Abstract
Rollen nevroendokrin peptid kalsitonin (CT) og dens reseptor (CTR) i epithelial kreft progresjon er en voksende konsept med stor klinisk potensial. Uttrykk for CT og CTR er ofte forhøyet i prostata cancer (PC) og aktivering av CT-CTR aksen i ikke-invasive PC celler induserer en invasiv fenotype. Her viser vi ved gjær-to hybrid skjermer som CTR forbinder med den stramme krysset protein Zonula okkludens-en (ZO-1) via samspillet mellom type 1 PDZ motiv på karboksylgruppe CTR og PDZ3 domene av ZO-1 . Mutasjon av enten CTR C-PDZ-bindende motiv eller ZO-1-PDZ3 domene påvirket ikke binding av CTR med sin ligand eller G-protein-medierte signal men avskaffet destabiliserende handlinger av CT på tett veikryss og dannelse av fjernmetastaser ved orthotopically implantert PC-celler i nakne mus, noe som indikerer at disse PDZ domeneinteraksjoner ble patologisk relevante. Videre observerte vi CTR-ZO-1 interaksjoner i PC eksemplarer av nærhet ligation immunhistokjemi, og funnet ut at antall interaksjoner i metastatisk PC prøvene var flere ganger større enn hos ikke-metastatisk PC. Våre resultater for første gang viser en mekanisme som PDZ-mediert interaksjon mellom CTR og ZO1 er nødvendig for CT-stimulert metastaser fra prostatakreft. Siden mange reseptorer inneholde PDZ-bindende motiver, ville dette tyder på at PDZ-bindende motiv-adapter protein interaksjoner utgjør en felles mekanisme for kreft metastase
Citation. Aljameeli A, Thakkar A, Thomas S, Lakshmikanthan V, Iczkowski KA, Shah GV (2016) Kalsitonin Receptor-Zonula okkludens-en interaksjon er kritisk for Kalsitonin-stimulert prostata kreft metastasering. PLoS ONE 11 (3): e0150090. doi: 10,1371 /journal.pone.0150090
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 29 oktober 2015; Godkjent: 09.02.2016; Publisert: 02.03.2016
Copyright: © 2016 Aljameeli et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. NIH CA096534
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kalsitonin reseptor (CTR) er et medlem av klassen B familien av G-protein-koblede reseptorer (GPCR), som inneholder en rekke narkotika mål. CTR binder neuroendocrine peptid CT for å opprettholde homeostase kalsium i benet og nyre [1]. Men dens uttrykk i flere organer og sine handlinger i utvikling, cellevekst og differensiering tyder på at CTR kan ha mer mangfoldig rolle Tolcos et al. [2], [3,4]. Overflod av CT og CTR transkripsjoner er økt i maligne prostata, og korrelerer positivt med Gleason grad av prostatakreft (PC). I tillegg aktivering av CT-CTR autokrint aksen stimulerer flere prosesser knyttet til tumorvekst, invasjon, angiogenese, chemoresistance og metastasering, noe som tyder på at CTR fungerer som en viktig faktor i utviklingen av en lokalisert PC til sin metastatisk form [5-7] .
CTR mRNA sekvens isolert fra human prostata mangler en 16-aminosyre innsatsen i første intracellulære loop, en karakteristikk av isoform 2 av CTR [8,9]. CTR2 par til både stimulerende GTP bindende protein G
aS og G
αq å co-stimulere adenylylcyklase og fosfolipase C [10]. I tillegg destabiliserer CTR stramt og adherens veikryss og aktiverer ikke-G protein-koblede signalveier som PI-3-kinase (PI3K) -Akt-survivin og WNT /ß-catenin [5,11]. Men den nøyaktige mekanismen som CTR stimulerer prostata kreft metastasering er ikke blitt identifisert.
