Abstract
Menneske kreft over-uttrykke
MDM2
, gjennom en T til G variasjon på en enkeltnukleotidpolymorfi i posisjon 309 (
MDM2
SNP309), har funksjonelt inaktivert p53 som ikke er effektivt degradert. De har også høy uttrykk for alternativt spleiset avskrift,
MDM2-C
. Alternativt skjøtes
MDM2
transkripsjoner er uttrykt i mange former for kreft hos mennesker, og når de er eksogent uttrykte de forvandle menneskeceller. Men ingen studier hittil har oppdaget endogene MDM2 protein isoformer. Studier med eksogen uttrykk for spleisevarianter som er utført med
MDM2-A Hotell og
MDM2-B
, men
MDM2-C
isoform har vært tilnærmet uutforsket. Vi adressert mobil påvirkning av eksogent uttrykt MDM2-C, og spurte om endogen MDM2-C protein var til stede i kreft hos mennesker. For å oppdage endogen MDM2-C protein, opprettet vi et menneske MDM2-C antistoff til spleise epitop av eksoner fire og ti (MDM2 C410) og validert antistoffet med
in vitro
settes full lengde MDM2 forhold til MDM2 C. Interessant, oppdaget vi at MDM2-C co-migrerer med MDM2-FL på ca 98 kDa. Bruke validert C410 antistoff, vi har oppdaget høy ekspresjon av endogent MDM2-C i humane kreftcellelinjer og humane kreft vev. I østrogen reseptor positive (ER +)
MDM2
G /G SNP309 brystkreft cellelinje, T47D, observerte vi en økning i endogen MDM2-C protein med østrogenbehandling. MDM2-C lokalisert til cellekjernen og cytoplasma. Vi har undersøkt den biologiske aktivitet av MDM2-C av eksogent å uttrykke proteinet og observert at MDM2-C ikke effektivt rettet mot p53 for nedbrytning eller redusere p53 transkripsjonen aktivitet. Eksogene uttrykk for MDM2-C i
p53
-null humane kreftceller økt koloni formasjon, noe som indikerer p53-uavhengig tumorigene egenskaper. Våre data indikerer en rolle for MDM2-C som ikke krever inhibering av p53 for økning av kreftcellevekst og overlevelse
relasjon:. Okoro DR, Arva N, Gao C, Polotskaia A, Puente C, Rosso M , et al. (2013) endogent humant MDM2-C uttrykkes sterkt i Human Kreft og fungerer som en p53-Uavhengig Vekst Activator. PLoS ONE 8 (10): e77643. doi: 10,1371 /journal.pone.0077643
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 21 november 2012; Akseptert: 12. september 2013, Publisert: 11 oktober 2013
Copyright: © 2013 Okoro et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Science Foundation (MCB- 0.744.316), et stipend fra The Breast Cancer Research Foundation, og et stipend fra Clinical translasjonell Science Center (CTSC) TR000457 av Nasjonalt Senter for Advancing Tranlsational Sciences av National Institutes Helse J. Bargonetti. Det ble også gjort mulig i en del av en infrastruktur pris til Hunter College, stipend nummer MD007599 fra National Institute on minoritetshelse og helseforskjeller, en del av National Institutes of Health (NIH). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av NIMHD eller NIH. GJØRE. ble delvis støttet av en CUNY Magnet Award og M.R. ble støttet av den MBRs-RISE Program til Hunter College 3R25-GM060665. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
onkogene aktiviteten MDM2 er forbundet med overuttrykk av MDM2 protein i humane kreftformer [1-3]. Mens noen MDM2 isoformer kan danne en direkte fysisk forbindelse med p53 andre ikke [3,4]. MDM2 regulerer p53 protein gjennom proteasomal-mediert degradering [5-10] og transkripsjonen undertrykkelse [5,11-14]. Dette p53-mediert onkogene aktiviteten til MDM2 er best betegnes som MDM2 kanoniske funksjoner. Imidlertid er MDM2 også kjent for å ha p53-uavhengig funksjon [15-19] som er best betegnes som MDM2 ikke-kanoniske funksjoner.
