Abstract
Vi har undersøkt effekten av KML001 (NaAsO
2, natrium metaarsenite, Kominox), en oralt biotilgjengelig arsenforbindelse, på veksten og død av humane prostata kreftceller og dens virkningsmekanisme. Vekstinhibering ble bestemt ved cytotoksisitetsanalyser i nærvær eller fravær av inhibitor av apoptose inhibitor av autophagy eller antioksidant
N
-acetyl-
L-cystein for å studere mekanismen for celledød indusert av KML001 i PC3, DU145 og LNCaP prostatakreftcellelinjer. Elektronmikroskopi, flowcytometri og Western blotting ble brukt til å studere apoptotiske og autophagic mekanismer. Den DU145 xenograft-modell ble anvendt for å bestemme effekten av KML001 in vivo. KML001 redusert levedyktighet av celler og øket andelen av annexin V-positive celler på en doseavhengig i prostatakreftceller, og LNCaP-celler var mer følsomme overfor KML001 enn PC3 eller DU145-celler. Elektronmikroskopi avslørte typiske apoptotiske karakterer og autophagic vakuoler i celler behandlet med KML001. Eksponering for KML001 i prostatakreftceller indusert apoptose og autofagi i et tids- og doseavhengig måte. KML001 indusert doseavhengig opphopning av reaktive oksygenforbindelser, og scavenging de reaktive oksygenforbindelser med
N
acetyl-
L-cystein redusert LC3 og kløyvde poly (ADP-ribose) polymerase. KML001 betydelig hemmet tumorvekst i DU145 xenograft modell. I tillegg ble det observert betydelig reduksjon av spredning og betydelig økning av apoptose og autofagi i KML001-behandlede tumorer enn i kjøretøy-behandlede svulster. Eksponering av menneskelige prostata kreft celler til KML001 indusert både apoptose og autophagic celledød via oksidativt stress sti. Og KML001 hadde en antiproliferativ effekt på DU145 cellene i xenograft mus
Citation. Du D, Kim Y, Jang MJ, Lee C, Jeong IG, Cho YM, et al. (2015) KML001 induserer apoptose og autophagic celledød i prostata kreft celler via Oksidativt stress Pathway. PLoS ONE 10 (9): e0137589. doi: 10,1371 /journal.pone.0137589
Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, CANADA
mottatt: 6 mars 2015; Godkjent: 18 august 2015; Publisert: 09.09.2015
Copyright: © 2015 Du et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd av Korea Health Technology R D Project og Ministry of Health Velferd (A062254 og A102059)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mens arsenforbindelser er viden kjent som kreftfremkallende som induserer kreft i mange humane vev, arsenikk (As
2o
3, ATO) har blitt påvist klinisk for å være et effektivt terapeutisk middel for behandling av akutt promyelocyttisk leukemi [1,2]. Selv om sin anticancer virkningsmekanisme ikke er godt forstått, har ATO blitt funnet å regulere forskjellige biologiske funksjoner, inkludert celle proliferasjon, apoptose, differensiering og angiogenese i forskjellige cellelinjer [3]. Fordi ATO var vellykket i behandling for akutt leukemi [1,2,4], er arsenicals opplever en vekkelse i moderne kreftmedisin [5].
Arsen finnes i tri og penta-valente oksidasjons som kjemisk ustabile sulfid og oksyd, og som saltene av natrium, kalium eller kalsium. Treverdige arsenicals, inkludert KML001 (NaAsO
2, natrium metaarsenite, Kominox) og ATO, hemme mange enzymer ved å reagere med biologiske ligander som har gratis svovelgrupper [3,6]. Tre viktige molekylære mekanismer for ATO-indusert apoptose er blitt evaluert, involverer mitogenaktiverte proteinkinaser, caspaser og reaktive oksygenarter (ROS) [3]. Selv om virkningsmekanismen av ATO er velkjent [7-12], som av KML001 er fremdeles under undersøkelse [13,14].
På grunn av den orale biotilgjengelighet, vannoppløselighet og lavere median letal dose ( LD
50) hos rotter, er KML001 mer egnet for kliniske applikasjoner enn ATO [13]. Vi undersøkte derfor muligheten av KML001 til å inhibere vekst og induserer celledød av human prostatacancercellelinjer. Vi har også analysert om autofagi er med apoptose involvert i KML001-indusert celledød i prostata kreft cellelinjer. Til slutt bestemte vi den antitumor effekt av KML001 i DU145 xenograft modell.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
Den menneskelige prostata kreft cellelinjer, PC3, DU145, og LNCaP ble anskaffet fra ATCC (Manassas, VA, USA) og holdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. KML001 ble hentet fra Komipharm International (Gyeonggi-do, Korea). Z-VAD-FMK ble kjøpt fra R 0,05 og bestemmes av enveis variansanalyse (ANOVA).
