Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en stor grad uhelbredelig sykdom, og økende bevis støtter strategier rettet mot flere molekylære formidlere av kritiske funksjoner i bukspyttkjertelen duktale adenokarcinomceller. Intracellulær redox state modulerer aktiviteten av forskjellige signaloverføringsveier og biologiske prosesser, inkludert celleoverlevelse, medikamentresistens og respons til microenvironmental faktorer. Nylig har det blitt vist at transkripsjonsfaktoren STAT3 er under redox-kontroll, men mekanismene som er involvert i reguleringen er ukjent. Her har vi demonstrerer for første gang at STAT3 DNA-bindende og transkripsjonen aktivitet er direkte regulert av redoks-funksjon av den APE1 /Ref-en endonuklease, ved hjelp av overekspresjon og redoks-spesifikk mutasjons strategier, og genet knockdown. Også farmakologisk blokade av APE1 /Ref-1 av redoks-selektiv hemmer E3330 opphever STAT3 DNA bindende. Siden APE1 /Ref-1 utøver også redoks kontroll på andre kreftassosierte transkripsjonsfaktorer, vurdert vi virkningen av dual-målretting av STAT3 signalisering og APE1 /Ref-en redoks på bukspyttkjertelkreft cellefunksjoner. Vi observerte at avbrudd i APE1 /Ref-en redoks aktivitet synergizes med STAT3 blokade til potent hemmer spredning og levedyktighet av humane PDAC celler. Mekanistisk, viser vi at STAT3-APE1 /Ref-en dual targeting fremmer merkede tumorcelle-apoptose, med inngrep av caspase-3 signalering, som er betydelig økt i forhold til de effekter som utløses av enkelt mål blokade. Dessuten viser vi at STAT3-APE1 /Ref-en dual blokade resulterer i signifikant inhibering av tumorcellemigrering. Alt i alt er dette arbeid viser at den transkripsjonelle aktivitet av STAT3 er direkte regulert av redoks-funksjon av APE1 /Ref-1, og at samtidig blokade av STAT3 og APE1 /Ref-en redoks synergistisk effektivt å inhibere kritiske PDAC cellefunksjoner.
Citation: Cardoso AA, Jiang Y, Luo M, Reed AM, Shahda S, Han Y, et al. (2012) APE1 /Ref-1 Regulerer STAT3 transkripsjonen aktivitet og APE1 /Ref-1-STAT3 Dual-Targeting effektivt hemmer kreft i bukspyttkjertelen Cell Survival. PLoS ONE 7 (10): e47462. doi: 10,1371 /journal.pone.0047462
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 27 april 2012; Godkjent: 17 september 2012; Publisert: 19 oktober 2012
Copyright: © Cardoso et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte for dette arbeidet ble gitt av National Institutes of Health National Cancer Institute (NCI) CA121168, CA114571, og CA121168S1 (MRK), CA122298 (MLF), CA113669, CA134292 og CA134767 (AM) Riley Barnas Foundation (MRK) www.rileykids .org /og Ralph W. og Grace M. Showalter Research Trust Fund (MLF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og erklære at de ikke har noen interessekonflikt med unntak for Dr. Mark R. Kelley som er leder av Scientific Grunnlegger legger~~POS=HEADCOMP og konsulent for APEX Therapeutics, et selskap som har lisensiert IP fra sitt arbeid. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt en stor grad uhelbredelig sykdom, med pasienter som står overfor den verste 5-års overlevelse frekvensen av noen kreft. Utfordringen er å identifisere molekylære effektorer som kritisk regulerer overlevelsen av bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) celler, for å utarbeide effektive molekylære målrettede strategier som kan hindre eller begrense utvalget av resistente kreftvarianter, og overvinne den beskyttende rolle tumorassosiert fibrose og stroma. Økende bevis støtter behovet for strategier rettet mot flere molekylære effektorer i PDAC. Dermed er en strategi for å identifisere kritiske molekyler som regulerer flere signalformidlere (som transkripsjonsfaktorer) og intracellulære mekanismer med direkte effekter på flere veier kritiske for PDAC funksjoner.
