR-ekstracellulært domene (1ivo.pdb, kjede A og B og 2 molekyler EGF [1]). EGF vises i rødt. (C) Zoom inn i grensesnittregionen til stede i den dimere av EGFR (ekstracellulære domener). Avstander blant noen av de aromatiske rester og de nærliggende disulfidbroer vises også. (D) Krystallstruktur av en 01:01 kompleks mellom human EGF og den dimere form av EGFR-ekstracellulært domene. (1ivo.pdb, kjetting A og B og 2 EGF molekyler [1]) er EGF vist i rødt. I høyre panel alle atomene vises som CPK. EGF docking til sEGFR innebærer omfattende ikke-kovalente kontakter.
Mens farene ved overeksponering for sollys har blitt godt offentliggjort, mindre oppmerksomhet har blitt gitt til de helsemessige fordelene av UV-eksponering. Virkningene av UV-lys på biomolekyler, celler og vev, vil avhenge av den energi som leveres pr arealenhet. UVB (280-315 nm) stråling er den primære bidragsyter til vitamin D-produksjon, som har en beskyttende virkning i kolon, prostata og brystcancer [29], [30]. Eksponering for sollys i lave doser har også vært knyttet til bedre kreft overlevelse [31], [32]. UV-lys har blitt brukt til å behandle rakitt, psoriasis, lupus vulgaris, vitiligo, atopisk dermatitt og lokalisert sklerodermi og gulsott (World Health Organization De kjente helseeffekter av UV
Ultrav Radiat Intersun Program -….. FAQ
på https://www.who.int/uv/faq/uvhealtfac/en/index1.html). Det er ingen direkte og bevis som tyder på en økt risiko for hudkreft fra UVB behandlinger for psoriasis hvis stråledoser blir respektert. UV-lys blir nå brukt til å behandle kutant T-cellelymfom (American Cancer Society, 2011 kl https://www.cancer.org). Denne terapien har blitt forbedret av Food and Drug Administration (FDA, USA). De beskyttende effekter av vanlig helg soleksponering er rapportert, særlig i tilfellet av lemmer tumorer [33]. Melanom er hyppigere blant personer med innendørs yrker enn blant mennesker som har friluftsliv (uten solbrenthet) som bønder, fiskere, og barn som spiller utendørs [34], [35]. Hudkreft er fortsatt økende, men dette er et resultat av eksponering for UV-lys både av akutt overdosering (forårsaker solbrenthet) og livslang kumulativ eksponering [36]. Det er i hovedsak UVB brøkdel av solstråling som gir erytem, melanogenesis (melanin produksjon, som fungerer som en solkrem som beskytter mot DNA photodamage og erytem), vitamin D syntese, og ikke-melanom hudkreft, mens melanom er sannsynlig å være forårsaket av UVA [37]. Jones et al (1987) fant at blant UVA bølgelengder, 365 nm hadde høyest mutagen effekt [38]. UVA taleflyten priser er flere ganger høyere for sunbeds enn i tilfellet med direkte solstråling [39]. Eksemplene ovenfor dokumentere at helseeffekter av UV eksponering er dose og bølgelengde avhengig.
Målet med dette arbeidet er å undersøke om en lav dose UVB lys kan forårsake strukturelle endringer i EGF bindende stedet av EGFR som kan virke inn på riktig binding av molekyler, for eksempel et spesifikt antistoff som er kjent for å konkurrere med EGF for binding EGFR. Hvis observert, vil dette gi oss innsikt i hvorfor UVB lys (280 nm) av kreftceller som overuttrykker EGFR førte til arrestasjonen av EGFR signalveien [9]. UVB irradians som brukes er i samme størrelsesorden som den totale strålings av solenergi UVB. Flourescensspektroskopi og sirkulærdikroismeanalyse studier ble utført for å påvise UVB indusert konformasjonsforandringer endringer. Termiske utfolder studier har blitt gjort for å bestemme smeltepunktet av proteinet før og etter belysning. Lys indusert brudd av disulfidbroer er kvantifisert og har blitt oppdaget dannelsen av Trp /Tyr fotoprodukter. En bindingsimmunanalyse ble utført for å antyde virkningen av UVB belysning på strukturen av EGF-bindingssetet. Vår undersøkelse bekrefter at lavdose UVB (280 nm) belysning av sEGFR induserte strukturelle endringer i EGFR-bindende domene som svekket binding av et spesifikt antistoff er kjent for å konkurrere med EGF for binding til EGFR det aktuelle domenet. Vi ta opp de gunstige effektene av UV-lys, er det foreliggende anvendelse i behandling av sykdommer og potensialet i vår antatte nye fotoniske terapi for behandling av lokaliserte tumorer assosiert med overekspresjon av UV-sensitive cellulære reseptorer.