Resultater
Effekt av KML001 på spredning av prostata kreft celler
Inkubasjon av androgen-uavhengig PC3 og DU145 og androgen-avhengig prostata LNCaP kreftceller med 0.0001-200 uM KML001 i 72 timer redusert cellelevedyktighet på en doseavhengig måte. LNCaP-celler var mer følsomme enn PC3 eller DU145-celler (figur 1, tabell 1)
celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av KML001 ble inkubert i 72 timer.. Den Alamar blue analyse ble utført i tre eksemplarer. Gjennomsnittsverdier er gitt, er verdien av kontrollen er 100%. PC3 (●,
tykk heltrukken linje
), DU145 (▲,
tynn heltrukken linje
), og LNCaP (▼,
tynn heltrukken linje
).
Induksjon av apoptotisk celledød
for å avgjøre om behandling med KML001 (10 mm) induserer apoptose ble ultrastructure av KML001-behandlede PC3 celler analysert ved elektronmikroskopi. PC3 celler behandlet med KML001 viste typiske apoptotiske tegn, inkludert en mindre kjerne, mer konsentrert cytoplasma, sammenkrøllet kjernemembranen, og kromosomer kondenseres til en halvmåneformet form med vedlegg til de nukleære og cellulære membraner. Videre ble apoptotiske legemer observert når kromatin kondensert og sprukket på atom margin. Lignende resultater ble observert i DU145 og LNCaP celler behandlet med IC
50 konsentrasjoner av KML001 (5 mikrometer og en um, henholdsvis) (figur 2).
For å undersøke mekanismen for KML001-indusert celledød, utførte vi annexin V flowcytometri analyser. Behandling av disse cellene med KML001 ga celler som var positive for annexin V farging bare og cellene som var positive for annexin V og PI farging. Disse resultatene indikerer at KML001 indusert celledød via både apoptose og nekrose (figur 3A).
(A) FACS-analyse av annexin V /PI farging. Resultatene viser begynnelsen av apoptose, definert som annexin V-positive og PI-negative celler, og sent apoptose, definert som annexin V-positive og PI-positive celler. Resultatene ble uttrykt som middelverdier ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (B) Western blot analyse av tids- og doseavhengig spalting av PARP og aktivering av procaspase-3.
Vi har også funnet at eksponering av prostata kreft celler til KML001 resulterte i et tids- og doseavhengig økning i spaltingen av PARP, samt aktiveringen av procaspases-3, som formidler indre apoptose (figur 3B). For å bekrefte rollen av apoptose i KML001-indusert død av prostata kreft celler, behandlet vi cellene med caspase inhibitor Z-VAD-FMK. Vi har funnet at tilsetning av 20 pM Z-VAD-FMK redusert aktivering av procaspases-3 i alle prostata cancer-cellelinjer (data ikke vist), støtter hypotesen om at KML001 indusert apoptose i prostatakreftceller.
Induksjons av autophagic celledød
for å avgjøre om behandling med KML001 (10 mm) induserer autofagi, ble ultrastructure av PC3 behandlede celler undersøkt ved elektronmikroskopi. Vi har observert autophagic vakuoler, inkludert autophagosomes eller autolysosomes, i KML001-behandlede PC3-celler, så vel som i DU145 og LNCaP-celler ble behandlet med deres respektive IC
50 konsentrasjoner av KML001 (figur 2).
Prostatakreft celler eksponert for KML001 ble undersøkt ved Western blotting, ved å bruke et anti-LC3 antistoff som gjenkjenner begge formene for LC3. Vi har funnet at ekspresjonen av LC3 og /eller omdannelse til LC3-II økte på en tids- og doseavhengig måte, i forhold til ubehandlede celler (figur 4A). For å bekrefte rolle autophagy i KML001-indusert død av prostata kreft celler, vi behandlet cellene med autofagi inhibitor 3-MA. Vi har funnet at tilsetning av 2 mM 3-MA redusert ekspresjon av LC3-II på alle prostatakreft-cellelinjer (figur 4B). I tillegg, tilsetning av 1 mM 3-MA også svekkede KML-indusert celledød i alle prostatakreft-cellelinjer (figur 4C). Samlet utgjør disse funnene støtter hypotesen om at KML001 indusert autofagi-mediert celledød i prostata kreft celler.
(A) Western blot analyse av tids- og doseavhengig konvertering av LC3-I til II. (B) Hemming av 3-MA av KML001-indusert konvertering av LC3 i prostatakreftceller. (C) Cellene ble eksponert for 10 uM (PC3), 5 um (DU145), eller 2 uM (LNCaP) KML001 i nærvær eller fravær av 1 mM 3-MA i 72 timer. Resultatene ble uttrykt som middelverdier ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *
p
0,05 av enveis ANOVA.