APE1 /Ref-1 (heretter kalt APE1 ) er en dobbel funksjon protein, som i tillegg til DNA-reparasjonsaktivitet utøver også redox kontroll av transkripsjonsfaktorer, inkludert NF-kB, p53, AP-1, HIF-1 og andre [1], [2]. Behandling med E3330, et lite molekyl redoks-signale inhibitor som gjenkjenner en alternativ, redoks-aktiv konformasjon av APE1 [3] markert inhiberer DNA-bindende og transkripsjonelle aktivitet av NF-B, AP-1, og HIF-1 [4], [5 ]. Fungere som en redoks-faktor, stimulerer APE1 den DNA-bindende aktivitet av transkripsjonsfaktorer ved å redusere cysteinrester i det DNA-bindende domenet av «target» transkripsjonsfaktor. [6] Mens organismen besitter generell reduksjon-oksidasjon systemer (thioredoxin og glutaredoxin /glutation), [7], [8] APE1 fungerer annerledes som det selektivt regulerer forhold som direkte regulerer kritiske cellulære funksjoner, inkludert hypoksi, DNA-reparasjon, betennelse, og angiogenese. [4], [9], [10] Vårt tidligere arbeid etablert APE1 som en potensiell molekylære mål i PDAC, ved å vise at menneske adenokarsinom og peri-pankreas metastaser utstillings økt APE1 uttrykk [11], og at blokaden av APE1 Redox aktivitets forsinkelser . tumorprogresjon i xenograft modeller av menneskelig PDAC, inkludert pasient avledet kreftceller [4]
STAT3 er en transkripsjonsfaktor som regulerer viktige cellefunksjoner og spiller viktige roller i flere krefttyper [12] – [15]. STAT3 signalering har blitt implisert i kreft i bukspyttkjertelen biologi, nemlig ved mediering eller regulering av celleoverlevelse, tumor angiogenese og metastase [16] – [18]. Selv STAT3 signale kan være engasjert og modulert av ulike prosesser, virkningen av oksidativt stress og dens redox status er i stor grad ukjent. En fersk rapport viser at STAT3 aktiviteten er under kontroll redox og identifisert de kritiske oksydasjons-sensitive cysteiner i STAT3 DNA-bindende domene [19], [20]. Imidlertid har modifiserings av STAT3 som omformer den fra en oksydert til en redusert form ikke er blitt identifisert. APE1 fysisk vekselvirker med STAT3 på VEGF-promoteren [21] og forbedrer IL-6-indusert DNA-bindende aktivitet av STAT3 i HepG2 celler [22]. Det er imidlertid ukjent om APE1 er involvert i redoks kontroll av STAT3 aktivitet, og om den cellulære redoks status påvirker STAT3 signalisering i PDAC celler.
Her viser vi at APE1 Redox aktivitet regulerer STAT3 DNA-binding og transcriptional aktivitet, ved hjelp av genet Slå, overekspresjon av WT eller redoks-defekt APE1, og redoks-selektiv farmakologisk hemming. Blokade av APE1 redoks synergizes med Stat3 selektive antagonister til markert hemme spredning og overlevelse av menneske PDAC celler, fremme celle apoptose. Disse studiene identifisere mekanismen som APE1 regulerer STAT3 aktivitet, og etablerer begrunnelsen for utviklingen av APE1- Stat3 dual-målretting strategier for behandling av PDAC.
Resultater
Redox Kontroll av STAT3 aktiviteten i PDAC Cells
Selv om STAT3 DNA-binding er angivelig etter Redox kontroll [20], den molekylære mekanismen som medierer denne reguleringen er ukjent. Her undersøkte vi om APE1 regulerer DNA-bindende og transkripsjons aktiviteter STAT3 i PDAC. Vi bekreftet aktivering av STAT3 signalering ved hjelp av immunoblotting og EMSA (figur 1A, B). Begge pasient avledet og foreviget cellelinjer uttrykke APE1and utstillings STAT3 fosforylering (rest Y705) og DNA bindende; som ventet, STAT3 DNA-bindende forbedret etter stimulering med IL-6. For å bekrefte spesifisiteten av STAT3 DNA bindende, utførte vi EMSA konkurranse analyser ved hjelp av kaldt DNA-prober (WT eller mutant, Stat3-bindende-defekte sekvenser). Som vist på figur 1C, en doseavhengig reduksjon i STAT3 DNA-binding ble observert ved bruk av WT konkurrenten sonde som ikke ble observert ved bruk av den mutante probe. Spesifisitet denne interaksjonen ble også demonstrert av en supershift bandet observert ved hjelp av en STAT3-spesifikt antistoff (figur 1D)
A) Immunoblotting for STAT3 (pY705) i PDAC celler.; totale Stat3 nivåer vist i midtpanelet. APE1 proteinnivåer er vist for pasient-avledet linjer, og tubulin er laste kontroll. B) STAT3 EMSA analysen i Paca-2-celler stimulert med IL-6, NE = kjerneekstrakt; C) Konkurranse EMSA på STAT3 bruker atom ekstrakt fra Paca-2 celler og enten 25- eller 50-fold kald sonde (WT eller STAT3 binding-defekt mutant); D) Supershift av STAT3 DNA-binding ved hjelp av kjernekraft pakke; E) STAT3 EMSA assay etter behandling med DTT og diamid. F) STAT3 EMSA assay etter behandling med DTT eller økende konsentrasjoner av diamid, som angitt. G) STAT3 EMSA analysen med redusert APE1. DTT (overheng) reflekterer 0,04 mM DTT som anvendes i reaksjonen, efter å redusere APE1 protein. For alle analyser EMSA, kjerneekstrakt fra PACA-2-celler ble behandlet med IL-6 (50 ng /ml) i 2 timer i 2% FBS, med mindre annet er angitt.
