Abstract
Bakgrunn
Viral-mediert oncolysis er en roman kreft terapeutisk tilnærming med potensial til å bli mer effektive og mindre giftige enn dagens behandling på grunn av agenter selektiv vekst og forsterkning i tumor celler. Hittil har disse midlene vært svært trygg hos pasienter, men har generelt falt kort av forventet terapeutisk verdi som monoterapier. Derfor er nye tilnærminger til å generere svært potente onkolytiske virus nødvendig. For å møte dette behovet, har vi utviklet en ny metode som vi kaller «Directed Evolution» for å lage svært potente onkolytiske virus.
metodikk /hovedfunnene
Tar «Directed Evolution» tilnærming, viral mangfold ble økt ved å samle en rekke serotyper, så aging bassengene under forhold som inviterer rekombinasjon mellom serotyper. Disse svært ulike virus bassengene ble deretter plassert under strenge rettet utvalg for å generere og identifisere svært potente midler. ColoAd1, et kompleks AD3 /Ad11p kimære virus, var den initiale onkolytisk virus utledet av denne nye metoden. ColoAd1, den første beskrevne ikke-Ad5-baserte onkolytiske Ad, er 2-3 logger mer potent og selektiv enn foreldre serotyper eller mest klinisk avanserte onkolytiske Ad, ONYX-015,
in vitro
. ColoAd1 sin effekt ble testet videre
in vivo
i en tykktarmskreft levermetastaser xenograft modell etter intravenøs injeksjon og dens
ex vivo
selektivitet ble demonstrert på kirurgisk-avledet humane kolorektale svulstvevet. Til slutt, viste vi muligheten til å bevæpne ColoAd1 med et eksogent gen etablere potensial til å påvirke behandlingen av kreft på flere nivåer fra en enkelt agent.
Konklusjon /Betydning
Bruke «Directed Evolution «metodikk, har vi generert ColoAd1, en roman kimære onkolytiske virus.
In vitro, etter dette viruset påvises a 2 log økning i både styrke og selektivitet i forhold til ONYX-015 på tykktarmskreftceller. Disse resultatene ble videre støttet av
in vivo Hotell og
ex vivo
studier. Videre har disse resultatene validert denne metodikken som en ny generell tilnærming for å utlede klinisk relevante, svært potente anti-kreft virotherapies
Citation. Kuhn jeg, Harden P, Bauzon M, Chartier C, Nye J, Thorne S, et al. (2008) Directed Evolution Genererer en Novel Onkolytiske Virus for behandling av tykktarmskreft. PLoS ONE 3 (6): e2409. doi: 10,1371 /journal.pone.0002409
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina
mottatt: 15 februar 2008; Godkjent: 30 april 2008; Publisert: 18 juni 2008
Copyright: © 2008 Kuhn et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet i sin helhet av Bayer Healthcare Farmasi
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utviklingen av effektive behandlinger for menneskelig solid svulster fortsatt en betydelig utfordring for kreftforskere og onkolog likt. Dette er på grunn av kompleksiteten av menneskelige solide svulster, med flere, noen ganger overflødige, samspill signalveier [1], pasientpopulasjon forskjeller [2], og evnen til å tilegne seg motstand mot behandlinger, inkludert den nyutviklede målrettede molekylære behandlinger som erlotinib, gefitinib, og imatinib [3]. Følgelig nye agenter, med unike virkningsmekanismer i stand til å konfrontere denne kompleksiteten, er nødvendig.
Onkolytiske virus er unike anti-kreft agenter som kan forsterke inngangs dose gjennom replikasjon i en svulst avhengig måte. Menneskelig adenovirus (Ad) er en av en rekke virus utvikles som onkolytiske agenter for å behandle menneskelige kreftformer [4]. Tidlige kliniske studier og pre-kliniske studier har vist synergi av denne type roman kreftbehandling med standardbehandling kjemoterapi [5] og stråling [6], [7], [8]. Men mens de onkolytiske annonser testet i kliniske studier har vist markert sikkerhet, har de vist begrenset klinisk effekt som monoterapier [9], [10], [11], [12]. Følgelig er flere tilnærminger blir undersøkt for å øke deres styrke (definert som virus evnen til å replikere Lyse-celler, og spredning), inkludert øke effektiviteten av cellelysering [13], [14], [15], [16], [17], [18], smittsomhet [19], og «tilkobling» dem med terapeutiske transgener [20].
