Abstract
Bakgrunn
Nyere studier har vektlagt årsaks koblinger mellom microRNAs (mirnas) deregulering og tumorutvikling. I leverkreft (HCC), ble flere og flere mirnas identifisert som diagnostiske og prognostiske kreft biomarkører, samt ytterligere terapeutiske verktøy. Denne studien hadde som mål å undersøke den funksjonelle betydning og reguleringsmekanisme av MIR-199a2 /214 klyngen i HCC progresjon.
Metoder og funn
I denne studien, viste vi at MIR-214, som samt MIR-199A-3p og MIR-199A-5p nivåene ble betydelig redusert i de fleste undersøkte 23 HCC vev og HepG2 og SMMC-7721 cellelinjer, sammenlignet med sine nontumor kolleger. For ytterligere å undersøke rollen til mir-214 i hepatocarcinogenesis, beskrevet vi at ER stress-indusert pro-overlevelsesfaktor XBP-1 er et mål for MIR-214 ved hjelp av western blot-analyse og luciferase reporter-analyse. Re-uttrykk for MIR-214 i HCC cellelinjer (HepG2 og SMMC-7721) hemmet spredning og apoptose. Videre ektopisk ekspresjon av MIR-214 dramatisk undertrykt evne HCC celler til å danne kolonier i in vitro og for å utvikle tumorer i et subkutant xenotransplantasjon modell av BALB /c atymiske nakne mus. Videre gjeninnføring av XBP-1s dempes MIR-214-mediert hemming av HCC celler spredning, koloni og tumordannelse. For ytterligere å forstå mekanismen av MIR-199A /214 klynge ned-uttrykk i HCC, fant vi at thapsigargin (TG) og tunicamycin (TM) eller hypoksi-indusert utfoldet protein respons (UPR) undertrykker uttrykk for MIR-199A /214 klyngen i HCC celler. Ved promoter analyse av MIR-199a2 /214 genet, antatt vi NFkB som en potensiell negativ regulator. Vi videre funnet at UPR og LPS-indusert NFkB aktivering trykt MIR-199a2 /214 transkripsjon, og dette undertrykkelse ble reversert av NFkB hemming i HCC celler.
Konklusjoner
Vår studie tyder på at modulering av MIR-214 nivåer kan gi en ny terapeutisk tilnærming for kreftbehandling og avslørte at UPR kan tilby en ny forklaring på hvorfor MIR-199A /214 klynge ble nedregulert i progresjonen i HCC
Citation. Duan Q, Wang X, Gong W, Ni L, Chen C, Han X, et al. (2012) ER Stress Negativt modulerer Uttrykk for Mir-199A /214 Cluster til Regulerer Tumor Overlevelse og Progresjon i Human Hepatocellulær Cancer. PLoS ONE 7 (2): e31518. doi: 10,1371 /journal.pone.0031518
Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 16 september 2011; Akseptert: 9. januar 2012; Publisert: 16 februar 2012
Copyright: © 2012 Duan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No. 30930039, 81000097 og 30770882), og National Basic Research Program of China (973 Program No. 2007CB512004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mirnas er en ny klasse av endogen, ikke-kodende RNA 19-25 nukleotider lange som medierer undertrykkelse av mål-transkripter ved å binde seg til komplementære frø sekvenser ved 3′-utranslaterte regioner (UTR) av mål-mRNA [1 ]. Siden første observasjon, har mer enn 1400 mennesker mirnas blitt registrert i miRBase (v.17.0). Tidligere studier antydet dysexpression av mirnas har blitt observert i forskjellige typer av kreft og er også forbundet med det kliniske resultatet av kreftpasienter [2]. Videre til evnene til mirnas oppnå samtidig finjustering av mange forskjellige mål gener som gjør dem grunnleggende regulatorer av cellesignalisering og impliserer dem i tumorprogresjon [3], [4]. Men deres spesifikke roller og funksjoner i de store kreftformer og ondartet progresjon av kreft har ennå ikke helt klarlagt.
leverkreft (HCC) er en av de vanligste kreftformene i verden og blant de viktigste årsakene til kreft dødsfall i Asia, spesielt i Kina [5]. Flere mirnas, slik som MIR-101 [6], MIR-122 [7], [8], [9] MIR-373 [10], MIR-221/222 [11], [12], [13], MIR-195 [14], MIR-30d [15], MIR-125b [16], MIR-18a [17], MIR-139 [18], MIR-223 [19] og Mir-29 [20], har allerede blitt rapportert å regulere HCC tumorprogresjon og metastase ved å regulere viktige gener som Mcl-en, ADAM17, YAP, DDIT4, cyclin D1, CDK6, E2F3, Galphai2, LIN28B, østrogen reseptor-α, Rho-kinase 2, Stathmin 1 og Bcl-2 og så videre. Imidlertid kan de eksisterende data ikke fullt ut forklare kompleksiteten av HCC.