Den over-uttrykk for MDM2 grunn av en enkeltnukleotidpolymorfi av tymin til guanin (T til G) i posisjon 309 til
MDM2
genet (
MDM2
SNP309) er assosiert med økt kreftforekomst og aggressivitet [20-23]. Dette
MDM2
SNP309 nucleotide Endringer øker bindende affinitet for det konstituerende transkripsjonsfaktor, Sp1 [21]. Celler homozygote for G /G
MDM2
SNP309 har forbedret
MDM2
transkripsjon og høy MDM2 proteinnivåer. MDM2 over-uttrykk i kreft er ofte ledsaget med over-uttrykk for alternativt spleisede
MDM2
transkripsjoner [3,24-28]. Over 40 alternativt og abnormt skjøtes menneskelig
MDM2
transkripsjoner har blitt rapportert, men ikke alle er bein fide resultatet av alternativ spleising hendelser [29]. Ikke motstå,
MDM2
spleisevarianter representerer potensielle mangfoldet som er enig med resultatene av Encyclopedia of DNA Elements (KODE) Prosjekt Consortium. KODE fremhever tidligere ikke kandidat regulatoriske elementer og kodede meldinger i det menneskelige genom [30]. Mangfoldet av
MDM2
skjøtes meldinger kodet fra to uavhengige arrangører har kapasitet til å øke den menneskelige kreft proteomet [31]. Det er derfor ikke overraskende at
MDM2
SNP309 celler demonstrere økt mangfold i sine alternativt spleisede
MDM2
utskrifter med betydelig uttrykk for
MDM2-C
transkripsjon [32].
Selv om over 40
MDM2
alternativt skjøtes transkripsjoner har blitt identifisert [29], bare fem, (
MDM2-A
gjennom
MDM2-E
) har vist seg å uttrykke protein
in vitro product: [3]. Uttrykket av disse fem
MDM2
transkripsjoner fører NIH3T3 celler til å danne tumor-assosiert foci [3]. Men bare to protein isoformer, MDM2-A og B, har blitt grundig studert for deres biologiske funksjoner. Den eksogene uttrykk for MDM2-A [33,34], eller MDM2-B i mus [35], øker svulstdannelse i et
p53
-null, eller p53-kompromittert bakgrunn forårsaker en endret svulst spektrum. Men fortsatt ubestemt biologiske funksjon MDM2-C.
Vi spurte om kreftceller som uttrykker høye nivåer av
MDM2-C
mRNA uttrykkes endogen MDM2-C protein. Vi antok at høye
MDM2-C
transkripsjonsnivåer kodet fra G-allelet
MDM2
SNP309 i humane kreftformer vil føre til høye nivåer av endogen MDM2-C protein og ville gi onkogene funksjoner. Celler med MDM2 over-uttrykk via G /G
MDM2
SNP309 ha stabil p53 protein, som er samlokalisert med p53 på kromatin [14]. Dermed hypotese vi at MDM2 over-uttrykk via G /G SNP309 kan produsere en MDM2-C protein isoform som ikke ville bli dårligere p53. Derfor setter vi ut for å bestemme den cellulære funksjon av eksogent uttrykt MDM2-C. Vi spurte også om kreftceller som uttrykker høye nivåer av
MDM2-C
mRNA, også uttrykt endogen MDM2-C protein.
Endogen ekspresjon av MDM2-C-protein har det aldri blitt detektert på grunn av fraværet av antistoffer som spesifikt gjenkjenner de MDM2 isoformer fremstilt fra alternativt spleisede mRNA.
MDM2-C
transkripsjon ikke inneholder exon 5 til 9, som koder for en del av det p53-bindende domene. Vi har skapt et spesifikt antistoff utviklet for å detektere de aminosyrene som kodes av MDM2-C-flankerende eksonene 4 og 10, som vi har kalt C410. Ved hjelp av denne MDM2 antistoff vi observert høye basale nivåer av endogen MDM2-C protein i ulike MDM2 over-uttrykker kreft cellelinjer og vev. Vi observerte også at, i nærvær eller fravær av p53, eksogent uttrykt MDM2-C fremmer økt kolonidannelse. Tatt sammen, våre resultater indikerer at endogent MDM2-C er uttrykt i kreftformer og at MDM2-C-funksjoner uavhengig av p53 for å fremme tumorgenese.