Det er 51 definerte menneskelig Ad serotyper, gruppert A-F og disse serotyper avvike på en rekke nivåer (f.eks patologi hos mennesker og gnagere, hemagglutinatin egenskaper, cellulære reseptorer). Imidlertid, med unntak av fiber endringer [19], human alternative Ad-serotyper til godt studert Ad5 serotype har blitt ignorert. Dermed alternative serotyper kan representere et uutforsket avenue for å utvikle mer potente virotherapies.
For å fullt utforske sitt potensial, vi ansatt en metode vi kaller «Directed Evolution», der bassenger av Ad serotyper, som representerer de forskjellige annonse undergrupper, passeres på humane tumorcellelinjer som er representative for de store faste tumor indikasjoner (bryst, tykktarm, bukspyttkjertel, prostata) for å invitere rekombinasjon og seleksjon for potente virale varianter eller serotyper. Denne enkle, ikke-fordoms tilnærming benytter kompleksiteten i den menneskelige svulst celle for å lede utviklingen av utvalgte, høyt potente Annonser fra bassenget, og er svært attraktivt siden det kan være rettet mot et utfall (f.eks utvikle en mer lytisk virus) med forbehold mot mekanismen (e) som kan være ansvarlig for at utfallet (f.eks effektiviteten av cellelyse, smittsomhet, viral DNA replikasjon). ColoAd1, et virus isolert fra tykktarm cellelinje-passaged viral basseng, som vises potens overlegen Ad5 på en serie av kolon tumorcellelinjer, og et bredere terapeutisk vindu på en samling av kolon tumorlinjer og primære normale celler enn den nylig godkjent og markeds virotherapy, ONYX-015 /H101 [21]. Den overlegne styrken ble ytterligere demonstrert
in vivo
i en levertumor seeding modell og selektiviteten ble godkjent for klinisk skåret tykktarmskreft vev. I tillegg viser vi at vi kan «arm» denne romanen agenten ved å inkludere transgener i det virale genomet uten at det går potens av middelet, og dermed øke potensialet i denne agent for å håndtere kompleksiteten i menneskelige solide svulster. Dette er den første beskrivelsen av en ikke-Ad5 basert onkolytiske annonse, og utnyttelse av alternative annonse serotyper markerer en ny tilnærming til utvikling av mer potente og selektive onkolytiske virus for behandling av kreft hos mennesker.
Resultater
Directed Utviklingen av sammenslåtte adenovirus serotyper på forskjellige tumorcellelinjer stammer distinkt forskjellige virus bassenger som er overlegen i styrke til Ad5
Directed Evolution strategien skissert i Materialer og metoder (figur 1
A
) er en objektiv tilnærming til å avgjøre om alternative serotyper, eller rekombinanter av disse, er overlegen i styrke til Ad5 (serotype av alle aktuelle onkolytiske annonser) på humane kreftcellelinjer. Som et lav-oppløsning metode for å spore endringer i løpet av passeringen av den virale bassenget og for å karakterisere den homogene /heterogene natur av den endelige virale bassenget, ble bassengene undersøkt på en TMAE anionbytterkolonne utnytte virale kapsidbindende ladningsforskjeller forbundet med hver serotype (figur 1
B
). Hver virus basseng innsamlet fra forskjellige cellelinjer etter passasje 20 eluerte som en enkelt topp med retensjonstid distinkt (figur 1
C
). Hver eluering toppen av en passaged viral basseng syntes å spore med en av de opprinnelige serotyper (Figur 1
B
). Dette tyder på at alle virusene er ikke lik i deres potens på en gitt tumor cellelinje, og at forskjeller i tumorcellelinjer kan velge for bestemte virus i et blandet virus basseng. Siden minst to av disse utvalgte virus bassengene ikke spore med Ad5 oppholdstid, er Ad5 ikke (basert på potens) den beste virus for å utlede alle onkolytiske annonser.
