Abstract
Parathyroidhormon relaterte protein (PTHrP) besitter en rekke fysiologiske og utviklingsfunksjoner, og er også kjent for å legge til rette progresjon av mange vanlige kreftformer, særlig deres skjelett invasjon, først og fremst ved å øke benresorpsjon. Hensikten med denne studien var å bestemme hvorvidt PTHrP kunne fremme epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), en prosess implisert i kreft stamceller som er kritisk involvert i kreftinvasjon og metastase. EMT ble observert i DU-145 prostatakreft-celler som stabilt overuttrykker enten 1-141 eller 1-173 isoform av PTHrP, hvor det var oppregulering av sneglen og vimentin og nedregulering av E-cadherin i forhold til foreldre DU 145. I motsetning til dette, i motsatt retning ble observert i PC-3 prostatakreftceller der høye nivåer av PTHrP ble slått ned via lentiviral siRNA transduksjon. Økt tumorprogresjon ble observert i PTHrP-overekspresjon DU 145 celler mens redusert progresjon ble observert i PTHrP-knockdown PC-3 celler. PTHrP-overekspresjon DU 145 dannes større svulster når implantert orthoptopically inn i nakne mus og i ett tilfelle resulterte i ryggmetastase, en effekt som ikke observert hos mus injisert med foreldre DU-145-celler. PTHrP-overekspresjon DU-145-celler også medført betydelig bendestruksjon når det injiseres i tibiae fra nakne mus, mens sperre DU-145-celler forårsaket liten eller ingen ødeleggelse av ben. Sammen tyder disse resultater på at PTHrP kan fungere gjennom EMT for å fremme en aggressiv og metastatiske fenotype i prostata cancer, en mekanisme som er viktig i kreft stamceller. Dermed fortsatte arbeidet med å belyse de veier som er involvert i PTHrP-indusert EMT samt å utvikle metoder for å spesifikt retter PTHrP signale kan føre til mer effektive behandlinger for prostata kreft
Citation. Ongkeko WM, Burton D, Kiang A, Abhold E, Kuo SZ, Rahimy E, et al. (2014) parathyreoideahormon nærstående Protein Fremmer epithelial-til-Mesenchymale Overgang i prostatakreft. PLoS ONE 9 (1): e85803. doi: 10,1371 /journal.pone.0085803
Redaktør: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 21 juni 2013; Godkjent: 02.12.2013; Publisert: 22 januar 2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Veterans Administration Merit Award (LJ Deftos) støttet dette prosjektet (https://www.research.va.gov/services/csrd/merit_review.cfm # .UcI2KPY-UCG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne ønsker å erklære at selv om Robert M. Hoffman er tilsluttet mot kreft, Inc., er det ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter og alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Innledning
Parathyroidhormon relaterte protein (PTHrP) besitter en rekke fysiologiske og utviklingsmessige funksjoner, men er også kjent å legge til rette for progresjon av mange kreftformer, inkludert prostata kreft. Vi og andre har tidligere vist at PTHrP stimulerer prostatakreft cellevekst, invasjon og metastase, som opererer via begge parakrine /autokrine og intracrine trasé [1] – [3]. PTHrP er kjent for å aktivere en rekke mitogene veier inkludert MAPK og PI3K /Akt samt trasé som stimulerer skjelettmetastaser, en av de mest vanlige livstruende forstyrrelser assosiert med kreft [4] – [6] .Secreted PTHrP er kjent for å medierer dens cellulære effekter via interaksjon med den G-protein-koblede PTH /PTHrP-reseptoren [7]. Co-uttrykk for PTHrP og dens reseptor har tidligere blitt identifisert i prostatakreft primære svulster og deres tilsvarende benmetastaser [8]. I tillegg, Freemont et al tidligere har rapportert en økning i ekspresjon av PTHrP reseptoren i prostata cancer skjelettmetastaser i forhold til primære tumorer, noe som tyder på en mulig rolle av den reseptor-mediert reaksjonsvei i dannelsen av skjelettmetastaser [9].
epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er en prosess i hvilken epitelceller undergå cytoskeletal og morfologiske endringer til å erverve en mesenchymale fenotype og er viktig i normale prosesser så som fibrose [10]. På grunn av dens virkning på celleadhesjon og mobilitet EMT er også kritisk involvert i kreft-metastase og invasjon [11], [12]. EMT kan være kjennetegnet ved tap av epitel-markører som E-cadherin og økt ekspresjon av mesenchymale proteiner inkludert vimentin og N-cadherin [13]. Transkripsjonsfaktorer sneglen, Slug og Twist er kjent for å undertrykke E-cadherin uttrykk og indusere EMT [14] – [16]. Andre onkogene veier inkludert Src, Ras, Wnt /β-catenin, PI3K /Akt, MAPK, og TGF-β alle har vært knyttet til EMT [17]. Flere studier har vist at kreftcellene blir mer invasive og metastatisk etter under EMT. I tillegg har EMT vist seg å gi stamcelleegenskaper til brystkreftceller [18].