Siden avbrudd av inter veikryss og oppkjøp av invasiv fenotype er obligate trinnene i tumorprogresjon, vi undersøkt virkningen av CTR på tett veikryss (TJs) og dens betydning i CTR-stimulerte metastasering av PC celler. I denne rapporten viser vi at cytoplasma (C) hale av CTR forbinder med tight junction (TJ) protein Zonula okkludens-en (ZO-1) via samspillet mellom type 1 PDZ-bindende motiv i karboksyterminal av CTR og PDZ3 domene av ZO-1. Dette samspillet er avgjørende for handlingene til CTR på TJ destabilisering samt fjernmetastaser fra prostatakreft celler.
Materialer og metoder
Dyr
BALB /c nu /nu mus (6-8 uker gamle) ble kjøpt fra Harlan (Madison, WI), og holder til to per bur i mikroisolatorbur enheter i en barriere anlegget på en høy effektivitet partikkel arrestance (HEPA) utfelt stativ under standard betingelser for 12-timers lys /mørke sykluser, matet
ad lib
på en standard autoklaveres laboratorium diett, og satt i karantene i en uke før de settes i studien.
Cell Culture
LNCaP, PC-3 og cellelinjer DU-145 ble oppnådd fra American Tissue Culture Collection (Manassas, VA), og vedlikeholdes som anbefalt av leverandør i vårt laboratorium for mindre enn seks måneder etter mottakelsen. PC-31 underlinjen var en isolert PC-tre orthologue som manglet CT og CTR mRNA (S1 bilag, S1 A-S1D fig). PC-3M cellelinjen ble gitt av Dr. Isiah Fidler (MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas). PC-3, PC-31 og PC-3M cellelinjer ble godkjent av STR profilering (S1 bilag)
DNA-konstruksjoner:. FLAGCTRwt og FLAGCTRΔESS
CTR C-PDZ bindende motiv ( ESSA) ble erstattet med alaniner ved å sette uoverensstemmelser i respektive kodoner som understreket. Primersekvensene var som følger:
Forward Primer: 5′-AAG /CTT /ATG /GAC /tac /AAG /GAC /GAC /gat /GAC /AAG /AGC /TTC /ACA /ttt /ACA /AGC /CGG /TGC /TTG-3 «
Omvendt Grunning:
CTRwt: 5′-cTC /gag /TCA /AGC /aga /TGA /cTC /TTG /cTC /tat /gat /att /CAA /agg /gat /gat /cTC-3 «
CTRΔESS: 5′-cTC /gag /TCA /AGC /AGC /AGC /AGC /TTG /cTC /tat /gat /att /CAA /agg /gat /gat /cTC-3 «
full-lengde FLAG-CTRwt og FLAG-CTRΔESS ble satt inn i pcDNA3.1 ekspresjonsvektor ved retnings kloning (Invitrogen) [12].
ZO-1ΔPDZ mutanter
ZO-1 cDNA sekvensen ble mutert ved å slette hver /eller alle de tre PDZ domener for å få følgende fire mutanter: ΔPDZ1 (aa 2-156) , ΔPDZ2 (aa 159-252), ΔPDZ3 (aa 294-633) og ΔPDZX (aa 67-1033) [13]. Alle ZO-1-konstruksjoner ble myc-merket ved den C-terminale og klonet inn i pCB6 eukaryot ekspresjonsvektor [13].
cDNA-konstruksjoner ble transfektert i PC-3-celler ved hjelp av Fugene 6 ™, som er valgt i G418, multiple kloner ble undersøkt, og de uttrykker stabil transgene uttrykk ble valgt for senere studier som beskrevet tidligere [11,14].