Nylig ble MIR-199A-3p /5p verifisert til å bli redusert i HCC vev, og dens dekrement korrelerte signifikant med overlevelse av HCC pasienter, som skisserte en mulig markør for å forutsi prognosen for HCC pasienter [5], [21], [22]. Det er velkjent at det er to gener som potensielt koder for pri-MIR-199A, den primære forløper av HSA-mir-199A. Den første genet er MIR199a1 på kromosom 19 (NCBI GeneID 406 976) og den andre er MIR199a2 på kromosom 1 (NCBI GeneID 406977) [23]. Interessant, ved 3′-enden av pri-MIR-199a2 transkripsjon, er det forløperen sekvensen for en annen miRNA par HSA-mir-214 og HSA-mir-214 * [24]. MIR-199a2 og MIR-214 har blitt rapportert å bli produsert fra en enkelt intron-mindre karakter dynamin 3 motsatt (Dnm3os) som er innebygd i den motsatte tråd i et intron av dynamin i mus og human [23], [24] . Videre er miPPR-199a2 region vises her til å være autentisk MIR-199a2 promoter som produserer den primære transkripsjon husing Mir-199A-3p, MIR-199A-5p og MIR-214 sekvenser som en klynge [25]. Flere og flere studier dokumentert at MIR-214 er involvert i menneskelig eggstokkreft, livmorhalskreft og føflekkreft tumorprogresjon [26], [27], [28], [29]. Imidlertid er dagens kunnskap om Mir-214 uttrykk og funksjon i HCC fortsatt ganske uklart. I tillegg mekanismene bak MIR-199a2 /214 deregulering i HCC er ennå ikke klart.
I denne studien, viste vi at Mir-199A-3p, MIR-199A-5p og Mir-214 uttrykk var betydelig redusert i HCC vev. XBP-1 ble vist å være et direkte mål for MIR-214 ved interaksjon med det 3′-UTR. Videre ble det undertrykkende effekt av MIR-214 i HCC tumordannelse og vekst studert
in vitro Hotell og
in vivo
, og gjeninnføring av XBP-1s svekkede MIR-214-mediert undertrykkelse. Vi videre identifisert som NFkB aktiveres av utfoldet protein respons (UPR) undertrykker MIR-199a2 /214 transkripsjon, og vist at aktivering av UPR og endoplasmatiske retikulum (ER) stresset representerer en viktig mekanisme ansvarlig for MIR-214 og MIR-199A-3p /5p nedregulering i HCC utvikling.
Resultater
MIR-199A /214 er nedregulert i HCC cellelinjer og vev
for å studere rollen til MIR-199A /214 klyngen i HCC, var nivået på MIR-214 og MIR-199A-3p /5p bestemt i 23 par HCC og tilstøtende godartede vev ved hjelp av real-time PCR. Resultatene viste at disse mirnas var signifikant nedregulert og MIR-199A-3p MIR-199A-5p MIR-214 sammenlignet med tilstøtende nontumorous leveren vev. Redusert MIR-214 uttrykk ble observert i 65% av HCC (15 av 23 tilfeller), og konsekvent nedregulering av både MIR-199A-3p og MIR-199A-5p også ble påvist i så mye som 73% av HCC (17 av 23 tilfeller) (figur 1A og B). Parallelt i HCC cellelinjer HepG2 og SMMC-7721, MIR-199A-3p /5p og Mir-214 uttrykk ble markert redusert sammenlignet med det i humant normalt lever (figur 1C).