Gitt at PTHrP har en rolle i å fremme invasjon og metastase i prostata cancer, og at EMT er en av de viktigste regulatorer av disse egenskapene i kreft, det avgjørende spørsmålet presenteres er om PTHrP er i stand til å fremme EMT i kreftceller. PTHrP har vist seg å indusere EMT i noen sammenhenger, blant annet i løpet av parietal endoderm dannelse og renal fibrogenese [19], [20], selv om muligheten for PTHrP å regulere EMT i kreft har vært uninvestigated. Brystkreft, pro-metastatiske effekter av TGF-β, en potent induser av EMT, har vist seg å være formidlet av PTHrP [21]. Til sammen tyder eksisterende litteratur som regulering av EMT av PTHrP i kreft er svært sannsynlig. I denne studien søkte vi å finne ut hvilken rolle PTHrP i regulering av EMT i prostatakreftceller sammen med invasjon og metastasering. Etablering av en rolle PTHrP i å regulere bein metastase kreft og EMT gir både grunnleggende og kliniske begrunnelser for å belyse den molekylære mekanismen for PTHrP handlinger i mange vanlige kreftformer som prostatakreft.
Materialer og metoder
Etikk Statement
VA IACUC godkjent denne studien. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH Publikasjonsnummer 85-23) under forsikring nummer A3873-01. Dyrene ble holdt under isoflurananestesi under operasjonen, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Disse dyrene ble nøye fulgt, sjekket daglig og avlives ved første tegn på ubehag. Tegn til ubehag inkludere eventuelle unormale bevegelser, unormale fôring eller drikking atferd, mangel på selv grooming eller andre unormale atferd.
Cells
DU 145 og PC-3 human prostata kreft cellelinjer og ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i monolag i RPMI 1640 medium (media~~POS=TRUNC, Herndon, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gemini Bio Products, Woodland, CA) ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 95% luft, 5% CO
2. Linjen DU 145 celle ble valgt fordi den har en lav konstitutiv ekspresjon PTHrP og ikke vokser eller metastasere vel i musetumormodeller, i motsetning til PC-3-celler [22] – [24]. PC-tre cellelinje, som opprinnelig ble isolert fra en prostata adenokarsinom som hadde spredning til beinet, har en osteolytic fenotype i immunsupprimerte musemodeller [22], [25].
Plasmid konstruksjon
De PTHrP ekspresjonsplasmidene brukt i denne studien var menneskelig prepro- PTHrP1-87, PTHrP1-141, og PTHrP1-173; prepro skjemaene ble brukt for å lette PTHrP-sekresjon. Konstruksjonene ble retnings subklonet i PCI-neo ekspresjonsvektoren (Promega, Madison, WI) og fidelities av alle plasmider ble bekreftet ved DNA-sekvensering og stedsspesifikke PTHrP immunologiske analyser [23], [26].
PTHrP transfeksjon og lentiviral-mediert stanse
DU 145 prostata-celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
4 celler /cm
2 i 12-brønners cellekulturskåler og transfektert med 1 ug plasmid per brønn. Individuelle G418 resistente kolonier (800 ug G418 /ml) ble isolert 21-30 dager senere. De kondisjonerte medier fra plukket cellekolonier ble evaluert for PTHrP uttrykk av stedsspesifikke immunologiske analyser og PTHrP uttrykker stabile DU145 cellene ble utvidet [23], [26]. Det har tidligere blitt vist at villtype og vektor-transfiserte DU 145 oppviser en lignende fenotype [27], [28]. Villtype paren DU-145-celler ble således anvendt som en kontroll for RT-qPCR og matrigel invasjonsforsøk, men parallelle eksperimenter ble utført med en tom vektor-transfekterte kontroll-derivat. PC-3 prostataceller gikk en stabil knockdown av PTHrP via lentiviral siRNA. Kontrollceller ble utsatt for lentiviral siRNA transduksjon med en ikke-måls sekvens konstruere.