Gjær to-hybrid screening
cDNA sekvensen som tilsvarer C-terminale domenet av hCTR2 (rester 411-476) ble innsatt i ramme i pNLex-NLS gjærekspresjonsvektor [15]. Dette agn plasmid ble brukt til å transformere gjærstammen RFY231:
MAT ± ura3-1 his3 trp1î
::
hisG
3LexAop-
LEU2
::
leu2
. Den forvandlet gjær ble så parret med gjær (RFY309:
MAT
α
his3î200 leu2-3 lys2î201 ura3-52 trp1îhisG
: pSH18-34) pre-transformert med et menneskelig prostata cDNA bibliotek i pJG4 -5 vektor (Origene). Alle reddet kolonier ble plukket og deres galaktose avhengighet, Leu og lacZ fenotyper ble testet [15,16]. ORF for alle galaktose-avhengige kloner ble isolert ved PCR og klonet inn i transkripsjonsaktiveringsdomenet (AD) vektoren ved åpning reparasjon. AD kloner ble så parret mot agn for å bekrefte at Leu og lacZ fenotyper var avhengig av ORF. Positive AD kloner ble videre testet for spesifisitet ved å parre med 7 agn stammer uttrykker urelaterte baits (
Campylobacter
proteiner) [16].
For å kontrollere styrken på samhandling, opprinnelige agn belastningen ble parret med stammer som uttrykker hver isolert AD-klone, og reporter aktivering ble scoret på 0-3 skala for vekst på leu plater (0 = ingen vekst; 3 = maksimal vekst); og 0-5 skala for lacZ aktivitet på X-Gal-plater (0 = hvit; 5 = mørk blå). Alle interactors i dette skjermbildet scoret maksimal vekst på leu; og fravær av lacZ aktivitet indikerte en svak, men reproduserbar interaksjon.
Cyclic (c) AMP, proteinkinase A (PKA) og proteinkinase C (PKC) Analyser
PC-3CTR og PC-3CTRΔESS-celler ble dyrket i 24-brønners plater, vasket og stimulert med forskjellige konsentrasjoner av CT (0-100 nM) i 3 minutter. Cellene ble lysert med iskald 10% TCA-løsning, og lysatene ble analysert for cAMP-nivåer ved radioimmunanalyse.
For PKA og PKC-assays, lysatene av ubehandlede /CT-behandlede celler ble inkubert med respektive PKA eller PKC Substratpeptidet og
32P-ATP, som beskrevet i protokollen gitt av produsenten (Promega, Madison, WI). I korte trekk ble cellene behandlet med CT eller kjøretøyet i 10 minutter (2 x10
6 celler pr 100 mm skål) ble høstet i lyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,5, inneholdende 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM natriumpyrofosfat, 0,5 mM EGTA, 10 mM P-merkaptoetanol, 1 ug /ml leupeptin, og 1 ug /ml aprotinin), ultralydbehandlet og avfall ble fjernet ved sentrifugering. Ekstraktene ble deretter inkubert i 5 minutter ved 30 C i reaksjonsbuffer [sluttkonsentrasjonen var 50 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl
2; 100 mM ATP; 4 nM [
32P] ATP; 0,25 mg /ml BSA; og 50 M PKA eller PKC substrat peptider (Promega Corp., Madison, WI)]. 10 mm cAMP (totalt PKA aktivitet), fungerte som en positiv kontroll og en mikrometer PKI pluss cAMP fungert som en negativ kontroll for PKA analyser (total bakgrunn aktivitet). Tre paralleller av hver prøve ble analysert, og blottet på SAM2 biotin digitaliserings membraner ved slutten av inkubasjonstiden (Promega Corp., Milwaukee, WI). Membranene ble deretter vasket grundig med 2 M NaCl og 2 M NaCl 1% H
3PO
4, og det bundne fosforylerte substratet på en filterskive ble kvantifisert i en scintillasjonsteller. PKI-inhiberbare kinase aktivitet ble beregnet, og dataene ble rapportert som picomol ATP per min per g protein.