Vi undersøkte effekten av oksyderende og reduserende betingelser på STAT3 binding til DNA, så vel som dens antatte regulering av APE1, ved hjelp av PDAC nukleære ekstrakter og behandling med diamid eller DTT. Oksyderende betingelser (diamid) oppheve bindingen av STAT3 til DNA (figur 1E, F); i motsetning til dette nukleære ekstrakter behandles med reduksjonsmidlet DTT viste forbedret STAT3 DNA-binding på en doseavhengig måte (figur 1E, 1,4 til 2 gangers økning). Siden redoks-status av STAT3 påvirker dens DNA-bindende aktivitet, så evaluert vi om redoks-funksjon av APE1 modulerer dens DNA-binding. Tilsetting av redusert APE1 protein til Paca-2 atom ekstrakter økt STAT3 DNA bindende 1,8 ganger (figur 1G). Som kontroller vi demonstrert at uredusert APE1 og bære-over DTT fra reduksjon av APE1 (0,04 mm) ikke stimulerer STAT3 DNA bindende. Disse studiene viser at STAT3 signalering er aktivert i PDAC, og at STAT3 binding til DNA er redox følsom og er regulert av APE1.
STAT3 transkripsjonen aktivitet er økt med APE1 Overuttrykte og hemmes av APE1 knockdown
på grunn av den multifunksjonelle natur APE1 med både DNA reparasjon og redoks aktiviteter, utførte vi eksperimenter for å ytterligere demonstrere at APE1 og dens Redox funksjonen er nødvendig for STAT3 DNA-bindende og aktivitet. Ved hjelp lentiviral transkripsjonen reporter vektor, pGreenFire-STAT3-Luc (PGF-STAT3-Luc) og pGreenFire-mCMV (negativ kontroll), fra System Biosciences Inc. (Mountainview, CA), vi genererte stabilt uttrykker reporter cellelinjer til analysen for STAT3 aktivitet , lignende konstruksjoner som ble brukt i tidligere studier med NF-kB, AP-1, og HIF-1 [4]. Panc-1-celler ble transdusert med PGF-STAT3-Luc, og enkle kolonier ble screenet for basal STAT3 og IL-6-stimulert STAT3 aktivitet. PDAC celler som uttrykker STAT3-drevet luciferase ble transfektert til forbigående overuttrykker wtAPE1 eller redoks-defekte mutant C65A-APE1 (C65A). Overekspresjon av wtAPE1 stimulerer aktiviteten av STAT3 i begge kloner (~3-fold), en effekt som ikke ble observert i celler som uttrykker de redoks-død APE1 mutant (figur 2A). I overekspresjon eksperimenter i figur 2A, ble enkle kolonier analysert for luciferaseaktiviteten etter transient transfeksjon med pcDNA, pcDNA-wt-APE1, og pcDNA-C65A-APE1, og normaliseringen ble utført ved bruk av Renilla som en transfeksjon kontroll.