Kvantitativ Reverse-transkripsjon PCR
Cellene ble høstet to dager etter å ha blitt passert på ca 70-80% samløpet. Totale cellelysat ble oppsamlet og RNA ble ekstrahert ved bruk av en RNeasy-sett (Qiagen). cDNA ble syntetisert ved hjelp Hevet III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time PCR reaksjonsblandinger ble fremstilt ved hjelp av Power SYBR Grønn (Applied Biosystems, Foster City, CA), og kjøre på 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems) med følgende program: 95 ° C i 10 min, 95 ° C i 30 s, og 60 ° C i 1 minutt, 40 sykluser. Resultatene ble analysert ved anvendelse av sammenlignings ddCt fremgangsmåte og smelter kurver ble utført for å sikre spesifisitet. Forsøk ble utført i triplikater og tekniske ble gjentatt minst to ganger uavhengig av hverandre. GAPDH genekspresjon ble målt som endogen kontroll. Primere ble tilpasset bestilles (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL) ved hjelp av følgende sekvenser:
Snail Forward 5′-TCTGAGTGGGTCTGGAGGTG-3 «, Snail Reverse 5’CTCTAGGCCCTGGCTGCTAC-3′, GAPDH Forward 5»-CTTCGCTCTCTGCTCCTCC -3 «, GAPDH revers 5′-CAATACGACCAAATCCGTTG -3′, E-cadherin Forward 5»-GGCGGAGAAGAGGACCAGGACT-3 «, E-cadherin revers 5′-TGGCAGGGCGGGGAAGATACC-3′, vimentin forover 5»- GGAAATGGCTCGTCACCTTCGT-3 «, vimentin omvendt 5»-AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT-3 «.
immunfluorescens
Celler ble trypsinert og dyrket på dekkglass. Cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd og blokkert i geiteserum i Dulbeccos fosfatbufret saltvann ved romtemperatur, før inkubering med muse-monoklonalt anti-humant vimentin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Celler ble deretter inkubert med et geit anti-mus FITC-konjugert sekundært antistoff (Chemicon, Temecula, CA) og motfarget med DAPI. Til slutt ble SlowFade Gold antifade reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) brukes til å montere dekkglassene på lysbilder. Fluorescent bilder ble oppnådd ved 40X bruker Leica DMIRE2 invertert fluorescens mikroskop og dataprogram Simple PCI ble brukt for bildeopptak.
Matrigel invasjonen analysen
Invasion of PC3 og DU 145 celler ble målt ved hjelp av en Matrigel invasjon assay (Becton Dickinson, Bedford, MA). Transwell innskuddene til 8 um porestørrelse ble belagt med en sluttkonsentrasjon på 1 mg /ml av Matrigel i kaldt serumfritt DMEM. Cellene ble trypsinert, og 500 ml av cellesuspensjonen (1 x 10
5 celler /ml) ble tilsatt i triplikate brønner. Det nedre kammer i transwell ble fylt med 750 ul kulturmedium inneholdende 0,5% serum som en kjemoattraktant og tillatt å inkubere ved 37 ° C i 48 timer. Invaderende celler på den nedre overflate som passerte gjennom filteret ble fiksert og farget ved hjelp av krystallfiolett i glutaraldehyd og fotografert. Antallet av de fargede kjerner ble talt i en forhåndsbestemt og konsekvent delen av hver brønn.
Dyr
Seks måneder gammel mann, alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus ble plassert i en barriere filter rom og matet Purina gnager chow ad lib. Dyrene ble tappet for blod ved slutten av studien ved hjelp av en retro-orbital metoden.
ortotopiske Tumor Implantasjon
Subkonfluente DU145 og stabilt transfekterte DU145-PTHrP (1-173) -GFP celler var fersk trypsinert, telles, og plassert på is umiddelbart før injeksjon. Musene ble injisert med 10
6-celler subkutant plass av flanken av dyret i et totalvolum på 0,25 ml serumfritt RPMI 1640 medium. Musene ble avlivet for å høste tumorvev 4 uker etter tumorcelle injeksjoner. Tumorfragmenter (1 mm
3) ble nylagede fra subkutane svulster og implantert i prostata lateral flik av en annen SCID mus (22-24). De 1 mm
3 tumorfragmenter ble dissekert, målt med calipers og veid for å sikre den nøyaktige mengden starter tumor ble brukt for hvert dyr. Prostata Kapselen ble eksponert etter et nedre midtlinjen abdominal innsnitt og en tumor-fragment ble innsatt i kapselen. Prostatakapselen ble deretter avsluttet med en 8-0 kirurgisk sutur og snitt i bukveggen ble avsluttet med en 6-0 kirurgisk sutur i ett lag [29].