Resultater
Tredimensjonal struktur av monomere og dimere sEGFR
i figur 2A vises 3D-strukturen til monomere sEGFR (1ivo.pdb, kjede A) bundet til epidermal vekstfaktor (EGF, i rødt) . sEGFR inneholder 25 SS broer, 6 Trp rester, 16 Tyr rester, og 18 Phe rester, vises som CPK: SS broer i gult, Trp i grønt, Tyr i fiolett (Tyr246 og Tyr251 i rosa) og Phe i cyan. Bare 18 av 25 SS broer, 5 av 6 Trp rester, 13 av 16 Tyr rester og 17 av 18 Phe rester vises siden noen rester mangler i PDB fil. Flere aromatiske rester er plassert i umiddelbar romlig nærhet av SS obligasjoner.
I figur 2B vises 3D-struktur av EGFR dimer (1ivo.pdb, kjeder A og B) som dannes ved binding EGF (i rødt). Dimeren grensesnittet er rik på disulfidbroer og aromatiske rester (fig. 2B). Rester Tyr246 og Tyr251 (figur 2B, i rosa) fra en kjede, er sammenvevd med de samme rester fra den andre kjeden. En zoom inn i en av kjedene blir vist i figur 2C og avstander mellom aromatiske rester og disulfidbroer er vist. EGF dokking til EGFR er vist i figur 2D (EGFR monomer). Samspillet mellom EGFR EGF og ser ut til å være sterkt avhengig av Van der Waals interaksjoner. Noen av disse interaksjonene er π-rc interaksjoner, for eksempel samspillet mellom Phe357 (i cyan) av sEGFR og Tyr13 (fiolett) av EGF (5 A).
Protein Bioinformatikk
I Figur 3 vises brøkdel av disulfidbroer som er tilstede i sEGFR og avhengighet av den gjennomsnittlige andel av disulfidbroer i proteiner kjedelengden [28]. Forventet gjennomsnittlig brøkdel av disulfidbroer for proteiner med sekvens lengde på 600-650 rester er ~0.3%, mens i sEGFR (622 aa) er det ~4%, noe som bekrefter at dette proteinet er overmåte rike i disulfidbroer. De forventede gjennomsnittlige resultater har tidligere blitt rapportert av vår gruppe etter å gjøre en omfattende analyse av funksjonene i disulfidbroer stede i 131 ikke-homologe enkelt kjede proteinstrukturer [28].
brøkdel av disulfidbroer ble beregnet som antallet disulfidbroer som finnes i et protein dividert med proteinsekvenslengde (antall aminosyrer) x 100. den fraksjon av disulfidbroer som er tilstede i den monomere ekstracellulære domene av EGFR vises.
steady State fluorescence
fluorescens utslippsintensiteten av sEGFR ved 350 nm reduseres ved kontinuerlig 280 nm eksitasjon (Figur 4A). Den kinetiske spor er best tilpasset ved en bi-eksponentiell modellen (figur 4A og metoder). Roten mean square error R
2 var 0,99774. De gjenopprettede fra beslaget for C1 og C2 verdiene var 367240,44 ± 1182,23 og 208449,95 ± 1054,90, henholdsvis. Hastighetskonstantene av fluorescens utslippsintensiteten nedgang k1 og k2 montert verdiene var 117,63 ± 0.71 min-1 og 12,20 ± 0,10 min-1, henholdsvis.
(A) Fluorescens utslippsintensiteten kinetikk ved 350 nm av menneskelig ekstracellulære EGFR (sEGFR) prøve i løpet av 75 min UV-lys ved 280 nm. (B) Fluorescens emisjonsspektra av sEGFR prøver tatt ved 295 nm eksitasjon 280 nm etter belysning for 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min. (C) Fluorescens eksitasjon spektra av sEGFR prøvene som er tatt med utslipp fastsatt til 334 nm eksitasjon etter 280 nm belysning for 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min.
