Abstract
CD44 og CD147 er assosiert med kreft metastase og progresjon. Vårt formål i studien var å undersøke effekten av nedregulering av CD44 eller CD147 på metastatisk evne til prostatakreft (CAP) celler, deres docetaxel (DTX) respons og mulige mekanismer involvert
in vitro Hotell og
in vivo
. CD44 og CD147 ble slått ned (KD) i PC-3M-luc cap celler ved hjelp av kort hårnål RNA (shRNA). Uttrykk av CD44, CD147, MRP2 (multi-drug resistance protein-2) og MCT4 (monokarboksylat tranporter-4) ble evaluert med immunfluorescens og Western blotting. DTX dose-respons og proliferasjon ble målt ved MTT og kolonianalyser, respektivt. Den invasive potensiale ble vurdert ved hjelp av en matrigel kammer analysen. Signaltransduksjon proteiner i PI3K /Akt og MAPK /ERK trasé ble vurdert ved Western blotting. En
in vivo
subkutan (subkutant) xenograft modell ble etablert for å vurdere Cap tumorigenecity, lymfeknutemetastaser og DTX respons. Våre resultater indikerer at KD av CD44 eller CD147 redusert MCT4 og MRP2 uttrykk, redusert Cap spredning og invasiv potensial og forbedret DTX følsomhet; og KD av CD44 eller CD147 nedregulert p-Akt og p-Erk, de viktigste signal modulatorer assosiert med cellevekst og overlevelse.
In vivo
, CD44 eller CD147-KD PC-3M-Luc xenografter vises undertrykte tumorvekst med økt DTX respons sammenlignet med kontroll xenografter. Både CD44 og CD147 forbedre metastatisk kapasitet og chemoresistance av Cap celler, potensielt mediert av aktivering av PI3K og MAPK veier. Selektiv målretting av CD44 /CD147 alene eller i kombinasjon med DTX kan begrense Cap metastaser og øke kjemosensitivitet, med løfte for fremtiden Cap behandling
Citation. Hao J, Madigan MC, Khatri A, Strøm CA, Hung TT, Beretov J, et al. (2012)
In Vitro Hotell og
In Vivo
prostatakreft metastase og Chemoresistance kan moduleres av Expression av enten CD44 eller CD147. PLoS ONE 7 (8): e40716. doi: 10,1371 /journal.pone.0040716
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 1 februar 2012; Akseptert: 12. juni 2012; Publisert: 03.08.2012
Copyright: © Hao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Health Medical Research Council (NH MRC) (YL), St George Medical Research Foundation (YL), Urologi Forskningsfond (PJC) og St George Hospital Trust Fund (PHG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (CAP) er den vanligste diagnosen og den nest største årsaken til død av kreft hos menn i USA [1]. Selv om utgangspunktet lydhør overfor androgen deprivasjon terapi (ADT), de fleste pasienter lider av kreft tilbakefall etter 12 måneder, og lue på dette stadiet er ikke lenger kureres [2]. Progresjon av Cap til et avansert stadium er preget av spredning av ondartede kreftceller og små celleklynger gjennom lymfekar og blodårer. Selv om flere genetiske og epigenetiske forandringer er rapportert i Cap progresjon, de cellulære mekanismene som er involvert i utviklingen av lokaliserte cap til metastatisk sykdom forbli udefinert.
Kjemoterapi er tradisjonelt brukt for palliasjon av symptomer assosiert med avansert Cap. To siste docetaxel (DTX) -baserte kliniske studier har for første gang vist de potensielle fordelene ved cellegift for å forlenge overlevelsestiden og livskvalitet for Cap pasienter [3], [4]. DTX er i dag den mest effektive kjemoterapeutiske stoffet for metastatisk Cap [3] – [6]. Imidlertid legemiddel-resistente karakter av netting fremdeles utfordringer effektiviteten av slike behandlinger. Åpenbart multiresistens og metastatisk sykdom er fortsatt de viktigste årsakene til behandlingssvikt og dødelighet i Cap pasienter. Dermed er det av stor verdi å undersøke mekanismene og veier av Cap metastase og narkotika motstand, identifisere nyttige terapeutiske mål å forbedre dagens behandlingsformer.