Dyrene ble holdt under isoflurananestesi under kirurgi. Alle prosedyrer av den ovenfor beskrevne operasjon ble utført med en 7 X forstørrelse mikroskop. Musene ble undersøkt 60 dager etter tumorimplantasjon for tumorprogresjon og metastase ved fluorometri og for skjelettabnormaliteter ved røntgen. Høy forstørrelse avbildning av GFP-uttrykke svulster ble utført med en Leica fluorescerende stereomikroskop, modell LZ12, utstyrt med en 50 W kvikksølvlampe og hele kroppen bildebehandling ble utført i en lyskasse opplyst av blått lys fiberoptikk (Lightools Forskning , Encinitas, CA) og avbildes med en thermoelectrically avkjølt farge CCD-kamera (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ).
intraossøs injeksjoner
for å evaluere effekten av PTHrP på prostata kreft vekst i bein, vi brukte en intra-tibial modell for prostatacancer benmetastase (1, 24). Vi studerte fem typer stabilt transfektert GFP uttrykker DU145-celler: (1) vill-type, (2) vektor (pCI-neo), (3) PTHrP (1-87), (4) PTHrP (1-141) og ( 5) PTHrP (1-173) transformerte celler. Musene ble injisert med 10
6-celler i 15 ul steril PBS i benmargen til høyre proksimale tibia ved anvendelse av en 26 gauge nål og en Hamilton glassprøyte. Den venstre tibia tjente som den negative kontroll. Musene ble undersøkt 60 dager etter at injeksjoner for intraosseøse skjelettforstyrrelser hos røntgen [24]. Skjelett røntgen ble utsatt med 40 keV i 20 sekunder i en Faxitron 5000-serien X-ray kabinett og Kodak X-Omat TL filmer ble behandlet i en Kodak film prosessor. For høyere oppløsning avbildning av benmisdannelser, brukte vi en GE utforske Micro CT (GE Healthcare).
PTHrP Immunoassay
Cell ekstrakter og media PTHrP ble målt ved RIA basert på PTHrP (1- 34), PTHrP (38-64), og PTHrP (109-141), som beskrevet tidligere [30]. Alle prøvene ble analysert i flere fortynninger og i triplikater.
Statistical Analysis
Alle forsøkene ble utført i triplikat og Feilstolpene representerer standardavvik. Statistisk signifikans ble testet ved hjelp av en to sample uavhengig t-test (2-tailed test) ved terskelen satt til
P
. 0,05
Resultater
PTHrP Overuttrykte Fremmer Expression of Mesenchymale Markers
for å studere regulering av EMT, PTHrP ble stabilt overexpressed i DU 145, en prostatakreft cellelinje med lav basal PTHrP uttrykk som bestemmes av immunoassay (figur 1A). To kloner ble opprettet, med en overuttrykke de 1-141 isoform av PTHrP og den andre som overuttrykker den 1-173 isoformen (figur 1B). Begge kloner vises markører for EMT, uttrykker særlig høyere nivåer av mesenchymale proteiner sneglen og vimentin og lavere nivåer av E-cadherin i forhold til foreldre DU 145, som bestemmes av QRT-PCR (figur 1B). Ved stabil overekspresjon av full-lengde PTHrP- (1-173) i DU 145, ble vimentin og sneglen mRNA uttrykk forhøyet med 115 og 6,82 ganger, henholdsvis, mens E-cadherin uttrykk redusert beviselig av 2080 fold. Tilsvarende stabil overekspresjon av PTHrP- (1-141) økte vimentin og sneglen mRNA uttrykk ved 23,5 og 3,88 ganger, henholdsvis, og redusert E-cadherin uttrykk med 12,3 ganger. Dataene er vist med vill-type foreldre derivat som en kontroll. I et parallelt eksperiment, PTHrP-overuttrykke DU-145-celler viste en 6,06 gangers induksjon av snegl og 9,68 reduksjon av E-cadherin ekspresjon sammenlignet med den tomme vektoren transfekteres DU 145-derivat (data ikke vist). Induksjonen av EMT verifiseres av en immunofluorescens-analyse. Overexpressions av begge isoformer av PTHrP viser en reduksjon i E-cadherin med en økning i vimentin proteinekspresjon (figur 1C).