A) Panc-1 celler transient transfektert med pcDNA3, pcDNA3-vekt-APE1, eller pcDNA3-C65A-APE1 ble analysert for STAT3 aktivitet via luciferase reporter analysen på 30 timer etter transfeksjon. ** P 0,01, n = 3 for hver klon sammenligne vekt til C65A. B) STAT3 Reporter analyse av PANC-1 celler transfektert med kryptert eller APE1 siRNA (50 nM) og stimulert med IL-6 (50 ng /ml, 6 timer). * P 0,05, ** p 0,01, n = 6 sammenligne SC til siAPE1. C) Western blot av total STAT3 protein nivåer følgende APE1 knockdown i Paca-2 celler. Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. D) p-STAT3 (Y705) nivåer følgende APE1 knockdown i Paca-2 celler. E) immunoblot av hele celleekstrakter viste at stimulering med IL-6 (50 ng /mL, 3 timer) øker p-STAT3 nivåer i både SC-og siAPE1- behandlede celler, men endrer ikke nivåene av total STAT3 protein. F) Western blot av fraksjonerte PACA-2-celler stimulert med IL-6 og transfektert med siRNA: atom (N) og cytoplasmiske (C) fraksjoner. Tubulin ble brukt som en lasting kontroll for cytoplasma og Lamin B1 for kjernekraft.
knockdown av APE1 påvirker ikke Totalt STAT3 protein nivåer, den STAT3 Fosforylering eller Nuclear Trans
Vi så vurdert virkningen av APE1 knockdown på STAT3 aktivitet i PDAC celler. Som ovenfor, enkeltkolonier av PGF-STAT3-Luc ble transient transfektert med APE1 siRNA for eksperimentene er vist i figur 2B. Resultater fra PGF-STAT3-Luc klonene # 3 og # 9 ble slått sammen i eksperimenter som er vist i figur 2B med representative eksperimenter for hver klon er vist i figur S1A, B. basalnivåer av STAT3 aktivitet blir vesentlig redusert når APE1 uttrykk er slått ned ved hjelp av forbigående , spesifikk siRNA (figur 2B; p 0,001). Nedgangen i STAT3 aktivitet ved APE1 knockdown var mer uttalt i celler stimulert med IL-6, ytterligere understøttelse av en regulerende rolle for APE1 i den DNA-bindende aktivitet av STAT3 (figur 2B, s 0,05, og fig S1A, B). Virkningene på STAT3 transkripsjonen aktivitet når APE1 nivåer er redusert ikke skyldes en økning i den totale STAT3 protein, som vist ved immunoblotting for total STAT3 protein (figur 2C og kvantifisering av blots i fig S1C) og ved qPCR for STAT3 mRNA (figur S1D) . Vi har også utført studier som viser at effekten av APE1 på STAT3 signale var begrenset til regulering av sitt DNA-bindende aktivitet, og ikke påvirke nivåer av STAT3 fosforylering (figur 2D og kvantifisering i figur S1E). Videre stimulering med IL-6 under betingelser med APE1 knockdown ikke påvirke total STAT3 proteinnivåer (figur 2E). Som forventet, stimulering med IL-6 øker nivået av p-STAT3, og denne regulering av STAT3 aktivitet er ikke avhengig av APE1 proteinnivåer.
Deretter undersøkte vi den nukleære translokasjonen av STAT3 ved sondering lysater fra kjernene og cytoplasma av PACA-2-celler transfektert med APE1 siRNA eller SC kontroll; total STAT3 og fosfor-STAT3 (Y705) ble analysert, med tubulin og Lamin B brukes som cytoplasmatiske og kjernefysiske kontroller, henholdsvis. Som forventet, stimulering med IL-6 resulterte i markert økning i nivåene av p-STAT3 (fig. 2E, F). Normalisering av p-STAT3 til Lamin B nivåer viste at det var ingen signifikante forskjeller i atom p-STAT3 i APE1-silenced versus SC kontroll (0,83 ganger endring). Dette funn ble bekreftet både i hele celleekstrakter (figur 2 D, E) og i nukleære ekstrakter (figur 2f). Disse observasjonene indikerer videre at APE1 regulerer STAT3 DNA bindende uten å påvirke andre mekanismer for regulering, dvs. fosforylering, kjernekraft translokasjon, eller mengden av total STAT3 protein henhold basal eller IL-6-indusert forhold.