A, etter Representasjon av Directed Evolution prosessen (se Materialer og Metoder for detaljert beskrivelse).
B; Eksporter kromatogrammer av hver ren Ad serotype inkludert i mixed serotype starter bassenget som ColoAd1 ble valgt.
C,
Kromatogrammer av passasjen 20 virale bassenger avledet på HT-29, Panc-1, MDA-231, og PC-3 tumorcellelinjer, henholdsvis. De ulike oppholdstider på disse bassengene er i samsvar med den dominerende serotype av bassenget blir Ad5 eller Ad40 for Panc-en pool, Ad11p for HT-29 basseng, AD3 eller ad4 for PC-tre basseng, og Ad5 eller Ad40 for MDA-231 basseng.
en MTS-analysen ble ansatt for å sammenligne styrken på de forskjellige valgte virus bassenger til den opprinnelige blandet serotype basseng og Ad5. Alle valgte virus bassenger økt i styrke i forhold til Ad5 eller start bassenget, med omfanget av økningen varierer betydelig mellom bassengene. Den største økningen i potens i forhold til Ad5 ble observert i bassenget passert på den colon tumorcellelinje HT-29 (ca. 2 log økning) med den minste økning (1,2 ganger) bemerket i bassenget avledet fra passasje på MDA-231mt1 celle linje (tabell 1).
ColoAd1 er en svært potent og selektiv onkolytiske virus
Siden viral bassenget passeres på HT-29 celler vises den største økningen i styrke på sin beslektet celle linje, ble virus i dette bassenget forfulgt for videre karakterisering. Individuelle plakk-renset virus ble isolert og screenet ved MTS assay for deres lytisk potensialet på HT-29 tumorcellelinje. Styrken av individuelle plakker ble sammenlignet med den i HT-29 pool fra hvilken de ble isolert. De plaque-rensede virus ble funnet å være lik eller større i potens enn HT-29 basseng. Den mest potente av disse plakk-renset virus, kalt ColoAd1, ble valgt for ytterligere karakterisering.
Mens ColoAd1 ble valgt for vekst på kolon tumorcellelinjen HT-29, det var ikke klart om dette viruset hadde økt styrken på alle tumorcellelinjer, var selektiv for koloncancer tumorcellelinjer, eller var mer potente på alle celletyper, inkludert primære normale celler. For å møte de to første spørsmål, ble ColoAd1 testet ved MTS-assay på alle de opprinnelige tumorcellelinjene anvendt i denne studien (Panc1-SCT, MDA-231mt1, HT-29 og PC-3), to ytterligere tumorcellelinjer (OVCAR-3, DU-145), og på et panel av tykktarmskreftcellelinjer (DLD-en, LS1034, HCT116, LS174T, SW48, SW403, Colo320DM), som sammenligner det å Ad5. ColoAd1 var over 2 stokker mer potente enn Ad5 på beslektet cellelinjen HT-29. I tillegg ColoAd1 vist potens er lik eller større enn Ad5 på noen humane tumorcellelinjer (for eksempel PC-3, MDA-231, OVCAR-3 og DU-145) ble, men dempes (ca to stokker mindre potente enn Ad5) på den Panc1 cellelinje (tabell 2). ColoAd1 vises betydelig økt potens (9 til 100 ganger) i forhold til Ad5 på alle tykktarmskrefttumorcellelinjer screenet med unntak av Colo320DM (tabell 3). Dette tyder på at kolon kreftcellelinjer har egenskaper som gjør dem betydelig utsatt for smitte og lysering av ColoAd1.