A) Kvantifisering av PTHrP-proteinnivåer i kontroll og PTHrP-overekspresjon DU-145-celler ved immunanalyse. B) mRNA uttrykk av PTHrP og EMT markører i kontroll og PTHrP-overekspresjon DU 145 celler. C) immunfluorescens bildene bekrefter overekspresjon av PTHrP, oppregulering av vimentin, og nedregulering av E-cadherin i PTHrP-overekspresjon DU 145 celler.
PTHrP knockdown Reduserer Expression of Mesenchymale Markers
for ytterligere å demonstrere regulering av EMT av PTHrP i prostata cancer, ble fast PTHrP knockdown via retroviral transduksjon utført i PC-3, en prostatakreft-cellelinje med høy ekspresjon basal PTHrP som bestemt ved immunologisk analyse (figur 2A). I PC-3-KD-celler, ble ekspresjon av PTHrP redusert til 15% av kontroll PC-3 (figur 2B), mens nivåene av sneglen og vimentin ble nedregulert ved 3,03 og 3,73 ganger, henholdsvis, og E-cadherin ekspresjon ble løftet av 2,30 ganger (figur 2B). Endringen i EMT proteinekspresjon er demonstrert med en immunofluorescens-analyse. Knocking ned PTHrP nedregulerer vimentin og oppregulerer E-cadherin, som bekrefter qPCR data (figur 2C). Sammen med figur 1, disse data tyder på at PTHrP aktivitet eller uttrykk fremmer EMT i prostatakreft.
A) Kvantifisering av PTHrP protein nivåer i kontroll og PTHrP-knockdown PC-3 celler ved immunoassay. B) mRNA uttrykk av PTHrP og EMT markører i kontroll og PTHrP-knockdown PC-3 celler. C) immunfluorescens bildene bekrefter overekspresjon av PTHrP oppregulering av vimentin, og nedregulering av E-cadherin i kontroll- og PTHrP-knockdown PC-3 celler.
PTHrP Regulerer invasjon og oppregulering av MMP-9
for å kunne fastslå at aktivering av PTHrP eller EMT resulterer i økt invasivitet i vårt eksperimentelle system, en matrigel invasjon analysen ble utført for å bestemme den relative invasivitet av DU 145-PTHrP (1-141), DU 145-PTHrP (1-173), og PC-3-KD-celler sammenlignet med deres respektive kontroller. DU 145-PTHrP (1-141) og DU 145-PTHrP (1-173) celler ble funnet å være 3,0 (p 0,01) og 2,9 (p .05) ganger mer invasive enn foreldre DU 145 celler, henholdsvis ( Figur 3A). I mellomtiden ble PC-3-KD-celler funnet å være bare 0,5 ganger (p 0,01) som invasiv som foreldre PC-3-celler (Figur 3B). I et parallelt eksperiment, PTHrP- (1-141) og – (1-173) DU-145-celler viste en 2.0 (p 0,5) og 2,1 ganger (p 0,05) økning i matrigel invasjon i forhold til den tomme vektor- transfektert DU 145-derivat henholdsvis (data ikke vist). Til slutt ble PTHrP overekspresjon i DU 145 observert å oppregulere ekspresjonen av MMP-9 med 17,1 og 7,10 ganger i PTHrP- (1-141) og PTHrP- (1-173) som uttrykker derivater, henholdsvis, mens knockdown i PC-3 downregulated MMP-9 med 25,1 ganger (Figur 3C).