APE1 Redox Sperre, E3330 hemmer STAT3 transkripsjonen aktivitet
for mer konkret adresse rollen redoks funksjon APE1 på STAT3 transkripsjonen aktivitet, vi utført eksperimenter med lite molekyl E3330, som selektivt hemmer APE1 Redox aktivitet uten at dette påvirker endonuklease funksjon. [3], [5] E3330 inhiberer markert STAT3 aktivitet både i stabile linjer (figur 3A, Fig S2A, B) samt i transiente luciferase-analyser (figur S2C). Basal STAT3 aktivitet ble betydelig inhibert av E3330 (figur 3A; p 0,05) på en doseavhengig måte. Også, E3330 behandling inhiberte STAT3 aktiviteten indusert av IL-6 stimulering av PDAC-celler i betydelig grad (figur 3A; p 0,05), som ble opphevet ved høyere doser E3330. Denne hemming av STAT3 aktiviteten var ikke på grunn av en nedgang i totale STAT3 protein nivåer eller en reduksjon i P-STAT3 nivåer. Resultater fra immunoblotting av helcellelysater vist at mengden av STAT3 protein og fosforylert STAT3 protein (0,95 ganger sammenlignet med DMSO kontroll) etter behandling med APE1 redoks-inhibitor, E3330 i PACA-2-celler ble ikke vesentlig endret (figur 3B).
A) STAT3 reporter analysen i Panc-1-celler etter behandling med E3330 (24 h) og stimulering med IL-6 (6 timer). Dosene var basert på overlevelse av data fra tidligere publiserte data [4]. * P 0,05 t test, n = 6 sammenligne DMSO kontroll til medikamentbehandlede prøver. B) Representant Western blot av Paca-2 celler behandlet med E3330 (50 mikrometer, 24 timer). C) Tilsetning av E3330 til EMSA reaksjonen inhiberer STAT3 DNA-bindende nukleære ekstrakter stimulert med IL-6. Representant EMSA Blot vist med kvantifisering av tre uavhengige eksperimenter i D. * p 0,05, ** p 0,01, sammenlignet med DMSO kontroll, ved hjelp av Student t-test. E) STAT3 DNA-bindende via EMSA assay etter behandling av PACA-2-celler med E3330 (2 timer) og deretter stimulert med IL-6 (50 ng /ml, 2 timer) med kvantifisering i (F), der intensiteten av binding ble sammenlignet mengden av STAT3 DNA-binding med IL-6 stimulering; G) qPCR analyse av Survivin uttrykket etter E3330 behandling i 24 timer i pasient avledet celler, Pa02C. Vist er data fra 2-3 individuelle eksperimenter (avg ± SE). Prøvene ble kjørt i tre eksemplarer og normalisert til DMSO kontroll over kjøretøyet.
For ytterligere å bekrefte hemming av STAT3 DNA-binding med APE1 redoks blokade, atom utdrag fra Paca-2-celler ble behandlet med E3330 og analysert av EMSA for STAT3 bindende; en doseavhengig reduksjon i STAT3 binding ble observert (figur 3C), med en IC
50 for E3330 rundt 30 um (figur 3D). Vi behandlet også PACA-2-celler med E3330 og deretter stimulert STAT3 DNA-binding med IL-6 og analysert med hensyn på STAT3 DNA-binding ved hjelp av EMSA analyse. Som vist på figur 3E og F, er IL-6-indusert STAT3 aktivitet hemmes drastisk følgende E3330 behandling i celler. Videre understøtter en reduksjon i STAT3 DNA-bindende følgende inhibering av APE1 redoks-aktivitet, ekspresjon av STAT3 målgen er Survivin redusert på en doseavhengig måte både i pasient-avledede celler (figur 3G) og i PACA-2-celler (figur S2D) . Disse studiene viser at manipulasjon av APE1 uttrykk og avbrudd i sin Redox funksjon markert påvirker STAT3 DNA-bindende og transkripsjonen aktivitet.
Farmakologisk blokkaden av APE1 og Stat3 Resultater i synergieffekter på menneske PDAC Cells
Først vi viser at behandling med to tidligere beskrevne STAT3 antagonister, STATTIC [23] og S3I-201 [24] hemmet fosforylering av STAT3 (figur 4 A, B) samt cellulær proliferasjon i PDAC celler (Figur 4C). Statistisk signifikant inhibering av fosforylering av Y705 er observert ved doser på S3I-201 større enn 100 um og med doser på STATTIC større enn 3,125 um, som målt ved densitometri (p 0,05). Ved de inhiberende doser som ble testet, har disse forbindelser ikke påvirke nivåene av fosforylering STAT1 (Y701) eller STAT5 (Y694) i disse celler (figur 4A, B). Funksjonelle studier med MTS analysen viste at STAT3 blokade markert hemmer spredning av både PDAC linjer (Figur 4C), med ED
50 av ~2.5 mikrometer for Paca-2 og ~4 mikrometer for Panc-1 for STATTIC, og ED
50 ~190 mikrometer for Paca-2 og ~310 mikrometer for Panc-1 for S3I-201. For begge medikamenter, ble det observert en sterk sammenheng mellom reduksjon i STAT3 fosforylering og hemming av proliferasjon av celler PDAC.