Emission Spectra (eksitasjon 280 nm og 295 nm).
Utslipp spektra av sEGFR ble registrert ved 280 nm eksitasjon før og etter kontinuerlig 280 nm belysning (15 min, 30 min, 45 min og 75 min på 2,5 W /m
2) (ikke vist). En reduksjon i intensitet av fluorescens-emisjon ved ~337 nm, hvor Trp og Tyr avgir, er observert som følge av kontinuerlig belysning. Utslippsintensiteten ved 337 nm reduseres med 43% og 74% etter 15 min og 75 min med kontinuerlig belysning 280 nm, respektivt. Bølgelengden av den mest intense toppen som er sentrert på 337 nm er konstant.
emisjonsspektra av sEGFR registreres ved 295 nm eksitasjon før og etter kontinuerlig 280 nm lys (15 min, 30 min, 45 min og 75 min ) er vist i figur 4B. En reduksjon i intensitet av fluorescens-emisjon ved ~337 nm, hvor Trp avgir, er observert. Emisjons intensiteten av sEGFR ved 337 nm reduseres med 42% og 77% etter 15 min og 75 min med kontinuerlig belysning 280 nm, respektivt. Bølgelengden av de mest intense topp sentrert ved 337 nm er observert til rød-skift til 343 nm etter 75 min av belysning.
Eksitasjon Spectra (emisjon 334 nm).
I figur 4C er vist eksitasjon spektra av sEGFR med fluorescensemisjon satt til 334 nm, før og etter kontinuerlig 280 nm belysning av proteinet i forskjellige tidsperioder: 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min. Trp og Tyr absorpsjon bidrar til dette spekteret. Kontinuerlig 280 nm lys fører til en progressiv reduksjon i fluorescens-eksitasjon intensitet. Etter 15 min og 75 min av belysning, eksitasjon intensitet ved 282 nm reduseres med 40% og 71%, respektivt. Den korrespondent normalisert eksitasjon spektra (ikke vist) viser ingen endring i bølgelengden ved maksimal eksitasjon intensitet (~282 nm).
fluorescens basert protein termiske utfolder studier.
fluorescens utslippsintensiteten på 330 nm (eks. 295 nm) av en frisk sEGFR prøve (ikke-Illum.) og belyst sEGFR prøve (75 min ved 280 nm) ble overvåket fra 4 ° C til 90 ° C og fra 90 ° C til 4 ° C (se fig. 5). For begge prøvene fluorescensemisjonen intensiteten avtar ved oppvarming. En overgang mellom 65-75 ° C observeres for de ikke-belyste sEGFR. Data har blitt montert ved hjelp av en modifisert Boltzmann funksjon (se metoder). Roten mean square error for montering R
2 var 0,99774. De gjenopprettede fra beslaget for
A
1,
B
1,
A
2,
B
2 og
dx
verdier var 1,06202 ± 0,0014, 0,45482 ± 0,02255, -,00426 ± 5.41E-04, -,00296 ± 2.72E-04 og 1,74 ± 0,17, henholdsvis. Det gjenvunne Parameteren
x
0 (69,7 ° C ± 0,24 ° C C) tilsvarer midtpunktet av overgangen, det vil si til smeltetemperaturen for proteinet. Denne verdien er i overensstemmelse med vendepunkt verdier hentet fra den andre deriverte av de monterte data (ikke vist). Den andre deriverte er lik null (vendepunkt) innenfor intervallet 68,3 til 69,2 ° C. En slik overgang er ikke observert for den opplyste prøven. Videre er ingen overgang observert for begge prøvene ved kjøling proteinet fra 90 ° C til 4 ° C.
Ikke opplyst (ikke Illum.) Og UV opplyst (Illum. I 75 minutter) humant ekstracellulære EGFR (sEGFR ) prøvene ble oppvarmet fra 4 ° C til 90 ° C. Montert verdier (non-opplyst prøve) ble oppnådd ved hjelp av en modifisert Boltzmann funksjon (se resultater avsnitt). Overgangen midtpunktet utvinnes fra beslaget var på 69,72 ± 0,24 ° C.