A) Matrigel invasjonen analysen viser økning i invasjonen av DU145 cellene ved overekspresjon av enten PTHrP 1-141 eller 1-173. B) Matrigel invasjonen analysen viser nedgang i invasjonen av PC3 celler på knockdown av PTHrP. C) mRNA nivåer av MMP-9 i PTHrP-overekspresjon DU145 celler og PTHrP-knockdown PC3 celler i forhold til sine respektive kontroller. * Indikerer p 0,05, ** indikerer p. 0,01
PTHrP Fremmer tumorvekst og Bone Destruction i en ortotopiske /Intraosseøs Mouse Model
DU 145 og DU 145- PTHrP (1-173) celler ble stabilt transfektert med et GFP ekspresjonsplasmid og implantert orthotopically i prostata sjikt av nakne mus eller direkte inn i ben, som tidligere beskrevet (1). Selv om alle mus dannet tumorer, de implantert med DU 145-PTHrP (1-173) celler dannet betydelig større svulster sammenlignet med de injisert med normale DU 145 celler. Representative bildene viser omfattende tumormasse i mus injisert med DU 145-PTHrP (1-173) celler sammenlignet med mus injisert med foreldre DU 145 (figur 4A). I tillegg ble metastase til ryggraden observert i en av musene injisert med DU-145-PTHrP (1-173), mens ingen mus injisert med DU-145 dannet metastaser (figur 4B). DU 145 eller DU 145-vektorceller dannes ingen svulst når injisert i mus skinneben mens DU 145-PTHrP (1-141) eller DU 145-PTHrP (1-173) celler injisert i mus skinneben resulterte i tumordannelse, invasjon og ødeleggelse av ben (figur 5), noe som bekrefter den vel etablerte rollen til PTHrP i benresorpsjon. Til slutt, ble uttrykket av PTHrP i tumorer bekreftet av immunhistokjemi (figur 5B).
A) ortotopiske musemodell som viser en mus injisert med DU145-GFP celler. B) mus injisert med DU 145-PTHrP (1-173) celler. C) Bevis på bein ødeleggelse i mus injisert med DU-145-PTHrP (1-173) celler. D) Spine metastase i en mus injisert med DU-145-PTHrP (1-173) celler.
A) X-ray og UCT bilder som viser effekten av PTHrP overekspresjon på bein ødeleggelse i en intraossøs mus modell. Tibia av mus som fikk PTHrP-overekspresjon DU 145 vises betydelig ødeleggelse av bein i forhold til kontroll. B) Den DU-145-GFP-PTHrP1-173 prostata svulst ble fjernet fra mus, fiksert og farget for immunhistokjemisk PTHrP ved hjelp av en biotin-streptavidin-pepperrot-peroksidase-systemet (brunt reaksjonsprodukt som indikerer PTHrP uttrykk).
diskusjon
Vi har identifisert PTHrP ikke bare som en kritisk formidler av tumorprogresjon i prostatakreft, men også som en formidler av EMT. Mens PTHrP har vist seg å indusere EMT i utvikling [10], [31], vår observasjon at det fremmer EMT i kreft i tillegg gjenstår et nytt funn. Denne oppdagelse medfører at PTHrP kan ha en enda mer betydelig rolle i progresjon av kreft enn tidligere antatt, siden evnen til å regulere EMT innebærer mulighet for å regulere en rekke egenskaper i forbindelse med progresjon av kreft inkludert invasjon, metastase, celle-motilitet, celle-adhesjon , angiogenese, og stemness /tumorigenisitet [11], [18], [32] – [34]. Prognosen for prostatakreft forblir dårlig på grunn av hyppig beinmetastase og invasjon [35], [36]. Dermed målretting av PTHrP kan føre til mer effektiv behandling for prostatakreft.
Våre data viste at PTHrP overekspresjon i DU 145 celler indusert EMT og fremmet invasjon, tumorigenitet, og metastaser, mens PTHrP knockdown i PC-3 celler induserte motsatte virkninger. Videre observerte vi at PC-3-cellelinjen har høy basal ekspresjon av PTHrP som bestemmes av PTHrP immunoanalyse og er iboende metastatisk og invasive i forhold til DU 145, som har lav basal ekspresjon PTHrP. Disse observasjonene posit at PTHrP kan ikke bare legge til rette for metastase ved å fremme benresorpsjon, men kan også være en viktig regulator av aggressive fenotype i prostatakreft. Både 1-141 og 1-173 isoformer av PTHrP ble funnet å fremme EMT, i samsvar med det faktum at den klassiske aktive setet ligger i nærheten av den amino-terminale ende slik som vist med tidligere studier [37]; kan imidlertid ytterligere bearbeidet peptider av PTHrP også være viktige formidlere av denne handlingen. Rettet mot alle isoformer av PTHrP for anti-kreft terapi kan nødvendig, men målretting av 1-141 isoformen kan være av størst betydning som det står for majoriteten av PTHrP uttrykk hos mennesker.