CD44 er en multifunksjonell protein som er involvert i celle adhesjon, migrasjon, resistens , signaloverføring, migrasjon og apoptose [7], [8]. Den CD44-genet inneholder 20 eksoner alternativt spleisede for å gi mange isoformer eller varianter (CD44v), hvorav noen danner invariant ekstracellulære domene av CD44 standard (CD44s). CD44 er en primær reseptor for hyaluronan (HA), en viktig komponent av den ekstracellulære matriks (ECM) og kritisk for cellesignalisering, og celle-interaksjoner i ECM kreft. CD44-bindende HA stimulerer nedstrømseffekter på cytoskjelett proteiner involvert i tumorcellemigrering, samt stimulere multiresistens protein1 (
MDR1
) ekspresjon og medikamentresistens [9]. CD44s er til stede på membranen i de fleste virveldyrceller [7]. Uttrykket av visse CD44 varianter er rapportert å være nært knyttet til tumorprogresjon, og dette varierer avhengig av tumortype studert [10]. Spennende studier har implisert HA /CD44 interaksjoner i epiteliale mesenchymale-overgang (EMT), «stemness» og kreft [11], [12]. Samspillet mellom HA og CD44 er blitt vist å utløse veier i forbindelse med tumorvekst og overlevelse [13], [14]. Imidlertid er rollen til CD44s og CD44v i Cap utvikling og progresjon annerledes, med studier som viser både krefthemmende (CD44s) og tumor-fremme (CD44v) effekter [15] – [17]. Involvering av CD44 og variantene i Cap progresjon og metastaser garanterer videre etterforskning.
CD147 (ekstracellulære matriksmetalloproteinase indus protein-EMMPRIN) er et multifunksjonelt glykoprotein som kan endre svulstens mikromiljø ved å aktivere proteinaser, indusere angiogene faktorer i både tumor og stromale celler, og regulering av vekst og overlevelse av forankringsuavhengige tumorceller (mikrometastaser), så vel som resistens mot flere legemidler [18]. Transkriptom analyse og komparativ genomisk hybridisering av enkelte kreftceller isolert fra benmargen av pasienter med Cap viste at CD147 er den hyppigst uttrykte protein i primærsvulster og mikrometastaser [19]. Videre økte CD147 uttrykk er assosiert med økt risiko inkludert prostata spesifikt antigen (PSA) svikt, metastase, og redusert total overlevelse i menneskelig Cap [20]. Vi har nylig vist at de høye nivåer av ekspresjon CD147 korrelerer med netting progresjon og er forbundet med ekspresjon av MMP (matriks-metalloproteinaser) i tumor samt stromale celler [21]. Disse resultatene tyder på at CD147 kan være et nyttig terapeutisk mål for Cap terapi. Men rollen som CD147 i Cap metastaser og medikamentresistens er fortsatt uklart.
I denne studien hypotese vi at (1) CD44 og CD147 uttrykk korrelerer med metastatisk kapasitet og chemoresistance på capsen og kan samarbeide for å påvirke Cap progresjon og (2) nedregulering av CD44 eller CD147 uttrykk kan ha terapeutisk potensial i begrensende Cap metastase og styrke Cap kjemoterapeutisk følsomhet. Vi viser i følgende seksjoner som CD44 og CD147 jf egenskaper vesentlige for Cap metastase og chemoresistance
in vitro Hotell og
in vivo
, og er nyttige terapeutiske mål for fremtiden Cap terapi.
Materialer og Metoder
Antistoffer
Antistoffer ble innhentet fra ulike kilder. Den detaljerte informasjon og vilkår for alle antistoffer er oppført i Tabell 1.
Cell linje og cellekultur
androgen-ikke-responsiv PC-3M-luc-C6 (PC- 3M-luc) CAP cellelinjen ble hentet fra Xenogen Corp, USA. Alle vev kultur reagenser ble levert av Invitrogen Australia Pty Ltd (Melbourne, VIC, Australia), med mindre annet er oppgitt. PC-3M-Luc-celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% (vol /vol) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 50 U /ml penicillin, og 50 U /ml streptomycin. PC-3M-luc-scr (kryptert shRNA kontroll), PC-3M-luc-CD44-knockdown (KD), ble PC-3M-luc-CD147-KD-celler dyrket i det samme medium supplert med ytterligere 1 ug /ml puromycin for screening. Alle cellelinjer ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2.