Tid Løst fluorescens.
De nedbrytningstid (τ
i) og pre-eksponentiell faktorer (
f
i) gjenvinnes fra tidsoppløst intensitet avtar for kontrollprøven sEGFR (75 min i mørket, negativ kontroll, NC), og det belyste sEGFR prøven (Illum. for 75 min ved 280 nm) ved pH 7,5 er vist i tabell 1. Figur 6 viser eksperimentelle data, anfall og rester forutsatt tre levetid avtar for sEGFR kontrollprøve (NC). Verdien av χ
2 falt betydelig når framdrift fra en livstid komponent skikket til to og tre komponenter. Fluorescens bety levetid sEGFR er vist i Tabell 1. Ikke opplyst sEGFR viser tre liv: 1,04 ns, 2,74 ns og 6,23 ns med intensitet fraksjoner av 25,6%, 53,1% og 21,1%, henholdsvis. Ved belysning, bidraget fra den korteste levde 1,04 ns arter økte fra 25,6% til 30,6%, ble det bidraget av 2,74 ns arten holdes konstant og bidrag av de lengre levde arter ble redusert fra 21,1% til 16,4%. Videre levetid lenger levde komponenten økt fra 6,2 ns til 7,0 ns mens levetiden for de to andre komponentene holdt seg konstant.
Tids løst intensitet forfall data, montering kurve og rester ved bruk av det ISS rutine for kontroll sEGFR prøven (holdt i mørket i 75 min, negativ kontroll, NC).
Eksitasjon Spectra (emisjon 400 nm).
i figur 7A vises eksitasjon spektra (emisjon ved 400 nm) oppnådd før og etter kontinuerlig 280 nm lys (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 62 min og 75 min). Spectra ble registrert for å bekrefte tilstedeværelse av NFK, dityrosine og Kyn (Fig. 1). I tabell 2 vises deres absorbans og fluorescens-emisjonsegenskaper. Ved 0 min, er en eksitasjon topp observert sentrert ved ~281 nm. Dens intensitet henfaller ved UV belysning av sEGFR, minkende 52% etter 75 min. Men belysning av sEGFR fører til en økning av fluorescens eksitasjon over 305 nm. Etter 75 min, fluorescerende eksitasjon intensitet økte 115% ved 315 nm, hvor dityrosine maksimalt absorberer (Abs
max ved 316 nm, [40], se tabell 2), 149% ved 322 nm, hvor NFK maksimalt absorberer (Abs
max ved 321 nm, [23], se tabell 2) og 173% ved 360 nm, hvor Kyn maksimalt absorberer (Abs
max ved 360 nm, [23], se tabell 2).
(A) Fluorescens emisjonsspektra av human ekstracellulære EGFR (sEGFR) prøver tatt opp ved 320 nm eksitasjon 280 nm etter belysning for 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min. (B) Fluorescens emisjonsspektra av sEGFR registreres ved 360 nm eksitasjon 280 nm etter belysning for 0 min, 15 min, 30 min, 45 min og 75 min. (C) Fluorescens eksitasjon spektra av sEGFR oppnådd med fluorescens utslipp fastsatt til 400 nm etter 280 nm belysning for 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min.
Emission Spectra (eksitasjon 320 nm).
for å verifisere dannelsen av dityrosine (DT) og NFK, ble emisjonsspektra fås ved 320 nm eksitasjon før og etter 280 nm belysning (fig. 7B). En økning i fluorescens utslippsintensiteten på 400-405 nm (eks. 320 nm) er observert. Den maksimale fluorescensemisjonen er sentrert ~400 nm, som tilsvarer den maksimale utslipp av DT (Em
max ved 400-409 nm, [25], [40], se tabell 2) og til en spektral region hvor NFK kan også avgir (for NFK, Em
max ved 400-440 nm [23], tabell 2). Etter 75 min, fluorescens utslippsintensiteten 400 øker nm med 129%. En liten emisjonstopp ved ~368 nm observeres på spektrene oppnådd ved 0 min og 15 min av belysning på grunn av den Raman bidraget fra vann. Raman spektrale korreksjoner ikke fjerne denne toppen.
