Abstract
Å utvikle Sero-diagnostiske markører for lungekreft, vi genererte monoklonale antistoffer ved hjelp av lunge adenokarsinom (AD) avledede A549 celler som antigener av ansette tilfeldig immunisering metoden. Hybridomsupernatanter ble immunohistochemically screenet for antistoffer med Amex-faste og parafininnstøpte A549 cellepreparater. Positive kloner ble monocloned to ganger gjennom begrensende fortynninger. Fra de oppnådde monoklonale antistoffene, valgt vi et antistoff betegnet som KU-Lu-5 som viste intens membranfarging av A549-celler. Basert på immunoprecipitation og Madli TOF /TOF-MS analyse, var dette antistoffet anerkjent som karboanhydrase XII (CAXII). For å vurdere nytten av dette antistoffet som en sero-diagnostisk markør for lungekreft, utførte vi dot blot analyse med et treningssett bestående av sera fra 70 lungekreftpasienter og 30 friske kontroller. De CAXII uttrykk nivåer var signifikant høyere hos lungekreftpasienter enn hos friske kontroller i treningssettet (P 0,0001), og området under kurven for ROC var 0,794, med 70,0% spesifisitet og 82,9% sensitivitet. I lungekrefttilfellene, uttrykk nivåer av CAXII var signifikant høyere hos pasienter med plateepitelkarsinom (SCC) enn med AD (P = 0,035). Videre CAXII var betydelig høyere i brønn og moderat differensierte SCCS enn i dårlig differensierte de (P = 0,027). For ytterligere å bekrefte nytten av serum CAXII nivå som en sero-diagnostisk markør, ble et ekstra sett bestående av sera fra 26 lungekreftpasienter og 30 friske kontroller også undersøkt av dot blot analyse som en valideringsstudie. Serum CAXII nivåer var også signifikant høyere hos lungekreftpasienter enn hos friske kontroller i valideringssettet (P = 0,030). Derfor bør serum CAXII nivåene være gjeldende markører diskriminerende lungekreftpasienter fra friske kontroller. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som beviser at CAXII kan være en roman sero-diagnostisk markør for lungekreft
Citation. Kobayashi M, Matsumoto T, Ryuge S, Yanagita K, Nagashio R, Kawakami Y , et al. (2012) CAXII Er en Sero-diagnostisk markør for lungekreft. PLoS ONE 7 (3): e33952. doi: 10,1371 /journal.pone.0033952
Redaktør: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, USA
mottatt: 23 september 2011; Godkjent: 20 februar 2012; Publisert: 16 mars 2012
Copyright: © 2012 Kobayashi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av en Grant-in-Aid for Scientific Research Council (23590414) fra Japan Society for Promotion of Science, tilskudd fra tredje periode omfattende kontroll Forskning for Cancer utført av Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan , samt fra Research Project (nr 2011-1006) av School of Allied Health Sciences, Kitasato University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall. , bestående av 13% (1,6 millioner kroner) av den totale krefttilfeller og 18% (1,4 millioner) av kreftdødsfall i verden i 2008 [1], [2].
svulst markørene er påvist i sera , urin, og vev fra pasienter med maligne svulster, og kan brukes til en eksakt diagnose, diskriminering av godartede eller ondartede svulster, oppfølging etter behandling, og prediksjon av pasientens utfall. For tiden er enkelte Sero-diagnostiske markører som brukes for lungecancer, for eksempel karsinoembryonisk antigen (CEA) og sialyl Lewis X-antigen (SLX) for adenokarsinom (AD), og cytokeratin 19 fragment (Cyfra) og squamous cell carcinoma antigen (SCCa) for plateepitelkarsinom (SCC) [3]. De positive tallene for CEA, SLX, Cyfra, og SCCa er angivelig 57, 40~50, 50~60, og 60-80%, henholdsvis. Imidlertid er det blitt rapportert at disse markørene ikke viser tilstrekkelig tumor eller organ spesifisiteter; for eksempel kan SLX viser falske positive resultater i nærvær av lungetuberkulose og pulmonal fibrose, og Cyfra kan heve med interstitiell lungebetennelse og nyresvikt.