Kort hårnål RNA (shRNA) transfeksjon for CD44 /CD147
PC-3M-Luc celler med shRNA-mediert KD av CD44 (s og v) /CD147 eller en eggesekvensstyring for off-target effekter (PC-3M-luc-SCR) ble generert ved hjelp av en tidligere utgitt metode med modifikasjon [22]. Fem MISSION® lentiviral transduksjon partikler koding for shRNAs mot CD44 eller CD147 og MISSION® utenfor målgruppen shRNA kontroll transduksjon partiklene ble brukt (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia) (tabell S1). I korthet ble 2 x 10
4 PC-3M-Luc-celler ble dyrket i 24 brønners plater og transdusert med alle fem kloner av lentivirale partikler eller den samme mengde av ikke-target-shRNA kontrolloverføringspartikler etter produsentens protokoll (multiplisitet av infeksjon = 2, virale overførende enheter /celle). De transduserte kloner ble selektert på puromycin-holdige cellekulturmedium (0,5 ug /ml) (Invitrogen Australia Pty Ltd, Melbourne, VIC, Australia), formert og til slutt overført til 25 cm
to cellekultur kolber og opprettholdt i mediet inneholdende 1,0 ug /ml puromycin for de følgende eksperimenter.
Immunofluorescence konfokal mikroskopi-analyse av PC-3M-luc og PC-3M-luc-KD-cellelinjer
Immunofluorescence farging ble utført som tidligere beskrevet [23]. I korthet ble celler dyrket på dekkglass fiksert, vasket og inkubert med forskjellige primære antistoffer over natten (o /n) ved 4 ° C: mus-anti-humant CD44 monoklonalt antistoff (MAb) (1:200 fortynning), CD147 polyklonalt antistoff (PAb ) (1:100 fortynning), MRP2 MAb (1:50 fortynning), kanin anti-humant MCT1 Pab (1:200 fortynning) eller MCT4 Pab (1:400 fortynning). Etter skylling i TBS, ble celler inkubert i 45 minutter i Alexa Fluor-488 geit anti-mus eller Alexa Fluor-488 geit-anti-kanin-IgG (1:1000 fortynninger) ved romtemperatur (RT). Propidiumjodid (PI) (0,2 mg /l) ble anvendt for å flekke kjernene. Negative kontroller ble behandlet likt, men inkubert med enten mus eller kanin isotype kontroll. Immunfluorescens ble visualisert ved hjelp av en FV300 /FV500 Olympus laser scanning confocal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).
Western blotting-analyse
protein uttrykk nivåer ble bestemt ved Western blotting-analyse som beskrevet [24] . Kort sagt ble helcellelysater separert ved NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris-gel-elektroforese og deretter overført til polyvinylidendifluorid-membran. Etter blokkering av ikke-spesifikke steder med 5% skummet melk, ble membranen inkubert med spesifikke antistoffer i passende konsentrasjoner (tabell 1), etterfulgt av inkubasjon med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoff (geite-anti-mus eller anti-geit kanin passende for vertsarter primært antistoff) (1:5000 fortynning). Immunoreaktive bånd ble påvist ved anvendelse av forsterket kjemiluminescens (ECL) substrat (Pierce Chemical Co., Rockford, USA), og avbildes med Imagequant LAS4000 systemet (GE helsevesenet, USA). For å bekrefte lik belastning av proteinlysatene ble membraner strippet (Gjenopprett Western Blot Stripping Buffer, Pierce) og re-analysert ved hjelp av musen anti-
β
-tubulin MAb (1:10000 fortynning), deretter behandlet som ovenfor. Bilder ble behandlet i Adobe Photoshop.
Co-immunoprecipitation (IP) assay
Cell lysat som inneholdt 200 mikrogram helcellelysater fra PC-3M-Luc celler ble inkubert med to mikrogram av anti- CD44 eller anti-CD147 antistoffer (ABS) eller normal serum (Ig-kontroll) o /n ved 4 ° C. Immunkompleksene ble isolert ved utfelling under anvendelse av protein A /G PLUS-agarose (Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA) i 8 timer ved 4 ° C. Perlene ble vasket 4 ganger ved 1000
g
og ble suspendert i 20
μ
L av NuPAGE LDS-prøvebuffer (Invitrogen Australia Pty Ltd, Australia), deretter oppvarmet ved 100 ° C i 5 minutter . Ekstraktene ble deretter immunoblottet med CD44 og CD147 primære antistoffer, etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugerte sekundære antistoffer og detektert ved anvendelse av ECL substrat. Bildeanalyse var som beskrevet ovenfor (Western blotting).