Immunoblotting av STAT proteiner, p-STAT3 (Y705), p-STAT1 (Y701), og p- STAT5 (Y694) i PDAC celler behandlet med S3I-201 (A) eller STATTIC (B). DMSO ble anvendt som bærerkontroll, og er inkludert i kjørefelt uten STAT3 inhibitor. Panc-1-cellene ble behandlet med S3I-201 i 30 timer og STATTIC i 30 min. PACA-2-celler ble behandlet med S3I-201 og STATTIC i 24 timer. C) Dose respons i Paca-2 og Panc-1 celler etter 72 timers behandling med S3I-201 eller STATTIC via MTS analysen. D, E) celleformering etter E3330 (50 uM for alle linjer, bortsett fra 40 uM for Panc10.05) og S3I-201 eller STATTIC behandling. Analyser ble utført i duplikat, representativt eksperiment, fra 2-4 uavhengige eksperimenter. F) Kombinasjon indeks (CI) verdier beregnet med Calcusyn for kombinasjon av APE1 og Stat3 hemmere ved deres ED
50-tallet i MTS analysen. CI verdier av 0,1, veldig sterk synergi; 0,1-0,3: sterk synergi; og 0,3-0,7:. synergi
I tillegg til å regulere transkripsjonen aktivitet av STAT3, APE1 utøver også redox kontroll av andre transkripsjonsfaktorer, som har vært implisert i kreft i bukspyttkjertelen (f.eks HIF-1α og NF-kB). [4], [16], [25] Deretter vurderes hvorvidt den kombinerte blokade av STAT3 og APE1 redoks-aktiviteten å virke synergistisk for å mer effektivt å inhibere humane PDAC celler. Celleoverlevelse ble vurdert ved hjelp av xCELLigence system, som overvåker sanntid forandringer i celle etterlevelse, morfologi og levedyktighet; [4], [26] celleindeks (CI) ble overvåket i løpet av 72 timer medikamentbehandling. E3330 ble anvendt i doser som effektivt hemmer APE1 redoks-aktivitet, og STAT3 inhibitorer ved doser som ble benyttet i MTS-baserte assay for cytotoksisitet (figur 4C) og det hemmet STAT3 fosforylering i PDAC-celler (figur 4A, B og Ref. [24 ]). Som enkle midler, ble minimale hemming av PDAC celler observert med E3330 eller i doser på STATTIC eller S3I-201 brukes (fig 4 D, E). Vi har observert at APE1 redoks inhibering av E3330 synergizes med STAT3 blokade av STATTIC eller S3I-201, noe som resulterer i sterk inhibering av Panc-1 og PACA-2-celler, men også av den primære Pa03C og Panc10.05 celler (figur 4D, E) . Poten av de hemmende effektene sett med denne doble målretting, på sub-optimale doser av disse midlene, ble observert både ved hjelp xCELLigence (figur 4) og MTS-analyser (Figur S3). Interessant, i pasient-avledede celler Pa03C og Panc10.05 ble denne forbedring observert ved lavere doser av E3330 enn de som ble observert med de etablerte cellelinjer (data ikke vist). Blokade av signale gjennom både APE1 Redox aktivitet og STAT3 har dramatiske effekter på celleoverlevelse. For å demonstrere at denne effekten ikke skyldes en generell redoks-fenomen, vi også kombineres STAT3 inhibitorer med tioredoksin-inhibitor, PX-12 [27] – [29]. Tilsetting av STAT3 inhibitor S3I-201 til PX-12 behandling var ikke signifikant forsterke effekten av PX-12 (tabell S1, vurdert ved sammenligning av ED
25, ED
50, og ED
75).
for å kvantifisere potensielle legemiddel synergisms ble Chou-Talalay metode som brukes med økende kombinasjoner dose av en STAT3 antagonist pluss APE1 inhibitor E3330. ED
50 for de tre forbindelsene ble bestemt som vist ovenfor, ved bruk av MTS-analyser (figur 4 og Ref. [4]). PANC-1 eller PACA-2-celler ble behandlet med to-legemiddelkombinasjoner ved fast forhold av doser tilsvarende 0,125, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,125 og 1,25-ganger av deres individuelle ED
50 verdier. Som vist på figur 4F, ble potente synergisms observert med kombinasjonen indeksverdiene signifikant mindre enn 1 for ED
50 og ED
75 i begge cellelinjer. Samlet er disse studiene viser at samtidig målretting av APE1 redox og STAT3 signale synergize til markert svekke overlevelsen av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler, selv ved sub-optimale doser av de enkelte agenter.