Resultater
MDM2 over-uttrykke celler har høye nivåer av MDM2-C transkripsjoner
Mange menneskelige kreftcellelinjer over-express MDM2 protein og har blitt brukt i tidligere MDM2 studier [14,21,32,36,37]. Vi brukte disse cellelinjene for å undersøke forholdet mellom
MDM2-C
transkripsjoner til full-lengde
MDM2
transkripsjoner. Cellelinjene undersøkt inkluderer to høye MDM2 uttrykkere: SJSA-1 celler med vill-type
p53 Hotell og over-uttrykk for MDM2 grunn til
MDM2
genamplifikasjon (og
MDM2
SNP309 T /T alleler) og Manca celler med vill-type
p53 Hotell og over-uttrykk for MDM2 fra
MDM2
SNP309 G /G alleler. De har også to lave MDM2 uttrykkere: den K562 cellelinje som er
p53
-null og har en
MDM2
SNP309 T /G alleler og ML-1 celler med vill-type p53 og
MDM2
SNP309 T /T alleler.
transkripsjon av
MDM2-C
ble bestemt ved kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) og northern blot-analyse (se figur 1 og figur S1). Kvantifisering av total
MDM2
karakterutskrifter, ved Northern blot analyse, viste det høyeste nivået av
MDM2
transkripsjoner i SJSA-1 celler, som inneholder 25 eksemplarer av
MDM2
genet [37]. Et høyt nivå av
MDM2
transkripsjon ble også observert i Manca celler. Å spesielt kvantifisere transkripsjoner inneholder eksoner 6 og 7, vi utført QRT-PCR med en kvantitativ sonde til ekson 6-7 krysset (figur 1B se sonde i grønne og figur 1C svarte striper). Å spesielt kvantifisere
MDM2-C
transkripsjoner, brukte vi et framtids PCR-primer laget for å gjenkjenne exon 4, og ekson 10, krysset (kalt 04:10) og en omvendt primer til ekson 12 (figur 1B, se primere i rødt, og figur 1C grå søyler). I Manca celler, vi har oppdaget lavt nivå uttrykk for
MDM2
transkripsjon inneholder eksoner 6 og 7, herfra videre referert til som en
MDM2
full lengde transkripsjon (figur 1C). Viktigere, Manca cellene hadde høy grad uttrykk for
MDM2-C
transkripsjon resulterer i en lavere ratio av full-lengde til
MDM2-C
transkripsjon (figur 1C, MANCA sammenligne svart til grå bar). Dette var i motsetning til
MDM2
transkripsjon i SJSA-1 celler, som produserte tilsvarende nivåer av
MDM2-C Hotell og
MDM2
full-lengde transkripsjoner (figur 1C, SJSA -1 sammenligne svart til grå søyler). Lave nivåer av
MDM2
transkripter ble produsert i K562-celler, og derfor disse cellene ble anvendt som den normalisercellelinje. ML-1 celler viste lignende
MDM2
transkripsjonsnivåer til K562. Dette indikerte at over-uttrykk for MDM2 protein i SJSA-1 celler og Manca celler korrelerte med høye nivåer av
MDM2-C
transkripsjon. Videre Manca cellene hadde den høyeste forholdet mellom
MDM2-C
til full-lengde transkripsjon. Dette resultatet kan være på grunn av
MDM2
SNP309 G /G genotype som driver transkripsjon fra induserbar P2 promoter
.
A. Kvantifisering ved hjelp av Image J etter nord blot analyse av RNA fra ubehandlede MANCA, SJSA-1, ML-1 og K562 celleprøver. En
MDM2
DNA-probe til ekson 12 ble PCR generert og radiomerket med α
32P dCTP. Transkripsjonsnivåer ble sammenlignet med K562 for basal uttrykk og normalisert for RNA-nivåer til
GAPDH
. Et gjennomsnitt av fire uavhengige eksperimenter er vist. Feilfelt indikere standard feil.
B. Skjematisk av
MDM2
meldinger oppdages ved hjelp av en Taqman sonde for eksoner 6 og 7 (6-7 probe) eller forover primer for 4:10 og revers primer for 12 (4: 10-12 primer) for
MDM2-C
.
C. QRT-PCR med 04:10 forover og ekson 12 omvendt vs. Taqman sonden til ekson 6 og 7 av
MDM2
ble utført for å påvise
MDM2-C Hotell og
MDM2
(med eksoner 6 og 7) transkripsjoner.
MDM2-C
transkripsjoner ble oppdaget via Syber Grønn og
MDM2 plakater (med eksoner 6 og 7) transkripsjoner ble oppdaget via Taqman teknologi. Transkripsjonsnivåer ble sammenlignet med K562 for basal uttrykk og normalisert for RNA-nivåer til
GAPDH
. Et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter er vist. Feilfelt indikere standard feil.