For å teste om ColoAd1 var selektiv for tumorceller enn normale celler, og dermed per definisjon , et onkolytisk virus, ColoAd1 ble undersøkt i to forskjellige colon tumorcellelinjer (HT-29, DLD-1), og den primære endotelceller og epitelceller (HUVEC, HMEC) som sammenligner dens potens i hver MTS analyse for å Ad5 og Onyx-015 /H101. Resultatene viser at Onyx-015 og Ad5 er betydelig mindre potent enn ColoAd1 på HT-29 og DLD-1-cellelinjer (tabell 4). I motsetning til dette, styrken av ColoAd1 på HUVEC-celler var den samme som Ad5 og litt mer potent enn Onyx-015 (tabell 4). På HMEC celler, ColoAd1 var mindre potent enn Ad5 og Onyx-015 (tabell 4). For å kvantifisere disse forskjellene mellom ColoAd1, Onyx-015, og Ad5, en
in vitro
terapeutisk vindu ble beregnet, definert som forholdet mellom IC
50 fra et gitt virus på normale celler, HUVEC eller HMEC , dividert med IC
50 på den colon tumorcellelinjene HT-29 eller DLD-1 (tabell 2). Disse beregningene fastslå at ColoAd1 har en terapeutisk vindu som er tre til fire stokker større enn for Ad5 eller ONYX-015 /H101 i disse
in vitro
analyser.
ColoAd1 er en kimære virus som viser forbedret styrke over moder virus, Ad11p
Kromatografisk analyse indikerte at de store kappeproteiner av ColoAd1 ble avledet fra Ad11p, en gruppe B-viruset. For å bestemme forholdet mellom ColoAd1 og Ad11p, ble viruset sekvensert, avsløre at ColoAd1 er Ad11p, med en nesten fullstendig E3 region delesjon, en mindre delesjon i E4 området, og et kimært AD3 /Ad11p E2B region (fig 2).
de genomiske forskjeller mellom ColoAd1 og Ad11p noteres i skjemaet. I E2B regionen er det hyppige erstatninger av AD3 sekvenser for Ad11p sekvenser mellom basepar 6081 og 9322. I tillegg har ColoAd1 en nesten komplett (2444 bp) E3 region sletting, og en mindre (25 bp), andre sletting som er tilordnet en antatt E4orf4 region av viruset.
det er mulig at Ad11p eller AD3 er serotyper som er iboende mer potent, og har en bredere terapeutisk vindu, enn Ad5, og at denne egenskapen er uavhengig av ervervet genetiske endringer som finnes i ColoAd1 genomet. For å teste dette, vi undersøkte ColoAd1, Ad11p og AD3 på to kolon kreftcellelinjer, HT-29 og DLD-en, og på primære humane endotelceller og primære humane epitelceller, HUVEC og HMEC, henholdsvis ved MTS analysen. Som vist i tabell 4, ColoAd1 oppviste overlegen styrke over både Ad11p og AD3 på colon tumorcellelinjer, noe som viser at dette rekombinante virus var overlegne i styrke til begge av de overordnede virus. Interessant, Ad11p, og ikke AD3, vises en iboende terapeutisk vindu som definert her via MTS analyse. Således er ColoAd1 et derivat av Ad11p hvis forskjeller med Ad11p forbedre styrken av viruset uten å endre serotype naturlige evne til selektivt å replikere i tumorceller versus primære normale celler.
Det er viktig å merke seg at den rapporterte seroprevalence av Ad11p er lav [22], [23] det største behovet for denne type terapeutisk er i pasientpopulasjoner hvor svulsten har kommet til en systemisk, metastatisk kreft. Således behandling av pasienter med et middel som mangler pre-eksisterende immunitet skal forbedre muligheten for at midlet for å sirkulere og fjerne metastatiske tumorceller. For å bekrefte de tidligere rapporter om lav seroprevalens av Ad11p, serum fra seks forskjellige individer ble oppsamlet og testet med hensyn på evne til å nøytralisere infektiviteten og lytiske potensialet av disse virus på en rapportørcellelinje, OVCAR-3. Etter avtale med litteraturen, serum viste liten effekt på ColoAd1 (data ikke vist), noe som tyder på at ColoAd1 kan være en levedyktig tilnærming for systemisk behandling av tykktarmskreft.