Den antioksidanten NAC beskytter cellene mot KML001-indusert celledød
KML001 indusert doseavhengig ROS akkumulering i alle tre prostata kreft cellelinjer (Fig 5A ). Vi undersøkte også effekten av antioksidanten NAC på KML001-indusert apoptose og autophagy. Vi har funnet at behandling av alle tre prostatakreft-cellelinjer med 1 mM NAC redusert ekspresjon av LC3-II og proteolyse av PARP (figur 5B). I tillegg, tilsetning av 1 mM NAC også dempes KML-indusert celledød i alle prostatakreft-cellelinjer (figur 5C). Disse funnene gir ytterligere bevis på at eksponering av prostatacancerceller til KML001 aktivert både apoptose og autofagi via oksidativt stress.
Alle tre prostatakreftceller ble behandlet med den angitte konsentrasjon av KML001 i fravær eller nærvær av 5 mM NAC i 24 timer. (A) KML001 induserer en doseavhengig ROS (blå) akkumulering. Cellene ble farget med DCFH-DA og vasket med PBS. Mer enn tre felt i hver celle ble observert av fluorescens mikroskop (200 ×), og representative bilder vises. (B) NAC hemming av KML001-indusert konvertering av LC og caspaseaktivering i prostatakreftceller. (C) Cellene ble eksponert for 10 uM (PC3), 5 um (DU145), eller 2 uM (LNCaP) KML001 i nærvær eller fravær av 1 mM NAC i 72 timer. Resultatene ble uttrykt som middelverdier ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *
p
0,05 av enveis ANOVA.
Effekt på DU145 xenografter
Vi subkutant injisert hårløse mus med 5 × 10
6 DU145 cellene for å teste effekten av KML001 på androgen- uavhengige prostatakreftceller in vivo. Når tumorstørrelsen nådde 100 mm
3, vi administrert KML001 (2,5 eller 10 mg /kg /dag) til dem i 4 uker. I DU145 xenograft modell, ble tumorvekst hemmet med KML001 i forhold til kjøretøyet (figur 6A). Men KML001 behandling hadde ingen effekt på kroppsvekt av mus (figur 6B)
kjøretøy og KML001 gruppe mus oralt mottok saltvann og KML001 (2,5 eller 10 mg /kg /dag) i 4 uker, respektivt. *
p
0,05 vs. kjøretøy.
I neste forsøk, bestemt vi effekten av KML001 på spredning, apoptose, og autofagi i tumorvev høstet fra dyr av ulike behandlingsgruppene. I immunhistokjemisk farging av spredning markør Ki-67, ble det observert signifikant reduksjon i Ki-67 farging i KML001 behandlet svulster enn i kjøretøy-behandlede tumorer (figur 7a). I TUNEL analysen ble betydelig større apoptotiske celler observert i KML001-behandlede tumorer enn i kjøretøy-behandlede tumorer (figur 7B). I Western blot-analyse, har vi funnet at ekspresjonen av LC3 og /eller omdannelse til LC3-II økte på en doseavhengig måte i forhold til bærer-behandlede tumorer (figur 7C).
Tre felter i hver mus var observert av fluorescens (200 ×) og lyse felt mikroskoper (200 ×), henholdsvis. Representative bilder av hver behandlingsgruppe ble vist. mus kjøretøy og KML001 gruppe muntlig fikk saltvann og KML001 (2,5 eller 10 mg /kg /d) i 4 uker, henholdsvis. *
p
0,05 vs. kjøretøy.
Diskusjoner
Prostatakreft er en av de viktigste årsakene til dødsfall blant menn i USA [19]. Selv aggressive innsats mot tidlig oppdagelse og behandling nedgang dødelighet for prostatakreft, er prostatakreft den nest vanligste årsaken til kreft dødsfall blant menn ennå. Selv tidlig stadium prostatakreft krever androgen for vekst og dermed reagerer på androgen deprivasjon terapi, kan sykdommen utvikle seg til androgen-uavhengighet og kan være ikke svarer til androgen ablasjon [20]. Docetaxel-basert kjemoterapi har vist palliativ og overlevelse fordeler for pasienter med kastrering resistent prostatakreft, men behandlingsresultater er generelt ikke tilfredsstillende med en median overlevelse på bare 16 til 18 måneder [21,22]. Så er det ikke bare viktig å utvikle effektive metoder for å forhindre eller forsinke dannelsen av kastrering resistent prostatakreft, men også for å utvikle nye kjemoterapeutiske midler for behandling av kastrering-motstandsdyktig prostatakreft.