D. QRT-PCR av RNA ved hjelp av Taqman teknologi fra p53 målgener,
p21 Hotell og
puma
etter DNA-skader behandling med 8 pm etoposid i 3 timer. Data fra hver cellelinje er presentert som normalisert til sin egen ubehandlet kontrollprøve for fold aktivering og normalisert for RNA-nivåer til
GAPDH
. Et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter er vist. Feilfelt indikere standard feil.
For å se om
MDM2
full lengde for å
MDM2-C
transkripsjon forholdet påvirket p53 respons, vi sammenlignet aktivering av to p53 målgener,
p21 Hotell og
puma
. Vi behandlet K562, ML-en, SJSA-1 og Manca celler med etoposid å sette i gang en DNA-skade respons, og overvåkes
p21 Hotell og
puma
aktivering av QRT-PCR (figur 1D). Som forventet,
p21 Hotell og
puma
gener ble ikke aktivert i
p53
-null K562 celler. I SJSA-en og Manca celler, som har villtype p53 og høy MDM2,
p21 Hotell og
puma
gener demonstrert kompromittert genaktivering i forhold til aktivering påvist i ML-1 celler med Manca celler demonstrere minst p53 aktivitet (figur 1D).
MDM2
alternativt spleiset produkter som
MDM2-B
øke etter DNA-skade [38-40]. For å avgjøre om
MDM2-C
transkripsjon ble indusert av p53 ble cellene behandlet med etoposid analysert ved QRT-PCR for
MDM2-C
. De ML-1 celler svart på etoposid behandling med en robust vekst i
MDM2-C
transkripsjonsnivåer (figur S2, rød søyle). Kompromittert p53-mediert aktivering av
MDM2-C
ble observert i SJSA-en og Manca celler som ligner på kompromittert aktivering observert for
puma plakater (Figur S2 og figur 1D). Disse data viser at p53 transkripsjonen aktivitet ble svekket i den MDM2 over-uttrykkende celler, og deres høye basalnivåer av
MDM2-C plakater (spesielt i Manca-celler) ble p53-uavhengig.
Validering av MDM2-C spesifikke antistoffer
For å finne ut om det høye nivået av
MDM2-C
transkripsjoner i MDM2 over-uttrykke celler ble oversatt til protein, vi generert en MDM2-C spesifikke polyklonale antistoff. Vi immunisert kaniner med en peptidsekvens inneholdende aminosyresekvensen av det humane ekson 4 til 10 spleisegrensen (figur 2A). Peptid var svært immunogen og antistoffet ble validert for spesifisitet ved hjelp av
in vitro
oversatt MDM2 proteiner i hvete bakterie ekstrakt. Både MDM2-C, og MDM2-FL, kan oversettes
in vitro
til protein [3,41]. Tillegg av
35S metionin inn i systemet gjorde oss i stand til å raskt oppdage spesielt merkede MDM2 proteiner ved hjelp av autoradiografi (figur 2B). Den
35S metionin merket MDM2-C og MDM2-FL proteiner migrert på SDS-PAGE på størrelser tidligere fastsatte (beskrevet som høyere enn den anslåtte størrelsen på 36 kDa og 55 kDa, respektivt) [41,42]. Den langsommere mobilitet av MDM2 på SDS-PAGE har tidligere vært tilskrevet den store sure domenet av proteinet [42].
A. Skjematisk av full lengde MDM2 (MDM2-FL) og MDM2-C. Tilbakeholdt proteiner «biokjemiske funksjonelle domener vises som fargekoder. Peptidsekvensen brukt som et immunogen inneholdende den spleisegrensen av humant MDM2-C er vist. Glycin (G) og cystein (C) residier ble tilsatt til den N-terminale ende av peptidet for å lette konjugering til et immunoreaktivt protein, keyhole limpet hemocyanin (KLH).
B.
35S metionin ble brukt som en radioaktivitet kilde til å merke
i
vitro
oversatt proteiner.
I
vitro
oversettelser av pcDNA3-MDM2-FL og pcDNA3-P2mdm2-C med TNT kombinert hvetekim ekstrakt system. Resulterer MDM2-FL og MDM2-C protein ble elektroforese på a10% SDS-PAGE i en 5: 1: 1-forhold. Gelen ble overført til en nitrocellulosemembran og eksponert til film for betydelig MDM2-C-proteinprodukt deteksjon. Hvetekim lysat uten DNA ble brukt som en negativ kontroll.