(A) Box plotte grafiske skjermer av 23 HCC og matchet tilstøtende godartede vev gruppert etter MIR-199A-3p og MIR-199A-5p uttrykk. (B) boksplott grafiske skjermer av 23 HCC og matchet tilstøtende godartede vev gruppert etter Mir-214 uttrykk. (C) MIR-199A /b-3p og Mir-214 uttrykk i menneskelig normal leveren, HepG2, og SMMC-7721 HCC cellelinjer ble oppdaget ved hjelp av real-time QRT-PCR. Kolonner, mener tre uavhengige eksperimenter; barer, SD; * P. 0,05 vs kontroll
MIR-214 direkte rettet mot XBP-en ved interaksjon med 3′-UTR
Identifikasjon av miRNA-regulerte genet målene er et nødvendig skritt for å forstå miRNA funksjoner. Selv MIR-199A-3p og MIR-199A-5p har blitt rapportert å bidra til leverkreft [5], [21], [22], rollen MIR-214 i HCC tumorigenesis er ikke klarlagt. Derfor vi neste søkte etter målet gener MIR-214 i HCC. Antatte MIR-214 målene ble beregnet med mål prediksjon programmer, miRBase og TargetScan. Vi fant at sekvenssammenstillingen av HSA-MIR-214 med 3′-UTR av menneskelig XBP-1 genet identifisert en MIR-214 bindingsstedet (Figur 2A). For å bekrefte at XBP-en er en antatt mål av MIR-214, bygget vi to luciferaserapportørplasmid vektorer med villtype XBP-en 3’UTR og mutert XBP-en 3’UTR (den komplementære sekvens i frøet regionen speil 214 bindingssetet ble mutert). Når ko-transfektert med MIR-214 etterligner inn i HepG2-celler, ble den relative luciferaseaktiviteten av en XBP-1 3’UTR luciferase reporter i betydelig grad undertrykkes ved ~ 50% sammenlignet med transfeksjon av negativ kontroll. I motsetning til dette ble ingen endring i relativ luciferaseaktivitet observert i celler transfektert med den mutante reporteren eller tom vektor (figur 2B). Disse resultater antyder at MIR-214 mål XBP-en ved direkte binding 3′-UTR av XBP-1.
(A) Sekvens innretting av human MIR-214 med 3′-UTR av XBP-1. Frøet sekvens av MIR-214 kamper 3′-UTR av XBP-en for å skape XBP-en 3′-UTR eller mutant luciferase reporter konstruere. (B) MIR-214 hemmer XBP-en 3′-UTR reporter men ikke mutant reporter eller tom reporter aktivitet. HepG2 celler ble transient transfektert med angitte plasmider med MIR-kontroll, MIR-214 etterligner. Etter 36 timers inkubering ble cellene utsatt for luciferase-assay. Kolonner, mener tre uavhengige eksperimenter; barer, SD. * P 0,05 vs Mir-con. (C) MIR-214 reduserer XBP-1 uttrykk i HepG2 (til venstre) og SMMC-7721 (høyre) celler analysert ved Western blotting.
Vi videre funnet at transient transfeksjon av HepG2 og SMMC-7721 celler med MIR-214 effektivt redusert XBP-1-proteinnivåer påvist ved western-blotting-analyse (figur 2C), som var uavhengig av ATF6 og IRE1 signalering (figur S1). Lignende resultater ble oppnådd i menneskelige epitelceller livmorhalskreft Hela celler (Figur S2). Disse data tyder på at Mir-214 rett gjenkjenner 3’UTR av XBP-1 mRNA og hemmer XBP-en oversettelse.
Videre western blot analyse viste at XBP-en proteinnivået ble økt i MIR-214- downregulated menneskelige HCC vev sammenlignet med tilstøtende nontumorous leveren vev (Figur S3). Vår analyse viser at XBP-en var et potensielt mål av MIR-214.
MIR-214 regulerer HCC celleproliferasjon og apoptose
Tidligere studier har innblandet XBP-en som en viktig overlevelsesfaktor for ER stress og tumorvekst [30], og dermed valgte vi om MIR-214 utøve en motsatt effekt i HCC for videre undersøkelser. For å bestemme virkningen av MIR-214 på HCC celleproliferasjon, HepG2 og SMMC-7721 celler, ble henholdsvis transfektert med Mir-214 etterligner eller MIR-kontroll og analysert for cellevekst. CCK-8 proliferasjonsanalyse viste at cellevekst ble redusert i MIR-214 etterligner-transfekterte HCC celler sammenlignet med MIR-kontroll -transfected celler eller ubehandlede celler (figur 3A). Lignende resultater ble observert av Br-dU inkorpore-ringsanalyse i HepG2 og SMMC-7721-celler (Figur 3B). Resultatene av
in vitro
analyser indikerte at eksogent MIR-214 hemmet signifikant proliferasjon av hepatom-cellelinjer.