ColoAd1 har anti-tumor aktivitet overlegen ONYX -015 og Ad11p i en tykktarmskreft levertumor seeding xenograft mus modell følgende iv administrasjon
De fleste solide svulster er metastatisk ved diagnosetidspunktet. Siden den første området av metastaser for tykktarmskreft er leveren, et tykktarmskreft levertumor seeding modell [24] ble brukt til å undersøke
in vivo
effekt av ColoAd1. For å bestemme først om viral anti-tumoral-aktivitet er avhengig av virusets evne til å replikere og spres i denne modellen, ble et doseresponsstudie som sammenligner ColoAd1 til sjonsdefektiv form av ColoAd1 (der viktige E1 region av viruset ble slettet). Som vist i figur 3
A
, systemisk levert ColoAd1 reduseres betraktelig tumorbelastning i en dose, og replikasjon, avhengig måte. Siden HT-29 celler som kreftfremkallende skur embryonale antigen (CEA), kan dette brukes som et lett måles surrogat for tumorbyrde. Viktigere, målinger av CEA i blodet (figur 3
B
) korrelert godt med resultatene av tumorvektmålinger (Figur 3
A
).
HT-29 tykktarmskreft celler ble sådd på leveren av nakne beige mus (n = 10 mus per behandlingsgruppe). Plasma-CEA-nivået ble brukt til å overvåke tumor etablering.
A Hotell og
B
, Mus ble behandlet av hale vene (iv) injeksjon med 1 × 10
10, 5 x 10
10, eller 1 × 10
11 totalt viruspartikler ColoAd1 per mus. Et fjerde sett av lever-tumor-bærende mus var i.v. injisert med 1 × 10
11 totalt viruspartikler av sjonsdefektiv [E1
(-)] versjon av ColoAd1, ColoAd1CJ132. En femte sett av mus ble injisert med bærerkontroll (buffer). Tumor vektmålinger viser at ColoAd1 har anti-tumoraktivitet, som er doseavhengig (
A
). Blood CEA nivåer ved slutten av studien (dag 12 etter viral administrasjon) underbygge tumorvektdata (
B
).
C og D, etter Sammenligning av anti-tumoraktivitet av ColoAd1, Ad11p og ONYX-015 i HT-29 levermetastaser xenograft mus modell. I en annen studie utført i den samme modellen som i Panelene A og B, ble ColoAd1 i forhold til sin foreldrevirus, Ad11p, og til klinisk godkjente onkolytisk virus Onyx-015; hvert virus dosert intravenøst til totalt 1 × 10
11 viruspartikler per mus.
For å teste om den overlegne
in vitro
styrken av ColoAd1 forhold til Ad11p og ONYX-015 /H101 ble rekapitulert
in vivo
, disse virusene ble sammenlignet i leveren tumor seeding modell. Som vist i figur 3
C plakater (tumorvekt) og figur 3
D plakater (CEA nivåmålinger), anti-tumoral aktivitet av ColoAd1 var overlegne i forhold til både Ad11p og Onyx-015 i denne modell, bekreftende
in vitro
konklusjoner.
selektivitet ColoAd1 på menneskelige tumorvev isolert fra tykktarmskreftpasienter
in vitro Hotell og
in vivo
modeller som nøyaktig forutsi klinisk effekt har vært vanskelig å identifisere, og mangelen på slike prognostiske modeller fortsetter å føre til omfattende slitasje av kreftlegemidler. Derfor ble nylig isolert, kirurgisk skåret menneskelige tykktarmskreft materialet undersøkt som en ekstra modellsystem for testing ColoAd1. Etter kirurgisk materiale omfatter både tumorvev og normale cellemarginer, gir dette system en utmerket mulighet til å teste tumor selektiviteten av viruset i sammenheng med intakt humant vev. Levedyktigheten av en serie av tumorprøver ble analysert i vevskultur; levedyktighet varierte fra 2 til 6 dager. Følgelig, for å sikre at celledød var på grunn av viralt induserte lysering og frigjøring av virus-avkom og var ikke på grunn av spontan lysering av det kirurgiske materialet, ble en 24-timers endepunkt valgt. Seks tumorprøver ble oppsamlet, og hulle kulturer fra tumor og normale seksjoner (som bestemt ved en klinisk patolog) ble samlet og utsatt for enten Ad5 eller ColoAd1. For å bestemme hver virus «evne til å replikere, lyse og slipper smittende virus, supernatanten ble oppsamlet 24 timer etter infeksjon og analysert med hensyn på tilstedeværelse av virus-avkom. Som vist i figur 4
A
, ColoAd1 genererte rundt to loggene mer viralt avkom på tumor materiale enn på matchet normalt vev, noe som bekrefter dens tumor selektiv replikasjon i nylig isolerte humane tumorvevet. Disse studiene viste også at ColoAd1 utstilt minst en log høyere svulst selektivitet enn kontroll virus, Ad5.