Nedstrøms mål som aktiveres av PTHrP inkluderer Snail, AP-1, CREB, ERK1 /2, VEGF, PI3K /Akt og cyclin D1 [20], [38] – [45]. Snail fremmer EMT gjennom direkte transcriptional undertrykkelse av E-cadherin [15]. CREB oppregulerer VEGF som igjen fremmer EMT, invasjon og angiogenese [46], [47]. Den PI3K /Akt veien er en viktig regulator av cellevekst og har også blitt vist å indusere EMT i en rekke kreftformer [48]. AP-1 ble vist å være involvert i TGF-β-indusert EMT [49]. Overekspresjon av cyclin D1 har vist seg å indusere gliom invasjon ved å øke metalloproteinase-aktivitet og celle motilitet [50]. Rådende studier viser at PTHrP, TGF-β, EGF, og VEGF samarbeider gjennom aktivering av ERK1 /2 for å indusere EMT under nedsatt fibrogenese [19], og at sneglen er en umiddelbar tidlig mål av PTHrP i murine parietal endoderm formasjon [20]. Ett eller en kombinasjon av disse reaksjonsveier er egnet til å forklare induksjon av EMT og invasjon som ble observert i våre eksperimenter, hvor vi bekreftet induksjon av sneglen av PTHrP. Selv om det tidligere er blitt vist at PTHrP er i stand til å oppregulere snegle transkripsjon i fravær av de novo proteinsyntese [20], er det fortsatt uklart om denne effekten er ved direkte binding til sneglen promoteren eller ved aktivering av signalveier som Akt at er kjent for å regulere Snail. Uansett, vil videre studier være nødvendig for å bekrefte mekanismen for PTHrP-indusert EMT i prostata kreft.
Det er mulig at forskjellige andre reaksjonsveier er avhengige av PTHrP for å fremme EMT, invasjon og metastase. TGF-β, en potent induser av EMT, er vist i brystkreft for å fremme PTHrP-ekspresjon som resulterer i bendestruksjon [21]. Ulike teinene inkludert Ras, tpr-Met, Src har alle vist seg å målrette PTHrP og har også vist seg roller i EMT, invasjon og metastasering [51] – [53]. Av spesiell interesse vil være Indian hedgehog, som er kjent for å regulere PTHrP under tidlig ben- og bruskvekst [54], [55]. Medlemmer av pinnsvin-familien er avvikende aktivert i en rekke krefttyper, inkludert prostata cancer, har vist seg å indirekte fremme EMT, og er en teori for å ha en rolle i transformasjonen av voksne stamceller til kreft stamceller [56] – [59] . Det ville være interessant å finne ut om Ihh avhengig PTHrP for induksjon av EMT og andre maligne egenskaper i kreft.
Pågående forskning fortsetter å forsterke teorien om at kreftstamceller er de viktigste driverne av kreft progresjon og viktige faktorer som bestemmer terapeutisk respons [60]. Dermed et viktig spørsmål å vurdere er om PTHrP kan regulere prostata kreft stamceller gjennom en EMT-mediert veien. Som EMT har vist seg tidligere å indusere kreft stamcelleegenskaper [18], følger det at PTHrP skal potensielt kunne regulere stamcelleegenskaper i prostatakreft og dermed kan være en verdifull terapeutisk mål for forebygging av tilbakefall og metastasering. Prostata kreft stamceller har tidligere blitt isolert og karakterisert av en CD44
+ /CD133
+ /α2β1
hi fenotype [61]. Fremtidig arbeid må fokusere på evnen av PTHrP å regulere dette kammer i prostata kreft.
Oppdagelsen av at PTHrP induserer EMT mens fremme invasjon og tumorvekst tyder på at behandling som er rettet mot PTHrP kan brukes i forbindelse med konvensjonelle behandlinger for hemme invasjon og metastasering i prostata kreft, spesielt for tilbakevendende svulster. Vi har tidligere vist et bibliotek av forbindelser og identifisert flere som er i stand til å inhibere PTHrP ekspresjon og cellevekst i lungekreft [62]. Det ville være av stor klinisk interesse for å utvide disse resultatene til prostata kreft og for å bestemme hvorvidt slike stoffer er også i stand til å blokkere PTHrP-indusert EMT og invasjon. I mellomtiden kan ytterligere innsats for å karakterisere trasé som er involvert i PTHrP-indusert EMT føre til belysning av en rolle for PTHrP i kreftstamcelle utvikling og nye behandlingsformer som kan forbedre prognosen av metastatisk prostatakreft (1, 57).