(A) Relative celleantall av HepG2 og SMMC-7721-celler ved 48 timer post-transfeksjon ble evaluert ved bruk av CCK-8-analyse. (B) Celle vekst på HepG2 og SMMC-7721-celler ved 48 timer etter transfeksjon ble evaluert ved hjelp av Br-dU inkorpore-ringsanalyse. (C) Etter 48 timer MIR-214 etterligner transfeksjon ble celler merket med Annexin V og analysert ved strømningscytometri. (D) Etter 48 timer agomir-214 for behandling, ble SMMC-7721 celler merket med Annexin V og analysert ved flowcytometri * P. 0,05 vs ubehandlet (HepG2 eller SMMC-7721) eller MIR-con-behandlet
Videre, testet vi om oppregulert MIR-214 induserer HCC celle apoptose og celledød, ved å bestemme antallet av tidlige og sene apoptotiske HepG2 celler følgende behandlinger med MIR-214 etterligner ved flowcytometrisk analyse. Som forventet, ble noen få annexin-V-positive celler detektert i MIR-kontroll-behandlede eller ubehandlede celler, mens MIR-214 restaurering økte prosentandelen av apoptotiske celler (~ 20% i HepG2) som bedømt ved Annexin V-farging (figur 3C) . Konsekvent, tilsvarende effekter ble også påvist i SMMC-7721 celler behandlet med kolesterol-konjugert 2′-O-metyl-modifisert Mir-214 etterligner (agomir-214) (Figur 3D). Disse resultatene indikerer en vekst-hemmende rolle MIR-214 i HCC.
MIR-214 regulerer HCC tumordannelse og vekst in vitro og in vivo
De ovennevnte funnene bedt oss om å utforske den biologiske betydningen av MIR-214 i HCC tumorigenesis in vivo. Som et første skritt, ble kapasiteten av kolonidannelse evalueres SMMC-7721-celler transfektert med agomir-214 og agomir negativ kontroll (agomir-NC). Resultatene viste at agomir-214-behandlede celler viste mye færre og mindre kolonier sammenlignet med agomir-NC behandlede celler (figur 4A), som var i samsvar med den celleproliferasjonsanalyse. Videre agomir-NC- og agomir-214-behandlede SMMC-7721 celler ble injisert subkutant inn i hver bakre flanke av de samme nakne mus, respektivt. Etter 4 uker ble størrelsen på tumorknuter undersøkt. Vi fant at tumor-størrelser og tumorvekt ved slutten av observasjons ble signifikant redusert i agomir-214 behandlingsgruppe sammenlignet med det i det agomir-NC behandlingsgruppen (figur 4B). Lignende resultater ble også funnet i HepG2 celle xenografter trandfected med Mir-214 etterligner in vivo (figur S4 og S5) .Disse resultater tyder på at Mir-214 kan fungere som en antatt tumor suppressor i HCC celler.
(A ) XBP-en gjeninnføres reverseres undertrykkelse av kolonidannelse indusert av agomir-214 behandling i SMCC-7721 celler. (B) XBP-en gjeninnføres reverseres undertrykkelse av tumordannelse indusert av agomir-214 behandling i nude mus SMCC-7721 celler xenograft modell. Tumorvekt 4 uker etter inokulering ble målt. (C) XBP-1 gjeninnføres reversert undertrykkelse av celler proliferasjon indusert av agomir-214 behandling i SMCC-7721-celler. Resultatene var reproduserbare i tre uavhengige forsøk. * P 0,05 vs agomir-NC-behandlet; # P 0,05 vs agomir-214 eller agomir-214 + vektor behandlet
For ytterligere å bekrefte en potent rolle for MIR-214 /XBP-en sti i formidling tumorceller overlevelse og i reguleringen. HCC tumorvekst, vi re-uttrykt XBP-1 i MIR-214 behandlede HCC celler. Resultatene viste at restaurert XBP-1 uttrykk ved trans pCMV-XL5-XBP-1s svekkede agomir-214 formidlede XBP-1 undertrykkelse og tumor suppressor effekter
in vitro Hotell og
in vivo plakater (Figur S6 og 4A-C).