MTT-assay for DTX reaksjon
MTT-analyser ble utført som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med en rekke konsentrasjoner (0,001 til 1000 nM) i DTX fortynnet i 100% etanol, og en bærerkontroll. Etter 72 timers inkubering ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende 0,5 mg /ml MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid]. Etter 4 timer ble supernatantene fjernet og den resulterende MTT formazan oppløst i DMSO og målt spektrofotometrisk ved 562 nm på et BIO-TEK mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Resultater representerer OD forholdet mellom DTX-behandlet og kjøretøy-behandlede celler. Den veksthemming kurve ble generert ved hjelp av GraphPad Prism 4 Program (GraphPad, San Diego, CA, USA). Absolutt IC
50-verdier ble beregnet ved hjelp av skjæringspunktet mellom 50% normaliserte medikamentrespons og veksthemmingskurver for hver cellelinje, for å finne X-aksen verdiene for IC
50 DTX-konsentrasjon (nM).
Colony forming analyser
PC-3M-luc og PC-3M-luc-KD celler ble brukt for kolonidannende analyser som beskrevet tidligere med mindre modifikasjoner [25]. I korthet, 1500 celler /skål ble sådd ut i 10 cm skåler i 48 timer ved 37 ° C, 5% CO
2 og deretter behandlet med en fast dose av DTX på 3,5 nM endelig konsentrasjon (1/2 dose av det laveste IC
50 fra MTT-analysen i fire hodecellelinjer), eller det samme volumet av bærerkontrollen (100% etanol). Etter 3 dagers behandling ble DTX-inneholdende medium erstattet med friskt medium, og alle kulturer ble inkubert i ytterligere 7 dager inntil kolonier var store nok til å være klart skjelnes. Koloniene, definert som grupper av 50 celler, ble bedømt manuelt ved hjelp av et Olympus INT-2 invertert mikroskop (Tokyo, Japan). Gjennomsnittlig antall kolonier ble plottet (Mean ± SD, n = 3).
Matrigel invasjonen assay
Invasive evne Cap cellelinjer ble bestemt ved bruk av kommersielle matrigel og kontrollere Transwell kamre (BD Biovitenskap , NSW, Australia). Kort, 2 × 10
4 PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD og PC-3M-luc-CD147-KD cap celler i 500 mL serumfritt medium ble tilsatt til hver transwell sette inn og 750 pl komplett medium ble tilsatt til den ytre godt for å tilveiebringe kjemotiltrekkende og forhindre dehydrering. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 for 24 timer og deretter farget med en Diff-Quik flekker kit (Allegiance Healthcare Corp, McGraw Park, Illinois, USA). Overskuddsfarge ble vasket bort med vann fra springen og antallet fargede celler som invaderte gjennom Matrigel eller kontrollinnsatser ble regnet med i fem høye kraft felt (HPF) ved lysmikroskopi (Leica mikroskop, Nussloch, Tyskland). Invasive potensiale ble beregnet som følger:% Invasion = [(Mean celler invaderer gjennom matrigel setter membranen) /(Gjennomsnittlig celler migrerer gjennom kontroll innsats membran)] × 100%. Cell invasjon priser ble plottet, med gjennomsnitt og SD (n = 3).
subkutan (sc) xenograft dyremodell
Herre, 6-8 uker gamle Balb /c naken mus (Animal Resources Centre, Western Australia) ble plassert under bestemte patogen frie forhold i anlegg som er godkjent av University of New South Wales (UNSW) Animal Care og etisk komité (ACEC) og manipulasjoner ble utført i laminær skap. ACEC spesielt godkjent denne studien (godkjenning ID er 10 /121A). Musene ble holdt i minst en uke før eksperimentell manipulasjon. Alle mus forble sunn og aktiv under forsøket. Som beskrevet tidligere [26], kultivert PC-3M-luc, PC-3M-luc-SCR, PC-3M-luc-CD44-KD eller PC-3M-luc-CD147-KD Cap celler (1,5 x 10
6 /injeksjon) i 100 ul DPBS ble implantert subkutant i den høyre bakre flanke region av mus (n = 10 mus /per gruppe). Tumorprogresjon ble dokumentert ukentlig av målinger ved hjelp av kalipere, og svulstvolum ble beregnet som følger: lengde x bredde x høyde x 0,52 (i millimeter) [27] for opptil åtte uker. Ved ofring ble primære svulster og lokale regionale lymfeknuter fjernet for histologisk undersøkelse.