Dual målretting av APE1 Redox aktivitet og STAT3 Triggers øke apoptotiske effekter i PDAC Cells
Deretter utførte vi mekanistiske studier for å undersøke om disse synergieffekter innebærer økt apoptotisk celledød og engasjement av caspase veien. Først brukte vi Annexin-PE /7-AAD analyse for å vurdere celledød og levedyktighet i PDAC celler behandlet med medikamentkombinasjoner som er angitt (figur 5A, C). Panelene A og B viser representative plott av flowcytometri analyser, og viser at kombinasjonen av E3330 med en STAT3 inhibitor markant øke hyppigheten av annexin-positive, ikke-levedyktige celler; sammenlignbare resultater ble sett for pasient-avledede celler (figur 5B, D). Analyser av data fra fire til seks individuelle forsøk viser at kombinasjonen E3330 med STATTIC eller med S3I-201 øker bukspyttkjertelkreft celledød (figur 5B) i betydelig grad. Videre er lignende resultater observert i pasient-avledede celler i hvilke et ~6-8-gangers økning i celle-død er observert med den kombinerte målretting av APE1 og STAT3 (figur 5B, D).
inhibitorer ble tilsettes samtidig (E3330 40, 50, eller 75 uM), og apoptose ble bestemt ved anvendelse av Annexin V-(x-aksen) og 7-AAD eller PI (y-aksen) farging etter 24 timer. Representative dot tomter er vist i A og B med høy dose STAT3 inhibitor for Panc-1 og Paca-2 og 50μMS3I-201 for de pasient avledet celler. Grafisk fremstilling representerer 3 uavhengige eksperimenter; *, P 0,05, **, p 0,01 alt i forhold til STAT3 inhibitor alene på tilsvarende dose (A, C) eller 2 uavhengige eksperimenter for (B, D)
For å vurdere potensialet. involvering av caspase-avhengig celledød, utførte vi eksperimenter som måler aktiveringen av caspase 3 i PDAC celler behandlet med samme medikamentkombinasjoner, ved hjelp av et FITC-konjugert kaspase-3 inhibitor (FITC-DEVD-FMK) og flow-cytometri. Som vist i figur 6, selv om enkle midler induserte ikke merket kaspase 3 aktiveringen, de kombinatoriske virkningene av APE1 redox-inhibering og STAT3 blokkade resulterte i betydelig aktivering av kaspase 3, i begge PDAC cellelinjer (figur 6A, B, representative strømnings histogrammer venstre panel). Disse effektene var statistisk signifikant (figur 6B, høyre panel) når E3330 ble kombinert med STATTIC (A, p 0,05) eller med S3I-201 (B, p 0,05). Samlet viser disse resultater at ved å kombinere sub-optimale doser av de enkelte selektive midler, samtidig målretting av APE1 redox og STAT3 signale medfører betydelig celledød av PDAC celler, med inngrep av kaspase-3 pro-apoptotiske virkninger.
Panc-1 og PACA-2-celler ble behandlet med E3330 (50, 75 uM) og økende mengder av STATTIC (A) eller S3I-201 (B) og analysert for caspase 3-aktivitet. Grafene representerer 3 uavhengige eksperimenter; *, P. 0,05, alt i forhold til STAT3 inhibitor alene på tilsvarende dose
Dual målretting av APE1 Redox og STAT3 signale Betydelig hemmer migrasjon av PDAC Cells
Til slutt, siden celle migrasjon er et viktig skritt i progresjon og spredning av kreft i bukspyttkjertelen, vi evaluert effekten av APE1 og STAT3 blokade på responsen av PDAC celler til kjemotaktiske stimuli, ved hjelp av xCELLigence system. Serum-fratatt Panc-1 celler ble plassert i øvre kammer av en CIM plate, og stimulert med media supplert med serum, som gir kjemotaktiske stimuli (nedre kammer). Som forventet, gjør serum-sultet Panc-1 celler ikke vandrer i fravær av kjemotaktiske stimuli, og fibronektin belegg bidrar til å feste migrerende celler (Figur S4A). Behandling av Panc-1 celler med E3330, STATTIC eller S3I-201 som enkle midler resultert i begrenset inhibering av Panc-1 celle migrasjon, selv ved relativt høye doser av disse forbindelser (figur 7). Men kombinasjonen av E3330 med S3I-201 (50 uM og 100 uM, fig. S4D) eller med STATTIC resulterte i markert nedsatt cellemigrasjon (figur 7D, E), med både S3I-201 /E3330 og STATTIC /E3330 kombinasjoner resulterer i signifikante hemmende effekter i Panc-en celle migrasjon (figur 7F, Figur S4D, p 0,01, figur 6G, p 0,05 i forhold til E3330 alene og p 0,01 i forhold til STATTIC alene). Viktigere, disse stoffene eller kombinasjoner viste ingen signifikant effekt på levedyktigheten til Panc-1 celler på tidspunkter og doser vurderes i migrasjonsanalyser (figur S4 B, C). Disse resultatene tyder på at samtidig blokade av APE1 redox og STAT3 signale samarbeider også å hemme migrasjon egenskaper PDAC celler.