utfoldet protein respons nedregulerer MIR-199A /214 uttrykk i HCC celler
Som Mir-214 mål XBP-en og XBP-en er en viktig effektor av UPR og eR stress [31], [32], vi videre undersøkt om det kan være en sammenheng mellom MIR-214 ned-uttrykk og aktivering av UPR i HCC i hepatomceller. For å bekrefte virkningen av UPR på MIR-214-ekspresjon i HCC celler, to klassiske UPR inducer thapsigargin (TG) og tunicamycin (TM) ble anvendt for å indusere aktivering av UPR i HepG2-celler. Inkubering av HepG2-celler med TG (5 umol /l) og TM (5 ug /ml) markert forhøyet det GRP94 og XBP1 skjøting proteinnivå, noe som indikerer UPR aktivering. De sanntid RT-PCR resultater viste at Mir-214 uttrykk var signifikant nedregulert i HepG2 celler etter TG og TM behandling i 24 timer (figur 5A). Som MIR-199A-3p, MIR-199A-5p og MIR-214 sekvenser var en klynge, fant vi også at nivåene av MIR-199A-3p og MIR-199A-5p ble redusert sammenlignet med en kjøretøygruppe (figur 5A). I tillegg har vi testet ytterligere virkningen av hypoksi-indusert UPR på nivået av MIR-199A /214 uttrykk. Uttrykket nivåer av MIR-199A og MIR-214 var også lavere i HCC celler eksponert for anoksi indusert av CoCl
2 (100 mikromol /L) (figur 5B). Dermed MIR-199A og Mir-214 uttrykk nivåer er nedregulert av UPR under ulike fysiologiske og patologiske tilstander.
(A) HepG2 celler behandlet med Thapsigargin (TG, 5 mikromol /l) og tunicamycin (TM , 5 ug /ml) i 24 timer ble analysert ved western blotting for GRP94 og XBP1 ekspresjonsnivåene og analysert ved hjelp av sanntids-RT-PCR for MIR-199A-3p /-5p og MIR-214 uttrykk. (B) HepG2-celler behandlet med CoCl
2 (100 uM) i 24 timer ble analysert ved hjelp av Western blotting for GRP94 og XBP1 ekspresjonsnivåene og analysert ved hjelp av sanntids-RT-PCR for MIR-199A-3p /-5p og MIR -214 uttrykk. Kolonner, mener tre uavhengige eksperimenter; barer, SD; * P. 0,05 vs ubehandlet (HepG2) eller DMSO-behandlet
NFkB er en potensiell negativ regulator av MIR-199A-2 /MIR-214 genet
Som vist i Figur S7, MIR-199a2 og MIR-214 ble regulert som en klynge fra pri-MIR-199a2 innenfor den menneskelige Dnm3os gener; vi neste undersøkte MIR-199a2 promoter regionen for transkripsjonsfaktor bindingsseter, og identifisert 3 potensielle antatte NFkB bindingsseter i en 1,2-kb DNA fragment oppstrøms til pre-MIR-199a2 (figur S8). Så vi testet om NFkB er involvert i reguleringen av MIR-199a2 /214 uttrykk. Som vist i figur 6A, lipopolysakkarid (LPS) (10 ug /ml), en kjent induser av NFkB-aktivitet, indusert NFKB aktivering og hemmet MIR-199a2 /214 ekspresjon i SMMC-7721-celler. I kontrast, transfeksjon av siRNA rettet mot menneskelig p65 redusert NFkB uttrykk og økt MIR-199a2 /214-nivå i SMMC-7721 celler (Figur 6b). Disse data indikerte at NFkB er en potensiell negativ regulator av MIR-199A-2 /MIR-214 klynge.
(A) LPS (10 ug /ml) behandling indusert NFkB p65 uttrykk, demper Mir-199A /214 uttrykk i SMMC-7721 celler. (B) siRNA spesielt rettet mot menneske NF-kB P65 subenheten (100 nM) dereased NFkB p65 ekspresjon og økt uttrykk av MIR-199A /214 i SMMC-7721 celler. (C) NF-kB aktiveres av ER stress og hypoksi i HepG2-celler ble analysert ved Western blotting. (D, E) MIR-199A /214 uttrykk i HepG2 celler behandlet med ER stress-indus (5 mikromol /l TG og 100 mikrometer CoCl
2) og NFkB hemmere PDTC (100 mm). * P 0,05 vs ubehandlet (HepG2 eller SMMC-7721) eller DMSO eller siRNA con behandlet; # P. 0,05 vs TG eller CoCl
2 behandling
Videre har vi funnet at eksponering for TG indusert NFkB aktivering i HepG2 celler (figur 6C), og undertrykt MIR-199a2 /214 uttrykk ( Figur 5A). I samsvar med disse resultatene, den potente NFkB inhibitor pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC) (100 mm) i betydelig grad reversert undertrykkende effekt av UPR på MIR-199a2 /214 uttrykk (figur 6D), fremhever viktigheten av UPR /NFkB sti i MIR-199a2 /214 uttrykk.