DTX respons i Cap subkutant dyremodell
Etter å etablere subkutant modeller med CAP-cellelinjer, når gjennomsnittlige tumorstørrelsen nådde 30 ± 10 cm
3 i hver undergruppe (n = 10 /undergruppe), 5 mus (n = 5) ble behandlet med 25 mg /kg DTX kontinuerlig i 3 uker etter ip injeksjon, og 5 mus (n = 5) ble behandlet med bærerkontroll (saltvann). Tumorvekst ble beregnet ved målinger ved hjelp calipers som publisert [27].
Mus vev og histologi
Alle vev ble enten formalin faste eller hurtigfrosset. Hematoxylin og eosin (H E) -stained seksjonene ble anmeldt for å vurdere svulst struktur. Tumorxenografter og lokale regionale lymfeknuter ble oppsamlet ved slutten av forsøkene og behandlet for histologi, immunhistokjemi og TUNEL assay. Fem-mikron frosne snitt av friske tumor-prøver ble brukt for CD31 og CD44 immunfarging.
Immunhistokjemi
Standard immunoperoxidase prosedyrer ble anvendt for å visualisere CD147, Ki-67, og caspase-3 (aktiv) som tidligere publisert [28]. Kort sagt ble avvokset parafinsnitt og rehydrert, deretter inkubert med primære antistoffer (ABS) anti-CD147 (1:200), Ki-67 (1:1000 fortynning) og kaspase-3 (aktiv) (1:100 fortynning), respektivt o /n ved 4 ° C. Platene ble deretter inkubert med svin anti-geit, mus, kanin IgG biotinylert sekundært antistoff (1:150 fortynning) i 45 minutter ved romtemperatur og med streptavidin /HRP-løsning (1:300 fortynning) i 30 minutter ved RT. Seksjonene ble endelig utviklet med 3,3 «diaminobenzidine (DAB) substrat løsning (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia), deretter kontra med hematoksylin; positive celler dukket brun. Slides ble behandlet på en identisk måte, og ved hjelp av isotype Abs eller utelatelse av primært antistoff som en negativ kontroll.
CD44 og CD31 immunfarging på frosne snitt ble utført som tidligere publisert (28). Seksjoner ble inkubert med muse-anti-human CD44 (1:200 fortynning) eller rotte-anti-mus CD31 MAb (1:100 fortynning) o /n ved 4 ° C. Seksjoner ble inkubert med kanin-anti-muse /rotte biotinylert IgG (1:200 fortynning) i 45 minutter ved RT, og deretter med konjugert streptavidin /HRP (1:200 fortynning) i ytterligere 30 minutter. Snittene ble utviklet ved hjelp av DAB-løsning (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia), og kontra med hematoksylin. For negative kontroller, ble seksjonene farget med isotype MAb eller med utelate primære antistoffer.
TUNEL analyse for apoptotiske celler
in vivo
Apoptose ble vurdert på tumor xenograft vev ved hjelp tunel metoden med TdT-fragEL in situ apoptotisk deteksjon kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Spesifisiteten til TUNEL reaktivitet ble bekreftet med egnet negativ (TdT utelatt fra merking mix) og positive (behandlet HL-60 sklier som tilbys av selskapet) kontrollene. Lysbilder ble undersøkt ved hjelp av en Leica lysmikroskop (Nussloch, Tyskland).
Vurdering av farging
Farging intensitet (0-3) ble vurdert ved hjelp av lysmikroskopi (Leica, Tyskland) og en x40 objektiv . Kriteriene som benyttes for vurdering ble som tidligere rapportert [29], hvor: 0 (negativ, 25%); 1+ (svak, 25-50%); 2+ (moderat, 50-70%); 3+ (sterk, 75%) av tumorcellene farget. Evaluering av vev farging ble gjort, uavhengig av hverandre, av tre erfarne observatører (JH, JB og YL). Alle prøvene ble scoret blind og et gjennomsnitt på karakterer ble tatt.