immunfluorescens
Cellene (ca 5×10
4 celler) ble dyrket enten på Transwell kamre (0.4μm pore størrelse) og dyrket til konfluens (ca. 5 dager). Cellene ble deretter fiksert og immunolabeled med det passende primære antistoff (mus Anti-CTR, acris Laboratories, kanin Anti-ZO-1-serum, Invitrogen, kanin anti-claudin 3 antiserum, Invitrogen) for over natten ved 4
0 C . De tilsvarende sekundære antistoffer konjugert med fluoroforer ble brukt. Etter vaskinger ble platene observert etter Nikon Optiphot-2 mikroskop utstyrt for epifluorescens. Bildene ble tatt med Retiga 1300 kamera koblet til en iMac datamaskin lastet med ivision bildeanalyseprogram (Biovision Technologies, Exton, PA). Alle antistoffer ble preget for spesifisitet og kryssreaksjon som beskrevet i S1 bilag, S2A-S2C Fig.
Måling av transepitelial Electric Resistance (TER) og paracellulære Permeabilitet (PCP)
Omtrent 5×10
4-celler ble sådd ut på filtere (Transwell 0.4μm porestørrelse) og dyrket til konfluens (vanligvis 5-6 dager). TER (i to brønner) ble målt ved flere tidsintervaller med EVOM volt-ohm-meter, som tidligere beskrevet [11]. Målingene ble korrigert for den tomme (TER verdier av filteret i bade medium). Integriteten og celletetthet på monolagene ble nøye overvåket.
For PCP-målinger,-celler ble dyrket til konfluens på Transwell filtre. Tetra metyl rhodamin-dekstran (1 mg /ml, ~ 4 kDa, Sigma) ble tilsatt til det øvre kammer. Fluorescens av det nedre kammer mediet ble målt i Modulus Microplate Reader (Turner Biosystems) etter en time.
In vitro
Invasion Assay
bølgen eksperimenter ble utført i 24-brønners to compartmented, Matrigel ™ invasjon kamre som tidligere beskrevet [17]
Vekst Rettelse:. Siden CT induserer også proliferasjon av PC-cellelinjer, bestemt vi faktor for å korrigere for mulige proliferasjon av celler som kan ha migrert i tidlig fase av 24 timers inkubasjonstid. 25 x 10
4-celler ble sådd ut hver time i seks-brønners skåler og dyrket i 1-24 timer. Gjennomsnittlig prosentvis økning i celle nummer i hver brønn ble bestemt. Denne korreksjonen ble brukt til resultatene av invasjons analyser.
CTR-C Pull-down analyse
cDNA som koder for den intracellulære domenet av CTRwt og CTRΔESS (aa 441-476) ble klonet inn pGEX vektor (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Kontroll (C) -cDNA konstruere (tilfeldig cDNA-sekvensen av tilsvarende lengde) ble fremstilt for en negativ kontroll. CDNA ble uttrykt i BL-21
Escherichia coli-stamme
, og ekvivalent mengde av hver enkelt fusjonsprotein (ca. 2 mg) ble absorbert på glutation-Sepharose 4B (GE Healthcare). Perlene inneholder GST-Fusion proteiner av C-peptid, CTR-CWT og CTR-CΔESS ble deretter inkubert med PC-31 cellelysat. De bundne proteiner ble eluert med redusert glutation. Tilstedeværelsen av ZO-1 i eluatet ble påvist ved Western blotting.
overlegg analyser
Overleggs analyser ble utført som tidligere beskrevet [18]. Cellelysater fra stabile PC-3M transfektanter som uttrykker enten ZO-1 vekt-MYC eller ZO-1ΔPDZ-myc mutantene ble utarbeidet, fraksjonert på en SDS-PAGE gel og overført til nitrocellulosemembraner. Blottet ble skåret i strimler som representerer hvert spor av gelen. Strimlene ble deretter blokkert i langt Western-buffer og inkubert med renset GST merket CTRwt fusjonsprotein over natten ved 4 ° C, og behandlet for GST immunblotting. For protein lasting kontroller ble blotter strippet og reprobed for MYC.