Emission Spectra (eksitasjon 360 nm).
For å bekrefte tilstedeværelse av kynurenine (Kyn) (Abs
max ved 360 nm , [23], Tabell 2) i sEGFR, emisjonsspektra ble erholdt ved 360 nm eksitasjon før og etter 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min til 280 nm lys (fig. 7C). Kyn absorberer maksimalt ved 360-365 nm og fluoriserer maksimalt ved ~434-480 nm ([23], Tabell 2). Kontinuerlig UVB belysning av sEGFR fører til en økning av fluorescens sentrert på ~430-435 nm. Fluorescensintensiteten ved 430 nm økte 53% og 172 etter 15 min og 75 min belysning, respektivt.
tiolgruppe største mengde
For å bekrefte at UV-belysning av sEGFR har ført til SS avbrudd konsentrasjonen av løsemiddeltilgjengelige tiolgrupper er blitt bestemt med Ellmans analyse for en kontrollprøve sEGFR holdt i mørke i 75 min (negativ kontroll, NC), og for en prøve som tidligere belyst ved 280 nm i 75 minutter. Den detekterte konsentrasjonen av frie tiolgrupper er 2,9 ganger høyere i det belyste prøve (Fig. 8). Frie tiolgrupper i belyses sEGFR er ~ 1 uM.
Kontrollprøven av sEGFR ble holdt i mørke i 75 min (negativ kontroll, NC). Gratis tiol grupper har blitt oppdaget ved hjelp av Ellmann sin analyse.
sirkulærdikroismeanalyse studier
I figur 9A vises CD-spektret av fersk sEGFR (non-Illum.) Og opplyst sEGFR ( 75 min ved 280 nm). Den vidt UV-CD-spekteret for det ikke-belyste sEGFR viser noen av de klassiske vidt UV trekk ved protein sekundær struktur, med tilstedeværelse av en dobbelt minimum ved 208-210 nm og 220-222 nm, karakteristisk for α-heliks innhold . p-ark-struktur innhold (karakteristisk minimum ved ~218 nm) kan også bidra til den andre minimum ved 220-222 nm [41]. Langvarig eksitasjon med UVB-lys fører til en reduksjon i den elliptisitet intensitet ved 205-225 nm og til en spektral forskyvning. Den ellipticity på 207,5 nm og 220 nm har gått ned med 9% og 20%, henholdsvis. Videre er den første negative spiss forskjøvet fra 207,5 nm til 203 nm.
(A) Far UV-CD-spektrene ble tatt opp for en ny sEGFR oppløsning (ikke Illum.) Og en sEGFR prøve som tidligere er opplyst ved 280 nm (Illum. 75 min). (B) Sirkulære dichroim termiske utfolder kurver av fersk sEGFR (non-Illum.) Og UVB belyst sEGFR (Illum for 75 min.) Ble oppnådd ved oppvarming fra 4 ° C til 90 ° C (1 ° C.min
– 1). Den ellipticity signalet ble konstant overvåket ved 220 nm. Smeltetemperaturen av ikke opplyst sEGFR, som tilsvarer overgangsmidtpunktet av kurven, ble gjenvunnet ved montering av kurven med en Boltzmann-funksjon (se metoder).
Sirkulær dikroisme basert protein termisk utfolding studier~~POS=HEADCOMP.
elliptisitet intensitet ved 220 nm av fersk sEGFR (ikke Illum.) og av belyst sEGFR (75 min ved 280 nm) ble kontinuerlig overvåket fra 4 ° C til 90 ° C (fig. 9B). For begge prøvene elliptisitet intensitet ved 220 nm avtar ved oppvarming. En overgang med midtpunkt mellom 60-70 ° C observeres for de ikke-belyste sEGFR prøven. Data har blitt utstyrt med en Boltzmann funksjon (se metoder). Roten mean square error for montering R
2 var 0,99921. De gjenopprettede fra beslaget for verdier
A
1,
A
2 og
dx
var -0,96 ± 9.97E-4, -0,83 ± 0,002 og 2,59 ± 0,08 hhv. Temperaturen i midten av overgangs
x
0 montert verdien var 64,70 ± 0,07 ° C, svarende til smeltetemperaturen for proteinet. Denne verdien er i overensstemmelse med den verdi gjenvinnes ved fluorescens-spektroskopi vist i figur 5. En slik overgang er ikke observert for den belyste prøve.