Videre har vi også undersøkt om NFkB er i stand til å regulere MIR-199A /214 uttrykk ved anoksi. Resultatene viste at 100 mikromol /l CoCl
2 behandling også indusert NFkB og redusert MIR-199a2 /214 nivåer i HepG2 celler samtidig, og hemming av NFkB svekket reduksjon av MIR-199a2 /214 nivåer observert etter anoksiske behandling (figur 6C og E). Dermed disse dataene antydet at UPR formidlet negativ regulering av MIR-199a2 /214 om aktivering NFkB å delta i HCC progresjon.
Diskusjoner
mirnas er negative regulatorer av genuttrykk og kan fungere som tumor-suppressorer eller onkogener [33]. Noen spesielle mirnas ble rapportert å være forskjellig uttrykt i forskjellige kreft, slik som MIR-199A /214 klyngen. Økt nivå av MIR-214 ble funnet i eggstokkreft [28], magekreft [34] og føflekkreft [26], indusere kjemoterapi motstand eller tumormetastaser. Men i livmorhalskreft [27], [29] og brystkreft [35], ble Mir-214 uttrykk redusert, noe som tyder på en tumor suppressor gen-lignende funksjon. Den mulige forklaringen var at enkelte mirnas rettet mot flere mål i forskjellige celler. Flere MIR-214 målene er karakterisert ved ulike krefttyper (eggstokkreft, livmorhalskreft og føflekkreft) inkludert MEK3, JNK1 [29], PTEN [28], [36], Plexin-B1 [27], Ezh2 [35], [37], og TFAP2C [26] og så videre. I vår studie, vi videre identifisert XBP-en som et nytt mål på MIR-214 ved å binde sin 3′-UTR i HCC celler. Videre fant vi at de uttrykk for Ezh2 og plexin-B1 ikke er negativt korrelert med MIR-214 i MIR-214-downregulated HCC tumorprøver (data ikke vist). Basert på disse observasjonene, antok vi at XBP-en, men ikke Ezh2 og plexin-B1, er den «primære» target av miR214 i HCC, avhengig av de ulike mobil sammenheng.
Som vi vet, XBP- 1, en større transcriptional regulator av den ufoldede protein respons, regulerer en undergruppe av eR hørende anstand gener i den ufoldede protein respons for å beskytte cancerceller fra en utilstrekkelig miljø så som hypoksi eller glukosemangel [31], som er vanlig forekommende ved de fleste faste tumorer inkludert HCC. Klonogene overlevelses av de XBP-1-manglende tumorceller var signifikant redusert i løpet av alvorlig hypoksi /anoksi in vitro, og de XBP-1-knockout tumorceller var ikke i stand til å vokse som tumorer in vivo [30], som tyder på at XBP-en er essensiell for tumorcelleoverlevelse etter hypoksiske tilstander og fast tumordannelse og vekst. Tidligere studier viste at høyden til skjøting av XBP-1 mRNA, noe som resulterer i aktivering av XBP-1product, så vel som grp78 og ATF6, forekom i HCC vev med økt histologisk gradering [38]. Tilsvarende fant vi at XBP-en proteinnivået ble økt i MIR-214-downexpressed menneskelige HCC vev. Sammen utgjør disse studier indikerte at nedregulert MIR-214 i HCC kreft induserer over-ekspresjon av XBP-1, som igjen akselererer tumorigenesis. Interessant, tilsvarende resultat av MIR-214-mediert XBP-en undertrykkelse ble også oppnådd i Hela celler. Det er i tråd med de siste rapportene at MIR-214 er nedregulert i menneskelig livmorhalskreft og negativt regulerer Hela celleproliferasjon [27], [29]. Det vil være interessant nå å finne ut om overuttrykk av MIR-214 eller modulering av satsingen kan gi en ny behandlingsform for MIR-214-mangelfull svulst, som HCC, livmorhalskreft og brystkreft.