Co-immunoprecpitation
Serum-sultet PC-31-V, PC-31-CTRwt eller PC-31-CTRΔ ESS-celler (2 x 10
6 pr 100 mm skål) ble stimulert med /uten 50 nM CT i 3 minutter, vasket og lysert i IP-buffer som tidligere beskrevet [19]. CTR i normaliserte lysat proteiner ble immunopresipitert med anti-FLAG EZ-view perler (Sigma), og eluert med FLAG peptid (600 ng /ml i PBS). CTR immunopreciptates ble behandlet for ZO-1 immunoblotting. For å kontrollere for protein lasting og transport ble blotter strippet og reprobed med immunoutfelling antistoff.
Akseptant Photo-bleking Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Mikros
PC-31 celler ble sådd ut på glass bunn kamre og dyrket over natten. Cellene ble transfektert med CTRwt-ECFP-N1 (eller CTRΔESS-ECFP-N1) og ZO-1 vekt-EYFP-N1 (eller ZO1-ΔPDZ3-EYFP-N1) plasmider ved hjelp Lipofectamine ™, dyrket i ytterligere 36 timer, og avbildes leve etter behandling med 50 nM CT (eller kontroll) ved romtemperatur ved hjelp av Nikon Eclipse 2000 TE forbundet med Sensicam-QE (Cooke Corporation, Romulus, MI). CFP og YFP bildene ble kjøpt med eksitasjon ved 436 nm og emisjon ved 480/535 nm hhv. En 505 nm dichroic filter satt i Dual Vis ble brukt til å dele bilder (Optical Innsikt, Santa Fe, New Mexico). FRET ble registrert ved å overvåke slukking av CFP under YFP fotobleking. Bildene ble analysert med IPLab 4,0 bildebehandlingsprogrammer (Scanalytics, Inc, Rockville, MD) og gnage effektivitet ble beregnet ved hjelp av formelen: FRET
Effektivitet = (donor CFP
etter bleking-donor CFP
før bleking) /donor CFP
etter bleking. Terskler for donor (CFP), akseptor (YFP), og gnage bildene ble satt i begynnelsen av datainnsamling og ble holdt uendret for hele datasettet.
In situ
nærhet ligation assay (PLA)
Fast PC celler eller vev ble immunolabeled med primære antistoffer (anti-kanin ZO-1 i serum og anti-geit CTR serum) for natten ved 4 ° C. De sekundære antistoffer med vedlagte PLA sonder leveres i Duolink ™ kit (Olink Bioscience, Uppsala, Sverige). CTR-ZO-en interaksjon ble observert av konfokalmikroskopi på 400X. En rød fluorescerende prikk indikerer de to proteinene er innenfor 35nm avstand. Antallet prikker per celle ble bestemt av Blobfinder ™ programvare for bildeanalyse [20].
Frozen prostatakreft
Snap-frosne menneskelige prostata kreftprøver ble innhentet fra Louisiana Cancer Research Center, og var behandlet for ko-immunpresipitering som tidligere beskrevet [21]. De menneskelige prostata kreft tumorvev ble hentet fra Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC, New Orleans, Louisiana) med skriftlig pasienten samtykke og Institutional Review Board godkjenning av begge institusjoner, IRB ved University of Louisiana at Monroe og Tulane University Research Committee ( TURC) fra Tulane University Medical Center og Louisiana Cancer Research Center. For en lignende studie se Liu et al [22].
ortotopiske tumorvekst og metastase
For å oppdage mikrometastaser av implanterte kreftceller i mus, vi stabilt transfektert cellelinjer med DsRed-MCherry- Hyg-N1 (Clontech, Palo Alto, California). Hygromycin resistente kolonier som uttrykte sterk rød fluorescens på et jevnt nivå i løpet av observasjonsperioden ble valgt, og brukes for orthotopic implantasjon.
Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med prinsippene og prosedyrene skissert av NIH og Institutional Animal Stell og bruk komité ved University of Louisiana at Monroe. Dyret prosedyrer som brukes i denne studien ble godkjent av IACUC av University of Louisiana at Monroe. Den ortotopisk implantering operasjonen ble utført under Ketamin /Xylazin anestesi som tidligere beskrevet [6]. Tumorcellesuspensjoner (1×10
6 celler /20 ul) ble injisert i dorsal prostata ble dyrene overvåkes med hensyn til svulstvekst og metastase ved hjelp av fluorografi Kodak 4000 MM avbildningsstasjonen, og avlivet innen seksti dager [23]. Dyrene ble observert på en daglig basis og humant avlivet av CO
2 inhalasjon når de møtte følgende humane endepunktkriterier: utmattelse, hudlesjoner, betydelig vekttap, pustevansker, neseblødning, roterende bevegelse og kroppstemperaturfall. Flere organer ble oppsamlet, fiksert og undersøkt for tumormetastasering. Eutanasi ble utført av kvalifisert etterforskere Drs. Arvind Thakkar og Vijaybasker Lakshmikanthan. Dr. Judith Thomas var involvert i første del av studien, der han bidro til utviklingen av konstruksjoner, generering av cellelinjer og etablering av orthotopic implantasjon modell.
Ved obduksjon primærtumor og andre organer ble høstet og veid . Våte deler av organer ble undersøkt for tilstedeværelse av RFP. De gjenværende vev ble fiksert i nøytral bufret formalin og bearbeidet for H 0,05 (-CT vs + CT, en-veis ANOVA og Newman-Keuls test). E. I et forsøk som ligner på 2B, ble PCP bestemt ved spredning av ~ 4kDa TRITC-konjugert dekstran fra det øvre til det nedre kammer i to timer. Resultatene er uttrykt som pg /ml /time av TRITC-dekstran diffust verdier ± S.E.M. for n = 6. * p 0,05 (-CT vs + CT, One-way ANOVA og Newman-Keuls test). F. PC-3MV og PC-3MCTR
KD-celler ble testet for PCP som beskrevet i figur 2C. Igjen, knock-down av CTR produserte en signifikant reduksjon i PCP av PC-3M-celler, noe som viser viktigheten av endogent CTR i å regulere TJ stabilitet av PC-3M-celler. Resultatene er uttrykt som pg /ml /time av TRITC-dekstran diffust verdier ± S.E.M. for n = 6. * p 0,05 (-CT vs + CT, One-way ANOVA og Newman-Keuls test). G. Invasion: PC-3V, PC-3CTRwt og PC-3CTRΔESS celler ble lagt til øvre innsats av invasjons kamre sammen med /uten 50 nM CT, og celler som passerte gjennom Matrigel ™ barriere ™ ble talt etter 48 timer. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt antall invaderte celler pr 400X felt ± S.E.M. for n = 6. * p 0,05 (PC-3V vs. PC-3CTR-vekt); $ P 0,05 (PC-3CTR-wt vs PC-3CTRΔESS); $ $ -p 0,05 (PC-3CTRwt + CT vs. PC-3CTRΔESS + CT) (Enveis ANOVA og Newman-Keuls test). H. CTR immunoreaktivitets i PC-3V, PC-3-CTRwt og PC-3CTRΔESS celler. Cellene ble behandlet med /uten 50 nM CT. CTR i normaliserte lysat proteiner ble kvantifisert ved immunoblotting. Representant blot av tre separate forsøk.