Siden ATO ble vist å ha dramatiske effekter hos pasienter med akutt promyelocytic leukemi [1,2], har denne agenten også blitt testet hos pasienter med solide tumorer, inkludert prostata kreft [23]. Både ATO og KML001 er verdige arsenicals og identiske stoffer i løsning, med lignende cytotoksisitet mot androgen-uavhengig prostatakreftceller [13]. Men den orale biotilgjengelighet og vannoppløselighet av KML001 antyder dets kliniske anvendbarhet sammenlignet med ATO. Videre KML001 ble vist å ha høyere LD
50 (41,6 mg /kg) i rotter, sammenlignet med ATO (14,6 mg /kg) [13]. Så testet evnen til KML001 til å inhibere vekst og induserer celledød av human prostatakreft celle. Vi fant at KML001 behandling redusert spredning av alle tre prostatakreft-cellelinjer, å være mer giftig for androgen-avhengige LNCaP-celler enn til androgen-uavhengige celler. Enda viktigere, KML001 hadde en antiproliferativ effekt på androgen-uavhengig DU145-celler in vitro og in vivo.
ATO virker på ondartede celler gjennom en rekke mekanismer, og er rettet flere signaltransduksjonsveier og resulterer i induksjon av apoptose, antiproliferativt aktivitet, og antiangiogenesis [3]. Flere nyere studier har rapportert at ATO og KML001 kan målrette en telomer /telomerase komplekse [8-10,13]. KML001 binder seg til telomeric sekvenser og eroderer telomerer, som resulterer i telomere-assosiert DNA skade induksjon og telomere avgang. I tillegg ble ATO funnet å fremkalle type II programmert celledød, autophagy, i maligne gliomceller [11,24]. Vi har vist seg her at KML001 behandling resulterte i dannelsen av autophagic vakuoler, som dokumentert ved elektronisk mikroskopi. Videre KML001 induserte en tids- og doseavhengig økning i LC3-II. Bruk av autofagi inhibitor 3-MA, bekreftet vi at mekanismen for KML001-indusert celledød innebærer autofagi. Autophagy er ikke bare ansvarlig for celledreping av seg selv, men deltar også i et dødelig signale hendelse indusere apoptose eller nekrose [25,26].
I tillegg fant vi at aktiveringen av autofagi og apoptose ved KML001 ble formidlet av oksidativt stress. ROS spille en sentral rolle som formidler cytotoksisitet indusert av KML001. Flere studier har funnet at ROS spiller viktige roller i regulering av både normale cellulære prosesser og sykdomsprogresjon [27-29]. I tillegg har akkumulert ROS vært kjent som nøkkelmellom for cytotoksisitet indusert av kjemoterapeutika, inkludert ATO [3].
En bekymring om bruk av arsen for kliniske applikasjoner er dens toksisitet hos mennesker. Kliniske studier har vist at ATO ved konsentrasjoner mindre enn 2 mikrometer induserer ikke alvorlige bivirkninger [30,31]. Som nevnt ovenfor, KML001 var mindre toksisk for rotter ved den samme konsentrasjon av ATO [13]. I vår studie, KML001 hadde ingen negativ effekt på kroppsvekten DU145 xenograft mus. Våre resultater tyder derfor på at KML001 kan være klinisk nyttig hos pasienter med kastrering-motstandsdyktig prostatakreft.
Mens de fleste kjemoterapeutiske midler er rettet mot inhibering av veksten av kastrering resistent prostatakreft, androgen-avhengige og-uavhengig prostatacancer -celler er blitt rapportert å være like utsatt for ATO-indusert apoptose [23]. Videre kan inhibering av ATO var mer uttalt i prostatakreftceller som uttrykker androgen reseptor enn i prostatakreftceller tømt for androgen reseptor, og inhibering av androgen-reseptor-aktivitet ved ATO og av androgen-reseptor-antagonist, bikalutamid, ble tilsetningsmiddel [24]. Disse resultatene kan garantere for fremtiden vurdering av effektene av KML001, alene eller i kombinasjon med androgen deprivasjon terapi på utviklingen av androgen-avhengige LNCaP til androgen uavhengighet i en naken mus xenograft modell.
Konklusjoner
Vi har vist her at eksponering av androgen-avhengige og-uavhengige prostatakreftceller til KML001 aktivert både apoptose og autophagic celledød gjennom oksidativt stress. I tillegg KML001 hadde en antiproliferativ effekt på androgen-uavhengig DU145 celler in vivo.
Takk
KML001 ble levert fra Komipharm International Co., Ltd., Gyeonggi-do, Korea.
Denne studien ble støttet med tilskudd av Korea Health Technology R D Project og Ministry of Health Velferd (A062254 og A102059).