Statistisk analyse
Alle numeriske data ble uttrykt som gjennomsnittet av verdiene oppnådd, og standardavviket (SD) ble beregnet. Data fra forskjellige grupper ble sammenlignet ved bruk av to-hale students t-test. Alle
P
verdiene var to-sidig. Den statistiske analyse av immunfarging intensitet i dyre xenotransplantater ble utført som beskrevet i en nylig publikasjon [28]. Én-veis ANOVA, fulgt av Dunnetfs post hoc test ble utført for å bestemme signifikans av forskjeller mellom vekstkurver i s.c. modell for tumorvolumendringer.
P
0,05 ble betraktet som signifikant. Alle tall statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 4.00 pakke (GraphPad, San Diego CA).
Resultater
Uttrykk av CD44, CD147, MCT4 og MRP2 i CD44 eller CD147-KD og kontroll cellelinjer
PC-3M-luc og PC-3M-luc-scr Cap cellelinjer viste sterk positiv farging for CD44, CD147, MCT4 og MRP2 (fig. 1a). Etter CD44 slå ned, ble reduksjonen i CD44 ekspresjon også forbundet med en samtidig reduksjon i nivåene av ekspresjon av CD147, MCT4 og MRP2 (Fig. 1A). Tilsvarende etter banket ned CD147, nivåene av CD147 uttrykk ble redusert og en samtidig reduksjon i nivåene av uttrykk av CD44, MCT4 og MRP2 ble også sett (Fig. 1a). Ingen påvisbar farging ble observert i cellene inkubert med isotype-kontroller (data ikke vist). De immunfluorescens fargings resultater i de forskjellige cellelinjer med netting er oppsummert i tabell 2. immunfluorescens resultater for ekspresjon av CD44, CD147, MCT4 og MRP2 i Cap cellelinjer ble ytterligere bekreftet ved Western-blotting (fig. 1B). PC-3M-luc cellelysater ble også immunopresipitert med enten anti-CD44 antistoff, anti-CD147 antistoff eller normal serum (Ig), og immunoblottet med CD44 og CD147 Abs (Fig. 1C). Både CD44 (90 kd) og CD147 (-50 KDA) bånd ble påvist i anti-CD44 og anti-CD147 antistoff IP lysatene henholdsvis, men ikke i Ig utfelt lysat.
Representative confocal bilder av CD44, CD147 , MCT4 og MRP2 (grønn) immunfluorescens etter banket ned CD44 eller CD147 (A). Kjerner er farget med PI (rød). Forstørrelse: alle bildene × 400. Representative western blot er vist for å bekrefte immunofluorescens-farging (B). β-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. scr: egge shRNA kontroll. PC-3M-Luc cellelysater immunoutfelt med anti-CD44, anti-CD147 antistoff, og normalt serum (Ig), etterfulgt av immunblotting med enten CD44 eller CD147 antistoff (C). IB: immunoblotting; IP:. Immunpresipitasjon
Slå ned på CD44 eller CD147 sensitizes monolayer Cap celler til DTX behandling
in vitro
KD (PC-3M-Luc -KD-CD44 og PC-3M-luc-KD-CD147) og kontroll (PC-3M-luc og PC-3M-luc-SCR) CAP cellelinjer med ulike nivåer av CD44 og CD147 uttrykk reagerte forskjellig på DTX behandling. IC
50-verdier (den dose for oppnåelse av 50% celledreping) sterkt korrelert med nivåer av CD44 og CD147 ekspresjon (Fig. 2A). Følgelig PC-3M-Luc og PC-3M-luc-SCR kontrollceller (høye nivåer av CD44 og CD147) var den minst følsomme (IC
50: 118 og 104 nM), mens PC-3M-Luc -CD44-KD og PC-3M-luc-CD147-KD celler (lave nivåer av CD44 og CD147) var svært følsomme for DTX behandling (IC
50: 7 og 19 nM). Signifikante forskjeller (
P
0,05) i IC
50 ble observert mellom PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD celler og PC-3M-Luc /PC-3M-luc-SCR celler.
PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD og PC-3M-luc-CD147-KD Cap celler behandlet med DTX (0.001-1000 nM) viste variabel respons. Sensitivitet av CD44 /CD147-KD-celler til forskjellige konsentrasjoner av DTX sammenlignet med kontroller var åpenbart øket ved MTT-assay (A) (
P
0,01). Fire hodecellelinjer ble utsådd i 10 cm skåler og behandlet med en fast DTX-dose (3,5 nM) i 3 dager. Etter behandling ble cellene dyrket i vekstmedium for 7 d. Resultatene er angitt som antall kolonier dannet. Typiske Bildene vises for kolonivekst i Cap cellelinjer som ble behandlet med VC eller DTX (B). Typiske resultater av DTX følsomhet i kolonier av Cap cellelinjer er vist (C): «▴» indikerer ingen signifikant forskjell i gjennomsnittlig antall kolonier mellom DTX behandlede celler og VC-behandlede celler i PC-3M-luc /PC-3M- Luc-SCR cellelinjer (
P
≥0.05); «○» indikerer signifikant forskjell i gjennomsnittlig antall kolonier mellom DTX behandlede celler og VC behandlet celler i PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-Luc-CD147-KD cellelinjer (
P
0,05); «Δ» indikerer signifikant forskjell i gjennomsnittlig antall kolonier mellom DTX behandlede celler i PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD cellelinjer og VC behandlet celler i PC-3M-Luc /PC -3M-luc-SCR cellelinjer (
P
0,05). Matrigel invasjon assay ble anvendt for å undersøke endringen i invasjonen potensial i PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr og PC-3M-luc-CD44 /CD147-KD-celler. henholdsvis invasiv potensiale ble signifikant redusert til 25% og 50% i PC-3M-luc-CD44-KD og PC-3M-luc-CD147-KD, sammenlignet med 69% og 64% i PC-3M-luc og PC-3M -luc-scr, henholdsvis (
P
0,01) (D). Representative lys mikroskopi bilder for Cap celle invasjon (E). Fire signaltransduksjon molekyler (p-Akt, t-Akt, p-ERK og t-ERK) ble vurdert til å undersøke forholdet mellom CD44, CD147 og cellesignalveier. Nivåene av p-Akt og p-Erk ble redusert i KD cellelinjer sammenlignet med vill-type og SCR kontroller. Representative resultater er vist (F). Alle resultatene var fra tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SD, n = 3). DTX: docetaxel; KD: slå ned; p-Akt: fosforylert-Akt; p-Erk: fosforylert-Erk; scr: egge shRNA kontroll; t-Akt: total-Akt; t-Erk: total-Erk; VC: kjøretøy kontroll; * Viser 0,01
P
0,05; ** Indikerer 0,001
P
0,01; *** Indikerer
P
0,001
Slå ned på CD44 eller CD147 reduserer klonogene evne og sensitizes Cap kolonier til DTX behandling
For å undersøke om KD. av CD44 og CD147 påvirke clonogenicity av enten alene eller i kombinasjon med DTX behandling, vurdert vi KD og kontroll Cap-celler i kultur. Antallet kolonier ble signifikant redusert enten med bærerkontroll eller med DTX behandling i PC-3M-luc-CD44 eller CD147-KD-celler sammenlignet med PC-3M-luc eller PC-3M-luc-SCR-celler, mens det ikke var noen signifikant forskjellen (
P
≥0.05) mellom antall kolonier generert fra PC-3M-luc og PC-3M-luc-SCR celler. Signifikante forskjeller (
P
0,05) i gjennomsnittlig antall kolonier ble observert 1) mellom DTX behandlede celler og VC behandlet celler i PC-3M-luc-CD44-KD /CD147-KD cellelinjer; 2) mellom DTX behandlet PC-3M-Luc-CD44-KD /CD147-KD celler og VC behandlet PC-3M-Luc /PC-3M-Luc-scr celler. Representative bilder er vist i fig. 2B. DTX respons i PC-3M-luc-CD44 eller CD147-KD cellelinjer var større enn for PC-3M-luc og PC-3M-luc-SCR cellelinjer (Fig. 2C). Den clonogenicity (gjennomsnittlig DTX-behandlet kolonier /gjennomsnittlig kjøretøykontroll behandlede kolonier%) var 89%, 84%, 56% og 74% for PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc- CD44-KD, og PC-3M-luc-CD147-KD cellelinjer, henholdsvis.