B. PCP.
TJs danner en barriere som regulerer bevegelsen av ioner, oppløste stoffer og vekstfaktorer mellom celler. Å oppdage om CT påvirker «lekkasje bane «, dvs. barrieren til store uladede molekyler, målte vi diffusjon av fluoroforen-konjugert dekstran over polarisert PC cellelinje monolag. PC-3V celler vises relativt lav PCP og eksogene CT endret ikke det (Fig 2D). Uttrykk av CTRwt i PC-3 celler forårsaket en liten økning i PCP, og tillegg av CT økt PCP betydelig. I motsetning til dette, CTRΔESS uttrykk hadde liten effekt på PCP i nærvær eller fravær av CT. Når testet ved flere konsentrasjoner CT, CT induserte en økning i PCP av PC-3CTRwt celler i doser på 1 nM eller høyere etter 2 timer inkubasjon (figur 2E). Igjen, CT endret ikke PCP av PC-3CTRΔESS celler på alle testede konsentrasjoner (Fig 2E). For å undersøke betydningen av endogen CTR i TJ stabilitet, vi igjen brukte PC-3M celler [30]. Som forventet, CTR
KD betydelig redusert PCP av PC-3M celler (figur 2F). Når vurderes samlet, disse resultatene tyder på at CT-CTR akse kan være involvert i dynamisk regulering av TJs i prostata celler.
C. Invasion.
CT øker invasivitet, og selv induserer en invasiv fenotype i ikke-invasive PC celler [14]. Vi undersøkte rollen PDZ-bindende motiv i CT-stimulert invasjon. Uttrykk av CTRwt i PC-3 celler økt invasjon med 2,5 ganger (figur 2G). Men den ekspresjonen av CTRΔESS ikke føre til en tilsvarende økning. Når stimulert med 50 nM CT, PC-3-CTRwt celler svarte med en ekstra 2,5 ganger økning i invasjonen, men PC-3CTRΔESS ikke. Siden CTRwt og CTRΔESS hadde dramatisk forskjellige virkninger på TER, PCP og invasjon, ønsket vi å sikre at avvikene var ikke på grunn av forskjeller i deres CTR nivåer. Immunreaktive CTR nivåene var lik i alle cellelinjer i nærvær eller fravær av CT (figur 2 H), noe som antyder at interaksjonen av CTR med sin partner protein gjennom sin PDZ bindingsmotiv er avgjørende for dets destabiliserende virkninger på TJS og fremme invasjon
CTR destabiliserer også TJs og øker invasjon av andre PC cellelinjer
Vi testet også om CT gir lignende effekter i LNCaP, PC-3M og DU-145 cellelinjer som uttrykker endogen CTR (fig 1A ). CT redusert TER og øket PCP av disse cellelinjer, noe som tyder på CT destabiliserer TJS i androgen-responsive samt androgen-ildfast PC-cellelinjer (figur 3A og 3B). Tilsvarende, CT betydelig økt invasjon av mindre invasiv LNCaP så vel som mer invasive DU-145 og PC-3M celler (figur 3C).
LNCaP, PC-3M og DU-145-celler ble behandlet med 50 nM CT og deres TER (A), PCP (B) og invasjon (C) ble målt som beskrevet i Metoder. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 6). * P 0.05 fra tilsvarende kontroll (-CT vs + CT, Enveis ANOVA og Newman Keuls test). ^ P 0,01 (-CT vs + CT, Enveis ANOVA og Newman-Keuls test)
Identifikasjon av CTR-samspill protein
Siden virkningen av CTR på TJ. stabilitet og invasjon nødvendig PDZ-bindende motiv, vi søkt å identifisere CTR-samspill protein ved Y2H komplemente screening. Etter screening 1×10
6 transformanter, 11 samvirkende kloner ble identifisert, renset og sekvensert (tabell 1). Mest positive kloner kodet for plasmamembranproteiner og /eller proteiner forbundet med den adenylylcyklase system. Som et nytt funn, en klon kodet for stram junction protein ZO-1, og dette klon også den sterkeste signalet i sekundær screening. Siden CTR destabilisert TJs bare i nærvær av PDZ-bindende motiv, preget vi CTR-ZO-en interaksjon ytterligere
CTR-C-tail samhandler med ZO-en. A. Pull-down-analyse
CTR-C tail-ZO-en interaksjon ble undersøkt ved hjelp av GST rullegardin analyser.