C. Immunpresipitasjon av
35S metionin radioaktivt-merket
i
vitro
oversatt MDM2-FL og MDM2-C-proteiner ved hjelp MDM2 C410 og pre-immune polyklonale antistoffer. Protein forholdstall som vist i B ble brukt i trekke ned analysen. Prøvene ble underkastet elektroforese på en 10% SDS-PAGE-gel overført til en nitrocellulosemembran og eksponert til film for proteindeteksjon. Dette er representativt for tre uavhengige eksperimenter.
D.
I
vitro
oversatt protein laget i kaninretikulocytlysatsystemet (RRL baner 1 og 2) ble sammenlignet med protein settes i hvetekim ekstrakt (WGE baner 3 og 4). Disse proteinene ble oppdaget med enten antistoff 4B11 (øverst panel) eller 2A9 (nederst panel). HRP-konjugert anti-mus og anti-kanin ble brukt som sekundære antistoffer.
For ytterligere å validere spesifisitet av MDM2-C antistoff, gjennomførte vi en immunoprecipitation eksperiment av hvete bakterie ekstrakt
in vitro
oversatte
35S radiomerkede MDM2-C og MDM2-FL protein produkter. Den MDM2 C410 polyklonale antistoff trukket ned MDM2-C (figur 2C, sammenlign spor 3 og 8), men ikke MDM2-FL (figur 2C, sammenlign spor 4 og 9). Videre MDM2-C og MDM2-FL
in vitro
oversatte proteiner ble immunopresipitert med MDM2 C410 polyklonale antistoff og analysert ved western blot med MDM2 monoklonalt antistoff mix. Bare MDM2-C protein er registrert (Figur S3, sammenlign spor 2 og 3).
For å kunne mer grundig løse differensial migrering av MDM2-C og MDM2-FL, vi sammenlignet immuno-reaktivitet av
in vitro
oversatt proteiner laget i både kanin retikulocyttlysat (RRL) og hvetekim ekstrakt (WGE) systemer. Når proteinene er omregnet
in vitro
, er de post-translasjonelt modifiseres av de faktorer som er representert i celleekstrakt system. Som forutsagt, den C-terminale monoklonalt antistoff 4B11 detektert MDM2-C og MDM2-FL isoformer, mens antistoff 2A9, rettet mot den sentrale regionen, detekteres bare MDM2-FL (figur 2D, sammenligne topp- og bunnfeltene for felt 1 og 3 versus baner 2 og 4). Interessant, MDM2-C produseres i pattedyr RRL systemet resulterte i høy uttrykk for tre forskjellig trekkende arter på SDS-PAGE elektroforese med en form co-migrerer med MDM2-FL på ca 98 kDa (figur 2D, sammenlign spor 1 til lane 2 ). Vi har videre undersøkt de mulige post-translasjonelle modifikasjoner av MDM2-C i humane celler (og migrering av MDM2-C ved ca. 98 kDa) ved å benytte en HeLa
in vitro-translasjonssystem
fra Pierce (figur 3A og 3B ). Viktigere, i dette systemet, vi også oppdaget en form for MDM2-C på omtrent 98 kDa. Våre data indikerer klart at noen av de MDM2-C protein isoform produsert i denne menneskelige systemet co-migrerer med MDM2-FL. Således tilveiebringe bevis for at påvisning av MDM2 av antistoffer som kan samvirke med den full-lengde og spleisede isoformer variant vil resultere i i det minste noen ko-migrerer polypeptider på et western blot. Interessant, ved hjelp av HeLa-systemet, vi for første gang oppdaget at noen MDM2-C-protein ved den forutsagte molekylvekt på 36 kDa (figur 3B kolonne 1).
Immunpresipitasjon hjelp MDM2 C410 og pre-immune polyklonale antistoffer med HeLa
i
vitro
oversatt MDM2-C ekstrakter bruke forhåndsimmunsera, MDM2 C410 og N-20 polyklonale antistoffer. Prøvene ble underkastet elektroforese på en 10% SDS-PAGE-gel i duplikat. A. Den ene halvdelen ble farget med Coomassieblå for protein deteksjon. B. Prøver fra halvparten av gel ble overført til nitrocellulosemembran og MDM2 ble oppdaget med 4B11 monoklonalt antistoff. HRP-konjugert anti-mus ble anvendt som sekundært antistoff. Piler skildre MDM2-C protein.