A, etter Punch prøver av fersk skåret menneskelige colontumorer (n = 6) og normal margin områder matchet, ble smittet med enten ColoAd1 eller Ad5 og vedlikeholdes i vevskultur. Den virale burst fra hver prøve ble målt ved hjelp av plakk-analyse etter 24 timer etter infeksjon.
B,
Immunhistokjemisk farging for CD46 stede i kliniske tykktarm svulst, normal tykktarm, og normale leverprøver.
CD46 har blitt identifisert som en mobil vedlegg reseptor for Ad11p, den overordnede virus av ColoAd1 [25], [26]. For bedre å definere uttrykket av CD46 i grunnskolen og metastatisk tykktarmskreft, vi undersøkte tykktarmskreft materiale, normalt levervev og normal kolon vev for CD46 uttrykk ved immunhistokjemi (IHC) (figur 4
B
). Sterk CD46 IHC farging ble konsekvent sett i tykktarm kreft vev, men var fraværende eller generelt svak i normal tykktarm og lever vev. Dette tyder på at CD46 uttrykk kan være en medvirkende årsak til den observerte tumor selektivitet ColoAd1 og dermed kan være et potensielt verktøy for pre-screening pasienter for behandling med dette terapeutisk middel.
ColoAd1 kan tilkobles uten at det går potens
væpnede onkolytiske virus søke å utfylle styrken av onkolytiske virus ved tilsetning av terapeutiske transgener [20]. I denne fremgangsmåten er det viktig at et terapeutisk transgen innføringsstedet i det virale genomet bli identifisert som ikke går ut over levetiden, og derfor styrken av viruset. I motsetning Ad5, der biologi og beskrivelse av innstikk kompatible med viral livssyklus er godt beskrevet, representerer ColoAd1 en roman agent som stammer i hovedsak fra dårlig studert Ad11p genom. Følgelig ble en transposon-basert system som kan skanne genomet for innstikk i et ikke-forutinntatt måte anvendes for identifisering av kompatible transgenet innstikk [27] Gitt at det virale genom som koder kapasitet av det menneskelige Ad er begrenset [28] en konsensus spleise-akseptorsete ble plassert oppstrøms for transgenet, noe som eliminerer behovet for et eksogent promoter og kobling uttrykk for en endogen ColoAd1 promoter [29]. For å styrke evnen til å identifisere transgene uttrykker ColoAd1 varianter, ble GFP valgt som transgenet. En rekke virale isolater ble samlet og deretter screenet for potens og en virus betegnet ColoAd1-GFP ble valgt basert på tilsvarende potens til moder ColoAd1 (Fig. 5A og 5B).
MTS-analyser ble utført på ColoAd1 og ColoAd1-GFP på A) colon tumorcellelinje, HT-29 og B) de primære endotelceller, HUVEC. Reportergenet, GFP, er uttrykt med sen kinetikk (f.eks., Er avhengig av igangsettingen av viral DNA replikasjon for ekspresjon), som definert ved uttrykket C) bare i fravær av AraC og D) mangel på ekspresjon i nærvær av AraC .
Tidligere studier ved hjelp av en spleiseakseptoren baserte uttrykk kassett vist at uttrykket skjedde sent i viral livssyklus og var avhengig av viral DNA replikasjon [29]. Bindings terapeutisk transgen ekspresjon til selektiviteten av viruset har en vesentlig sikkerhetsmessig fordel i forhold til tradisjonelle konstitutiv ekspresjon systemer siden genekspresjon vil være begrenset og avhengig av tumor selektiviteten av den virale system [30]. For å bestemme kinetikken GFP-ekspresjon fra ColoAd1-GFP, ble HT-29-celler infisert i nærvær eller fravær av AraC, en forbindelse som inhiberer virusreplikasjon. Som vist i figurene 5C og 5D, ble GFP uttrykk blokkert ved tilsetning av AraC noe som indikerer at ekspresjon oppstår sent i den virale livssyklus, og er knyttet til virusreplikasjon.
diskusjon
I studien vi etablert forhold som velger potente virale midler, uten bias mot noen mekanisme, fra en pool av Ad serotyper som representerer Ad undergruppene B-F. Denne fremgangsmåten, som er et sterkt akselerert versjon av naturlig seleksjon av virus, kan brukes på en hvilken som helst virus, og noen krefttype valg.