EGFR-bindende immunoassay
A bindingsimmunanalyse ble brukt til indirekte adgang effektene av UV-belysning på strukturen på sEGFR bindingssetet til EGF /TGF-α. Resultatene som vises i figur 10 viser at ikke-belyste sEGFR binder LA1 anti-EGFR (kolonnene «No-UV», friske prøven; og «NC», negativ kontroll, prøve holdt i mørke i 75 min). sEGFR prøve belyst med 280 nm lys i 75 minutter ikke lenger binder LA1 anti-EGFR, bekreftet ved fullstendig forsvinning av sEGFR båndet (figur 10, sporene «UV»). To sett av duplikate prøver ble analysert. Signal belastningsprofiler langs proteinbåndene er vist. Intensiteten observert i de regionene hvor opplyst sEGFR var til stede ( «UV» baner) er innenfor den observerte støynivå (støy intensitet fra ~0.02 til 0,2).
I hver brønn, nøyaktig 1,4 mikrogram av ikke opplyst ( «No-UV»), UV opplyst for 75 min ( «UV») og negativ kontroll ( «NC») sEGFR prøvene ble lastet inn. Prøvene lastet på vel 1-3 er duplikater av prøver 4-6, men ble behandlet uavhengig etter UV-belysning. Intensiteten profil sammen brønnene viser at signalet er observert i brønnene med ikke-opplyst protein, men ikke noe signal er til stede i brønnene som inneholder UV-belyst proteinprøver.
Diskusjoner
UVB eksitasjon av aromatiske rester fører til dannelsen av fotoprodukter. Tryptofan kan danne tryptophanyl kation radikal, N-formylkynurenine (NKF) og kynurenine (Kyn) (Fig. 1). NFK og Kyn er av spesiell viktighet ettersom de er fotosensibilisatorer som kan generere reaktive oksygenarter (ROS) ved UV-absorpsjon [42], noe som ytterligere bidrar til protein strukturelle skader. Tyrosinrester er kjent for å bli omdannet til f.eks tyrosil radikaler, dityrosine, trityrosine og pulcherosine (fig. 1). Disse reaksjonene er egnet til å føre til endringer eller fullstendig tap av proteinstruktur og funksjon [22], [43]. UVB eksitasjon fører også til elektron utstøting fra sidekjedene av aromatiske rester [20], [24], [44] – [46]. Elektronet kan fanges opp av disulfidbroer, som fører til dannelsen av en forbigående disulfid elektron-addukt RSSR
• – (se ordninger 1-8, [49]), som ved dissosiasjon danner frie tiolgrupper (skjema 9, [ ,,,0],47]). Naturen har holdt aromatiske rester i romlig nærhet til disulfidbroer (SS) i proteiner [19], [28], noe som gjør avbrudd av SS en sannsynlig hendelse på UV eksitasjon. Ordningene under oppsummerer noen av fotoprodukter dannet som bidrar til SS avbrudd, som fører til conformation endringer som kan føre til tap av protein funksjon. For ytterligere informasjon vennligst se refererte litteraturen [21], [22], [24]. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)
Proteiner rike på aromatiske rester og disulfidbroer er mest sårbare for fotokjemi og skader. sEGFR er et slikt protein. Den har en total av seks Trp, Tyr 16, Phe 18 rester og 25 disulfidbroer (figur 2A). Interessant, aromatiske rester og disulfidbroer spiller en kritisk rolle ved strukturell dimeren grensesnitt (figurene 2B, 2C og 2D) som indikerer at UVB-induserte fotokjemi vil mest sannsynlig svekke EGFR-dimerisering. Nærheten mellom aromatiske rester og disulfidbroer (figur 2C) fremmer elektronoverføring fra de aromatiske rester til broene, som fører til sitt avbrudd. UV-indusert protein inaktive innebærer rask og kort rekkevidde elektron overføring mellom photoexcited aromatiske rester og nærliggende disulfidbroer [20], [44], [45], [48]. Zhi Li et al.