MDM2-C protein uttrykkes endogent
Mens alternativt spleiset
MDM2
meldinger har blitt påvist i kreft, er det ingen dokumentasjon på endogent produserte polypeptider fra slike meldinger . Vi sammenlignet ko-migrerer natur av MDM2-C og MDM2-FL ved hjelp av den variable immunreaktiviteten av humane kreftcelleekstrakter probet med MDM2 C410 polyklonalt antistoff (for deteksjon av MDM2-C) til de samme ekstraktene probet med MDM2 pan-reaktivt mus monoklonale 4B11 antistoff (for påvisning av MDM2-C og MDM2-FL). Høye nivåer av MDM2 ekspresjon ble observert i MANCA og SJSA-1-celleekstrakter med 4B11 antistoff (figur 4A, sporene 9 og 10). Manca celler produseres det høyeste uttrykk for MDM2-C når oppdages med C410 (figur 4A, spor 1). Den MDM2 C410 polyklonalt antistoff knapt påvises MDM2-C i ML-1-celler (figur 4A, spor 3). Imidlertid erkjennes det MDM2-C-protein i celleekstrakter fra K562-celler, som er g /t genotype-celler, så vel som i SJSA-1-celler som har et gen forsterkning (figur 4A, sporene 2 og 4). Uttrykket av MDM2-C i ML-1 celler og Manca celler korrelert med basal transkripsjon av
MDM2
full lengde og
MDM2-C
(sammenlign figur 1C figur 4A). Av grunner som forblir uklart, en bestemt sammenheng mellom
MDM2
utskrifter og MDM2 protein isoformene var ikke synlig for SJSA-1 celler og K562 celler. Dette kan ha vært grunnet forholdet mellom MDM2-protein FL til den spleisede varianten, og påfølgende E3 ubiquitin ligase-mediert nedbrytning av proteiner som MDM2 redusert proteinstabilitet.
A. Western blot-analyse av hele celle-ekstrakter fra: MANCA, SJSA-1, ML-1 og K562-celler. MDM2-C protein nivåer ble analysert via MDM2 C410 polyklonale antistoffer (C410, baner 1-4) og total MDM2 ble oppdaget med det monoklonale 4B11 (sporene 9-12 og lang eksponering for lane 12). Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Pre immun polyklonale serum ble anvendt som en negativ kontroll. HRP-konjugert anti-mus og anti-kanin ble brukt som sekundære antistoffer. Dette er representativt for tre uavhengige eksperimenter.
Bi. Manca cellene ble lysert enten som hele celleekstrakter (WCE) eller inn i mobilnettet compartments- cytosolic (CYTO) og Chromatin (CHR). Proteiner ble påvist som i A. MDM2-C protein nivåer ble analysert via MDM2 C410 polyklonale antistoffer (C410, baner 1-3) og total MDM2 ble oppdaget med det monoklonale 4B11 (baner 1-9 og lang eksponering for lane 9).
Bii. Tubulin og Fibrillarin ble brukt til å vise effektiv cellulær fraksjonering av ekstraktet.
C. Spinning disk konfokalmikroskopi av Manca celler. Celler ble fikset, permeabilized og inkubert med p53, MDM2 C410 og pre-immune polyklonale antistoffer. Glassene ble inkubert med sekundær Alexa-konjugert geite-anti-kanin og FITC-konjugert geite-anti-mus. DAPI ble anvendt for å farge cellekjerner. Bildene ble tatt på 60X forstørrelse. Pilene viser områder av MDM2-C protein kjernefysiske lokalisering.