på den annen side, vår undersøkelse viste at en betydelig nedregulering av den MIR-199A /214 klynge ble observert i humane HCC vev og HCC cellelinjer sammenlignet med normal lever, i overensstemmelse med tidligere observasjoner fra profileringen av mirnas uttrykk i HCC [ ,,,0],9], [39], [40], [41], [42]. Men hva er mekanismen av MIR-199A /214 klynge ned-uttrykk i HCC? Økende bevis har vist at i løpet av ER stress, UPR representerer en adaptiv mekanisme som støtter overlevelse og chemoresistance av tumorceller, og har også blitt fremstår som et middel for tumorceller til å øke overlevelsen under betingelser med metabolsk stress, hypoksi, og kanskje til og med kjemoterapi [43]. I tillegg aktivering av MEK /ERK og mTOR har blitt rapportert å spille en avgjørende rolle i å kontrollere celleoverlevelse eller celledød indusert ved signale ER stress [44], [45], [46]. Som UPR transkripsjonsfaktor XBP-en ble identifisert som et mål på MIR-214 og nyere studier har avdekket de viktigste funksjonene i MIR-199A /b-3p i HCC kreftutvikling og progresjon ved å målrette mTOR og c-Met eller PAK4 /Raf /MEK /ERK Pathway i HCC celler [5], [21], bestemte vi oss for ytterligere å undersøke sammenhengen mellom UPR aktivering og MIR-199A /214 ned-uttrykk. Resultatet viser at MIR-214 og MIR-199A-3p /5p var signifikant nedregulert i HepG2 celler etter TG og TM behandlinger eller anoksi, videre tyder på at UPR aktivert XBP-en eller mTOR og ERK vei å beskytte svulst celle overlevelse om undertrykkelse av MIR-199a2 /214 klyngen i HCC.
for å starte rakne reguleringsmekanismer MIR-199a2 /214 til uttrykk under UPR forhold i større detalj, vi videre funnet at UPR aktivert NFkB med samtidig undertrykkelse av speil 199a2 /214 transkripsjon, og dette undertrykkelse ble reversert av NFkB inhibitor PDTC i HepG2 celler, noe som antydet at NFkB er en potensiell negativ regulator av MIR-199A-2 /MIR-214 klynge. NFkB er en viktig transkripsjonsfaktor som har dukket opp som en nøkkel modulator av endrede genet programmer og ondartede fenotype i utviklingen av kreft [47]. Tidlige studier indikerte at mange kreftformer, slik som brystkreft, lungekreft, og lymfom, og HCC, konstitutivt uttrykker høye nivåer av NFkB [48], [49]. I tillegg, hypoksi i HCC celler og vev indusert NFkB overekspresjon og /eller konstitutiv aktivering [50], [51]. Det var et regulatorisk SP1 /NFkB /HDAC /MIR-29b-nettverk for å kontrollere onkogen uttrykk i akutt myelogen leukemi (AML) [52]. I vår studie, viste vi at NFkB og XBP-en ble hovedsakelig uttrykt men MIR-214 ble betydelig redusert i menneskelige HCC vev, MIR-214 direkte rettet mot XBP-en, og UPR eller hypoksi-indusert-NFkB aktivering styrer MIR-199A negativt /214 klynge transkripsjon i HCC celler. Derfor er en ny UPR /NFkB /MIR-214 /XBP-en reguleringskretser ble foreslått i HCC progresjon, der NFkB ble aktivert av UPR og deltok i negativ regulering av MIR-199A /214 for å regulere HCC progresjon (figur 7) . Dette reguleringsmekanisme delvis forklart hvorfor PDTC behandling hemmet NFkB aktivisering, fremmet HCC celler apoptose og undertrykte tumorvekst [53], mens LPS behandling indusert NFkB aktivering og fremmet tumor celleproliferasjon og metastatisk vekst [54], [55], [56], [57]. Riktignok er flere beviser på NFkB bind området i formidler av Mir-199A /214 klynge som trengs i fremtiden for å støtte denne hypotesen, og flere undersøkelser er nødvendig for å belyse hvorvidt ER stress også aktivere andre faktorer (egSp1) sammen involvert i nedregulering av MIR-199A /214 i HCC. Likevel ytterligere forståelse av molekylære mekanismen og nettverk som gjør det MIR-199A /214 klase funksjoner kan gi nye muligheter for forskning som kan bidra til tidlig diagnostikk og behandling av denne svært ondartet svulst.