slå ned på CD44 eller CD147 reduserer Cap celle invasjon
Etter banket ned CD44 eller CD147, celle invasjon ble betydelig redusert for både PC-3M-luc-CD44-KD (
P
0,001) og PC-3M-luc-CD147-KD celler (
P
0,01) sammenlignet med PC-3M-luc og PC-3M-luc-SCR kontrollceller (fig. 2D). En relativt større reduksjon i invasjon egenskaper ble funnet i PC-3M-luc-CD44-KD-celler enn i PC-3M-luc-CD147-KD-celler (Fig. 2D). Prosent invasjonen for PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD og PC-3M-luc-CD147-KD celler var 70%, 62%, 22% og 47 % henholdsvis (fig. 2D). Representative bilder for hver cellelinje er vist i fig. 2E.
PI3K /Akt og MAPK /ERK signalveier er relatert til uttrykk av CD44 og CD147 i Cap celler
Etter banket ned CD44 eller CD147, fant vi at uttrykket av p- Akt og p-Erk ble både nedregulert i PC-3M-luc-CD44 eller CD147-KD celler sammenlignet med PC-3M-luc og PC-3M-luc-SCR kontrollceller, med mer betydelig reduksjon i PC-3M-luc- CD44-KD-celler; det var ingen åpenbare endringen i t-Akt og t-Erk uttrykk i alle Cap cellelinjer (Fig. 2F).
Slå ned på CD44 eller CD147 påvirker tumorigenicity, lymfeknutemetastaser og DTX følsomhet i en såkalt xenograft modell
Som vist i tumorvekst grafene i fig. 3A, sammenlignet med scr kontroll, den ukentlige målinger av CD44 og CD147 KD xenografter, behandlet enten med kjøretøy kontroll (VC) eller DTX (25 mg /kg), viste en betydelig redusert svulst vekst i både VC (
P
0,05) og DTX-behandlede grupper (
P
0,05) (til venstre og midtre paneler). Det var ingen signifikante forskjeller i tumor vekst på PC-3M-Luc villtype og PC-3M-luc-SCR xenografter i enten VC eller DTX behandlet grupper (
P
0,05). I VC-behandlede xenotransplantater ble en litt sterkere regresjon av tumorvekst sett i CD44 KD xenografter sammenlignet med CD147 KD xenografter, mens ingen åpenbar forskjell ble funnet mellom vekst av CD44 KD og CD147 KD svulster (
P
0,05). I DTX-behandlede xenotransplantater, de tumorxenografter fra de fire hodecellelinjene hadde mindre tumorvolum sammenlignet med tilsvarende VC-behandlede xenotransplantater ved alle tidspunkter (
P
0,05). Litt mer tumor regresjon er sett i DTX-behandlede CD44-KD xenografter men ingen signifikant forskjell mellom CD44-KD og CD147-KD vekstkurver (
P
0,05). I tillegg, sammenlignet vi forholdet mellom tumorvolumer mellom DTX og VC behandlede xenotransplantater (DTX /VC) (Fig. 3A, høyre panel). Forholdet mellom CD44-KD og CD147-KD tumorvolumer (DTX /VC) ble redusert raskere respons på DTX eller VC behandling, noe som tyder på at den KD av enten CD44 eller CD147 kan indusere undertrykkelse av tumorutvikling, sammenlignet med scr og vill- skriver xenografter.
Tumor vekstkurver for PC-3M-luc, PC-3M-luc-SCR, PC-3M-Luc -CD44-KD og PC-3M-luc-CD147-KD xenografter vises enten med VC (plottet til venstre) eller med DTX behandlinger (plottet i midten). Forholdet mellom DTX behandlede versus VC behandlede tumorvolumer (DTX /VC) ble plottet fra begynnelsen av behandlingen til slutten av forsøket (vist i plottet til høyre) (A). På slutten av forsøkene, tumorvekt fra PC-3M-CD44-KD og PC-3M-luc-CD147-KD gruppe mus var åpenbart redusert sammenlignet med den fra PC-3M-luc og PC-3M-luc-SCR Group mus med VC og DTX behandlinger (
P
0,05) (B). Representative bilder for tumor størrelser og lymfeknutemetastaser fra ulike grupper og behandlinger blir vist (C). DTX: docetaxel; KD: slå ned; scr: egge shRNA kontroll; VC: kjøretøy kontroll. * Viser 0,01