Migrasjon analysert via xCELLigence system, behandling med økende mengder S3I-201 (A), STATTIC (B ), eller E3330 (C). Kombinasjon av E3330 (75 uM) med STAT3 inhibitor S3I-201 (D), 50 uM eller STATTIC (E), 10 uM dramatisk reduserer cellens vandrende evne. Kvantifisering av tre individuelle forsøk på åtte timer er vist i F og G. * p 0,05, ** p 0,01 hjelp paret t-test sammenligne inhibitor alene versus kombinasjonsbehandling
Diskusjon
i denne rapporten viser vi for første gang at STAT3 DNA bindende, er det under redoks kontroll, som er mediert av redoks aktivitet APE1. Tidligere studier har vist at oksydasjonen av kritiske cysteiner rester i STAT3 protein gjennom peroksyd behandling kan redusere STAT3 (men ikke STAT1) DNA-bindende og transkripsjonen aktivitet [20]. Ved hjelp av kjernefysiske utdrag fra PDAC celler, vi preget systematisk effekten av å redusere og oksiderende forhold på STAT3 DNA bindende. Åpenbart STAT3 binder seg til DNA mer effektivt når det er redusert, og redox-aktiviteten av APE1 er i stand til å stimulere STAT3 DNA-binding. Videre manipulering av APE1 nivåer påvirker den DNA-bindende aktivitet av STAT3. Den samtidige blokade av STAT3 og APE1 Redox aktivitet virker synergisk for å forstyrre PDAC celleviabilitet samt deres migrasjon egenskaper.
Dette er den første demonstrasjonen også at APE1 regulerer STAT3 DNA bindende og transkripsjonen aktivitet i PDAC celler. Dette funnet peker på interaksjonen av APE1 og STAT3 som en del av overlevelse signalering i PDAC i stedet for en ikke-spesifikk effekt av generell redox-regulatorer. Overekspresjon av et redoks-manglende protein APE1 mislyktes i å fremme STAT3 transaktivering i PDAC celler, og blokade av redoks-funksjon av APE1 via E3330 hemmes drastisk den transkripsjonelle aktivitet av STAT3, både basalnivåer såvel som IL-6-indusert aktivitet. Men knockdown av APE1 synker STAT3 aktivitet uten at dette påvirker fosforylering eller kjernefysisk translokasjon. Til sammen utgjør disse data støtter hypotesen om at APE1 styrer den DNA-bindende aktivitet av STAT3 direkte. Med de høye nivåene av ekspresjon i APE1 PDAC tumorer (figur 1A, Ref. [11]), stimulering av STAT3 signalisering gjennom APE1 Bare redoks-aktivitet kan bidra til terskelen av STAT3 aktivitet i tumoren som fører til en mer aggressiv fenotype. Økning i STAT3 signal kondisjon gjennom onkogene hendelser og /eller tumorassosierte ytre signaler slik som IL-6 kan være delvis drives gjennom APE1.
I STAT-familien av transkripsjonsfaktorer, er STAT3 den første STAT medlem å være vist seg å være regulert av APE1. Arbeid ved Li et al elegant demonstrert ved hjelp av chimera STAT1 /Stat3 proteiner som STAT3, men ikke STAT1, er under redoks kontroll. [20] ROS kan aktivere STAT-signalisering og anti-oksidanter kan hemme denne aktiveringen.