Den høye uttrykk for MDM2-C i Manca celler antydet at protein vil være klart påvises i cellekamre. Vi undersøkte lokalisering av endogene MDM2-C ved hjelp av cellefraksjoneringsmetoder (figur 4B) og spinne disk konfokalmikroskopi (Figur 4C). Ved hjelp av kromatin fraksjoneringsmetoder, vi har oppdaget MDM2-C i cytoplasma og på den kromatin (fig. 4Bi, sporene 1-3) og de fleste av MDM2 isoformer detektert med 4B11 var i cytoplasma (fig. 4Bi, baner 7-9 ). Eksogent uttrykt MDM2-A og MDM2-B-isoformer har tidligere blitt vist å oppvise nukleære lokaliserings [43] til tross for det faktum at områdene som koder for de MDM2 nukleær lokalisering og eksport signaler er spleiset ut. Tilsvarende MDM2-C, som også har disse regionene spleiset ut, lokalisert til cytoplasma og cellekjernen av disse hematopoetiske celler (sammenlign DAPI og antistoff farget område i fig. 4CI-iii probet med C410 og Fig 4Cvi-viii probet med pre-immun kaninserum). Manca-celler uttrykker høye nivåer av vill-type p53-protein [14], og vi har observert noen ko-lokalisering av p53 og MDM2-C-proteinene i cytoplasma og cellekjernen som indikert ved fletting gul farge (fig. 4CV). Mens betydningen av samlokalisering ikke umiddelbart forstått, mener vi at det er en viktig observasjon. De røde pilene peker mot sterk antistoff flekker som representerer en konsistent observasjon av protein lokalisert til diskrete atom områder (fig. 4Ciii og 4CV). Siden Manca hematopoetiske celler er små og har ikke mye cytoplasma, var det mulig at det syntes cytoplasmiske var på periferien av kjernen. Derfor undersøkte vi MDM2-C lokalisering i brystkreft epitelceller og også observert kjernekraft og cytoplasma MDM2-C lokalisering (figur 5C).
A. MCF-7 og T47D-celler ble dyrket og behandlet med 10 nM østrogen (E2) i fem dager. Cellene ble lysert og proteiner ble analysert via western blot. MDM2 C410 polyklonalt serum-anti-kanin-antistoff ble brukt for proteindeteksjon. Pre-immun polyklonalt serum ble anvendt for å detektere bakgrunnssignal. HRP-konjugert anti-mus og anti-kanin ble brukt som sekundære antistoffer. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. Dette er representativt for tre uavhengige eksperimenter.
Bi. MCF-7 og T47D-celler ble lysert for helcelle eller kromatin fraksjonerings ekstrakter. 50 ug av prøver ble løst ved anvendelse av 10% SDS-PAGE og MDM2 C410 polyklonalt sera (søyle 1 – 6) og MDM2 monoklonalt antistoff, 4B11 (kolonnene 13 – 18) ble brukt for proteindeteksjon. Pre immun ble anvendt for å detektere bakgrunnssignal (kolonnene 7 – 12). Sekundære antistoffer som ble brukt var samme som i A.
Bii. Tubulin og Fibrillarin ble anvendt for å bestemme fraksjone renhet.
C. Spinning disk mikroskopi av MCF-7 og T47D-celler. Celler ble dyrket på dekkglass og behandlet med 10 nM E2 i fem dager. Celler ble fiksert og inkubert med p53-antistoff og MDM2 C410 polyklonalt antistoff for proteindeteksjon. Pre-immunserum ble anvendt som en negativ kontroll for farging. Glassene ble inkubert med sekundær Alexa-konjugert geite-anti-kanin og FITC-konjugert geite-anti-mus. DAPI ble brukt til å farge kjerner. Celler ble visualisert ved 60x forstørrelse. Piler skildre MDM2-C lokalisering regioner.