Den MIR-214 /XBP-en sti ble vist i dette arbeidet, mens MIR-199A-3p /mTOR og MIR-199A-5p /DDR1 trasé ble rapportert av andre studier.
i sammendraget, våre funn viste at eR stresset undertrykker uttrykk for MIR-199A /214 klynge ved å aktivere NFkB å oppregulere pro-overlevelse XBP-1 uttrykk, som foreslo en ny UPR /NFkB /MIR-214 /XBP-en reguleringskrets som dysfunksjon kan bidra til svulst overlevelse og progresjon av HCC. Vår studie gir ny innsikt i tumor suppressor aktivitet gitt av MIR-199A /214 og potensielle mekanismer for hepatocarcinogenesis.
Materialer og metoder
Materialer og reagenser
Materials var hentet fra den følge leverandører: antistoffer mot XBP-en, ATF6, NFkB, GAPDH, og β-aktin var fra santa cruz bioteknologi Inc. (Santa Cruz, CA); antilegemer mot GRP94 fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA); antistoff aganist p-IRE1 var fra Thermo Scientific Pierce Antistoffer (Rockford, IL); celle telling kit-8 ble oppnådd fra Beyotime Institutt for bioteknologi (Nantong, Kina); Br-dU celleproliferasjon ELISA-sett ble erholdt fra Roche (Penzberg, Tyskland); pCMV6-XL5-XBP-1s plasmid ble kjøpt fra Origene (Rockville, MD); miRNA negativ kontroll (MIR-con og anti-MIR-con), Mir-214 etterligner og anti-MIR-214, agomir-214 og agomir-NC, antagomir-214 og antagomir-NC, siRNA rettet mot menneskelig NFkB /p65 ble oppnådd fra RiboBio (Guangzhou, Kina); Alle andre kjemikalier og reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Kina Inc., Shanghai, Kina) med mindre annet er spesifisert.
mennesketumorprøver
I alt 23 snap-frosset normal og maligne vev (14 menn og 9 kvinner, median alder, 65,0 y, utvalg, 50-78 y) var samlet på Tongji sykehus (Wuhan, Hubei Kina). Normalt humant levervev ble hentet fra distal normalt levervev fra leveren hemangioma pasienter. Denne studien ble godkjent av Review Board of Tongji Hospital og Tongji Medical College. Fagene rekruttert til studien gitt skriftlig informert samtykke. Undersøkelsen er i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Vevsprøver ble oppnådd og holdt frosset i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Cellekultur
human hepatom-cellelinje HepG2 og human cervical cancer cellelinje Hela ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia), and human hepatomcellelinje SMMC-7721 var fra komiteen for Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og vedlikeholdes som anbefalt av kilden. Celler ble dyrket i DMEM, justert til å inneholde 4 mM L-glutamin, 1,5 g /l natriumbikarbonat, 4,5 g /l glukose, 10% FBS, 100units /ml penicillin, og 65units /ml streptomycin. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2.
Cell transfeksjon og behandlinger
HepG2 og SMMC-7721-celler ble transfektert med miRNA /siRNA negativ kontroll (MIR-con og Sir-con), Mir-214 etterligner eller siRNA rettet mot menneskelig NFkB /p65 (RiboBio, Guangzhou, Kina) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens protokoll. SiRNA sekvenser for human NFkB /p65 var: 5’GCC CUA UCC CUU UAC HiG A-3 «[58]. SMMC-7721 celler ble behandlet med 100 nM agomir-214 og agomir-NC, antagomir-214 og antagomir-NC og ble samlet 24 timer etter behandling for xenotransplantasjon i hårløse mus modle og Br-du innlemmelse analysen. HepG2-celler ble behandlet med 5 pg /ml thapsigargin og 5 umol /l tunicamycin og samlet 24 timer etter behandling for western blotting (WB) og analyser RNA-ekstrahering. Hypoksiske forhold ble opprettet ved hjelp av 100 pM CoCl
2 for 24 timer før celle samling.
Western blot analyse
Proteiner fra cellelysatene (20 mikrogram) ble atskilt med 10% SDS polyakrylamidgel-elektroforese og overført til en membran polyvinylidendifluorid. Etter blokkering i 5% fettfri melk, ble proteinblottene inkubert med et spesifikt antistoff etterfulgt av inkubasjon med et peroksidase-konjugert sekundært antistoff i blokkeringsbuffer.