Ved hjelp av denne prosess, vi generert og karakterisert ColoAd1, en ny AD3 /Ad11p kimære onkolytiske virus for behandling av humant tykktarmskreft og eventuelt andre indikasjoner. Dette viruset ble vist å være mer potent og har en større terapeutisk vindu enn Ad5 og den mest klinisk avanserte onkolytisk virus Onyx-015 (tabellene 2-4). Videre ber, ColoAd1 vist økte potentcy i en intravenøs tumormodell og på tumor eksplantater (figurene 3 og 4) .Dette viruset har flere endringer i forhold til den overordnede Ad11p virus, inkludert et kimært E2B region og delesjoner i E3 og E4 regioner. Som endrer eller endringer spille en rolle i den forbedrede styrke av dette viruset er ikke klart. Tapet av gener i Ad5 E3-regionen har vært vist i gruppe B annonser for å forbedre viral lyse og spre [31] av en udefinert mekanisme. Den E2B region koder for pre-terminale protein (PTP) og viral DNA polymerase (DNA pol), to av de tre E2-kodede proteiner som er nødvendige for viral DNA replikasjon. Terminalen 18 bp av det virale genom, anses den minimale replikasjonsorigo, direkte interagerer med PTP og DNA pol heterodimer. Det er viktig å merke seg at når sekvensert de genomiske endene av ColoAd1 og villtype Ad11p var identiske med de av AD3 og kom i konflikt med de beskrevne DNA-sekvens termini beskrevet for Ad11p [32], [33]. Således kan E2B forandringer i ColoAd1 generere en PTP-DNA pol heterodimer som er mer forenlig med terminalen 18BP av ColoAd1 enn den opprinnelige Ad11p PTP-DNA pol. Kombinert med ColoAd1 er mindre genom (et resultat av genomisk slettinger) dette viruset kan replikere raskere og også nå en kritisk viral utbrudd størrelse raskere, og dermed styrke viral lyse og spre seg.
Med hensyn til selektivitet, studier med PTP av Ad5 har vist at den kommuniserer med CAD, en rekke protein ansvarlig for TP-atom matrise forening. Nivået av DAK er korrelert med graden av celledeling; 2-5 ganger høyere nivåer i tumorceller enn på normale celler og nesten ikke-eksisterende i hvilende celler [34], [35]. Følgelig kan TP endringer og deres potensielle interaksjoner med CAD (eller lignende proteiner) også være mekanismer forbedret replikasjon og /eller selektiviteten av viruset.
Den tredje endring i ColoAd1 virusgenomet er en liten delesjon (24 bp) som kartlegger E4orf4 region av viruset. Den E4orf4 proteinet av Ad5 samvirker med vertscellens serin /treonin proteinfosfatase 2A (PP2A), [36]. Dette samspillet har vist seg å indusere p53-uavhengige apoptose, inaktivere spleising faktorer, og redusere E1A aktivering av AP-1, JunB, og uttrykk for Ad E2 og E4 transkripsjons enheter [37]. Men siden E4 region er sterkt skjøtes, det E4orf4 genet delesjon kan også endre ekspresjonen av en annen E4-genet i dette komplekset transkripsjonsenheten, og dermed indirekte bidrar til den forbedrede styrke av ColoAd1. I tillegg, er det ikke klart at Ad11p og AD3 proteiner opprettholde en hvilken som helst eller alle de funksjoner tilskrives homologe proteiner Ad5. Dermed fremskrivninger av Ad5 protein funksjoner til proteiner i ColoAd1 må nøye testet. Følgelig, mens det er klart at CololAd1 har gjennomgått en rekke genetiske endringer som resulterer i en mer potent virus, er det ikke klart hvilken endring (e) er ansvarlig for forbedret potens.