MDM2-C øker med østrogenbehandling og lokaliserer til distinkt punktat foci i cytoplasma og kjernen av ER + brystkreft celler
MDM2 er hevet etter østrogenbehandling av østrogen reseptor positiv (ER + ) brystkreftceller [36]. Videre
MDM2
knockdown i østrogen behandlede brystcancerceller resulterer i en reduksjon i proliferasjon, og dermed gi bevis på viktigheten av MDM2 i brystkreftcellevekst. Den over-uttrykk for MDM2 er assosiert med økt
MDM2
skjøtes varianten transkripsjoner [3,24-28]. Derfor undersøkte vi uttrykket av MDM2-C protein i to ER + brystkreftcellelinjer, MCF-7 og T47D, inneha ulike genotyper for
MDM2
SNP30
ni product: (T /G versus G /G henholdsvis) og
p53 product: (vill-type mutant versus henholdsvis). Vi observerte en svak økning i MDM2-C-protein etter østrogen behandling av MCF-7 og T47D-celler (figur 5A sporene 2 og 4). Årsaken til forskjellen i molekylvekten av MDM2-C-isoformer kan være på grunn av forskjeller i post-translasjonelle modifikasjoner i helcellelysater. Den pre Immun polyklonalt antistoff serum ble brukt som en bakgrunnskontroll for den MDM2 C410-antistoff og resulterte i praktisk talt ingen protein deteksjon (figur 5A banene 5-8). I tillegg, i T47D celler,
MDM2-C
meldingen ble økt to ganger etter østrogenbehandling (data ikke vist). Vi fraksjonert cellene og undersøkt cytoplasmatiske og kromatin fraksjoner for MDM2-C protein (Fig. 5Bi for C410, kanin pre immun og monoklonalt 4B11 reaktivitet og Fig. 5Bii for markører brøkdel renhet). Den cytoplasmiske fraksjonen inneholdt ikke kromatin som fremgår ved fravær av fibrillarin farging og hver fraksjon viste noen MDM2-C-reaktivt protein (fig. 5Bi baner 2 og 5). Interessant, kromatinet fraksjon fra MCF-7 celler viste en sterk MDM2-C reaktive arter og mindre 4B11 reaktivt protein (Fig. 5Bi, sammenlign spor 3 og 15).
For å finne ut om østrogenbehandling påvirket lokalisering av MDM2-C i MCF-7 og T47D celler, gjennomførte vi immunoflouresence. Den MDM2-C i MCF-7 ble påvist i et mønster av diffus og punktformet cytoplasmisk og nukleære lokaliserings før og etter østrogenbehandling (fig. 5Cii og 5Cvii). Til tross for svært lite påvises p53 i MCF-7 celler (fig. 5Civ og 5Cix), den cytoplasmatiske p53 syntes å co-lokalisere med MDM2-C, som co-farging ble oppdaget som en gul merge signal (fig. 5Cv og 5Cx ).
visualisering av MDM2-C av immunoflouresence i T47D celler, før og etter østrogenbehandling, vises lignende flekker på MCF-7 celler (Fig. 5Cxii og 5Cxvii). Imidlertid gjorde T47D-celler ikke demonstrere ko-lokalisering av mutant p53 og MDM2-C (fig. 5Cxv og 5Cxx). Årsaken til denne forskjellen i co-lokalisering for MCF-7 celler og T47D-celler kan ligge i det faktum at disse cellelinjene har villtype versus mutante p53-proteinene henholdsvis. Mange eksogent uttrykt MDM2 spleisede isoformer ikke interagere med p53 [43,44] og er kjent for å spleise ut det meste av p53-bindende domene [29]. Vi har observert at T47D-celler uttrykt overveiende atom mutant p53 (fig. 5Cxiv og 5Cxix) mens MCF-7-celler uttrykker lave nivåer av cytoplasmisk og atomvilltype p53 [45].
MDM2-C er sterkt uttrykt i liposarkom og brystkreft vev
Høy MDM2 uttrykk er ofte observert i liposarcomas og brukes i dag som en kreft diagnostisk biomarkør [46-49]. Vi var interessert i å undersøke om C410 antistoff ville være nyttig å undersøke MDM2-C som liposarkom biomarkør i pasientprøver. Vi brukte immunhistokjemi (IHC) for å teste for MDM2-C uttrykk i menneskelig liposarkom vev fra menneskelige pasientprøver. For to av tre prøvesett analysert, ble positiv farging for MDM2-C observert (representant bilde vist i figur 6A). Den pre immunserum oppdaget lav bakgrunnsfarging og når vi undersøkt Lipoma vev, ble bare svakt positive MDM2-C flekker oppdaget. Vi har begynt lignende studier med brystkreft vev mikro-matriser og har oppdaget MDM2-C i invasive duktale karsinomer (Figur 6b). Ved hjelp av immunhistokjemi, observerte vi en tilsvarende fargemønster av positive vev med MDM2 C410 og MDM2 4B11 antistoff (Fig. 6Bii og 6Bii) mens mus IgG ikke resulterte i vev flekker (Fig. 6Biii).
A. Immunhistokjemi av Lipoma og liposarkom vev ved hjelp MDM2 C410 og pre-immune polyklonale antistoffer. Biotinylated sekundært antistoff, ABC Reagens og DAB fra Vector Labs ble brukt. Bildene ble oppnådd ved 20X og 40x forstørrelse. H E refererer til Hematoxylin og eosin kontra.
A. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