Det er viktig å merke seg at ColoAd1 er medlem av gruppen B annonser og dermed tydelig forskjellig fra de tradisjonelle Ad5-baserte onkolytiske virus. Det betyr ikke, for eksempel, bruker Ad5 reseptoren, (Coxsackie B- og adenovirus reseptor, CAR), for feste til cellene. I stedet vises ColoAd1 å ansette minst to reseptorer som er tydelig forskjellig fra CAR [22], [38], [39], hvorav den ene har nylig blitt beskrevet som CD46 [25], [26]. Betydningen av dette understrekes av nyere studier på klinisk materiale som viser at bilen er dårlig uttrykt på en rekke forskjellige krefttyper, og at CAR uttrykk avtar med forkant i scenen og karakteren av svulsten [40], [41], [42 ], [43], [44]. Andre rapporter om tumor suppressor egenskaper CAR [45], [46] og påvisning av løselig CAR i svulsten mikromiljøet [47] ringe inn spørsmål bruk av CAR-avhengige adenoviruses for behandling av alle menneskelige kreft. I motsetning til dette ser ut til tumorcelleoverflate-ekspresjon av CD46, det antatte ColoAd1 reseptoren, til å øke med stadium og grad i en rekke kreftformer [48]. Dermed kan ColoAd1 har terapeutisk anvendelse utover tykktarmskreft, og studier for å undersøke dette er pågående. Av ytterligere betydning er data som viser at seroprevalence av Ad11p er lav [22], [23]. Siden har størst behov for denne type terapeutisk er i pasientpopulasjoner hvor svulsten har gått fra en begrenset lokal sykdom til en systemisk, metastatisk kreft, behandling av pasienter med et middel som de ikke har pre-eksisterende immunitet bør styrke muligheten for agent for å sirkulere og eliminere metastatiske tumorceller. Dette er i motsetning til Ad5 hvor sero-utbredelse, som målt ved hjelp av nøytraliserende antistoffer, når nivået av ca. 50% i den generelle populasjonen [23], [49].
Det er viktig å merke seg at styrken av ColoAd1 kan suppleres med en og potensielt mer terapeutiske transgener. Evnen til å tilkoble disse midler representerer en unik mulighet for å påvirke behandlingen av kreft på flere nivåer fra et enkelt middel. Som demonstrert ved inkorporering og effektiv ekspresjon av GFP fra ColoAd1 genomet, kan armeringsforekomme uten at styrken eller selektiviteten av den virale terapeutisk. I tillegg til å inkorporere stoffer som utfyller onkolytisk potensialet av virus (f.eks prodrug-konverterende enzymer, anti-angiogene faktorer, immunotherapeutics,), gir aktivering mulighet for klinikere å spore aktiviteten til den virotherapy behandling i en minimal invasiv måte [50] . Dette er gjort enda mer meningsfylt hvis metoden for å spore virotherapy er direkte knyttet til den virale livssyklus. I tilfelle av ColoAd-GFP, dette har helt klart vært vist, hvor GFP-ekspresjon ble påvist å være direkte knyttet til DNA-replikasjonen (figur 5B). Forskjellige gener er identifisert som ville tillate leger å spore viral aktivitet og inkluderer gener assosiert med radionukleid-avbilding (for eksempel HSV-1 TK, human tyreoidea natriumjodid symporter, [51], [52]), og oppløselige markør peptider lett detekterbart i blodet eller via urinprøver (for eksempel human carcinoembryonic antigen, β-kjeden til humant choriongonadotropin [53], [54], [55]). Ved hjelp av ekspresjon av det koblede genet som en biomarkør for viral replikasjon og spredning representerer en mulighet for klinikere å tilpasse behandlingen, noe som gir ytterligere doser bare etter behov, og dermed beveger seg bort fra standard, tidsbestemte doser som vanligvis forbindes med dagens kjemoterapi behandlinger. Like viktig, som vi anser å balansere behovet for økt potens med sikkerhet av viral terapi, armering kan også brukes til å inkorporere en «sikkerhetsventil» i virotherapy, i stand til å avbryte viral-basert terapi ved administrering av en klinisk godkjent legemiddel (f.eks. innlemmelse av HSV TK genet og administrasjon av gancyclovir).