Antistoffer blir vanligvis utviklet ved hjelp av rensede proteiner eller syntetiske peptider. Vi har uttømmende generert monoklonale antistoffer (MoAb) mot en rekke tumor-assosierte proteiner ved hjelp av pulmonal AD-avledet A549 cellen som et antigen med det tilfeldige immuniseringsmetoden [4], og over 1000 MoAb er blitt oppnådd [5]. Denne fremgangsmåte forventes å generere antistoffer mot proteiner med tumorspesifikk post-translasjonelle modifikasjoner, som er vanskelig å oppnå ved konvensjonelle immuniseringsfremgangsmåter.
karboanhydrase XII er et transmembran sink metalloenzyme som katalyserer den reversible hydratisering av karbondioksyd å danne bikarbonat (H
2o + CO
2⇔H
++ HCO
3
-), og er medlem av alfa karboanhydrase (CA) familie. CAXII blitt foreslått å være involvert i surgjøringen av det ekstracellulære mikromiljøet, som er egnet for hurtig tumorvekst. CAXII overekspresjon ble først påvist i nyrecellekarsinom, og påfølgende studier bekreftet dets ekspresjon i forskjellige humane kreftformer, slik som diffus astrocytom, bryst, pankreatisk, og eggstokk-karsinom, så vel som i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [6] – [11]. Dens uttrykk ble påvirket både av forhold knyttet til differensiering og hypoksi i brystkreft
in vivo
, og var assosiert med en mer gunstig prognose i invasiv brystkreft pasienter [12]. Høyere CAXII uttrykk ble også korrelert med en bedre samlet og sykdomsspesifikk overlevelse hos pasienter med resectable NSCLC [13]. Imidlertid har ingen studie avklart CAXII i sera og klinisk nytte som en sero-diagnostisk markør for pasienter med ondartede svulster.
I denne studien ble spesifisiteten av den oppnådde anti-CAXII antistoff bekreftet av immunhistokjemi (IHC ) og immunblotting med lungekreft cellelinjer og lungekreft vev. For ytterligere å bekrefte sin nytte som en sero-diagnostisk markør, ble CAXII nivåer i serum fra pasienter med lungekreft studert ved dot blot analyse.
Materialer og metoder
1. Cellelinjer
A549 og LC-2 /annonse celler avledet fra lunge AD ble kjøpt fra den japanske Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan) og Riken Bioresource senter (Ibaraki, Japan), henholdsvis. De RERF-LC-AI celler avledet fra lunge SCC ble kjøpt fra Riken Bioresource Center. De N231 celler avledet fra SCLC ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). LCN1, en stor celle nevroendokrin carcinom (LCNEC) linje, ble etablert i vårt laboratorium [14]. Disse cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma, Steinheim, Tyskland) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; BioWest, Miami, FL, USA), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ( GIBCO, Auckland, New Zealand). Etter høsting og vasking to ganger med fosfat-bufret saltoppløsning uten divalente ioner (PBS), ble sub-konfluente celler lagret ved -80 ° C for analyse proteomforskning eller fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin for immunhistokjemi. A549 celler ble også Amex-fast [15] for immunhistokjemisk screening. De SP2 /O-AG14 celler avledet fra en mus myelom ble kjøpt fra Riken Bioresource Center, og ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 1 x 8-azaguanin (50 × Hybri-Max, SIGMA), 10% FBS, penicillin og streptomycin.
2. Etikk uttalelse
Alle prøver ble samlet inn i samsvar med de etiske retningslinjene og skriftlig samtykke mandat, og denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Kitasato University School of Medicine. Alle pasienter og friske kontroller ble kontaktet basert på vedtatte etiske retningslinjer, og de som gikk med på å delta i denne undersøkelsen ble bedt om å signere samtykkeerklæringer. Pasienter kan nekte oppføring og avslutte deltakelsen når som helst. Alle deltakerne gitt skriftlig samtykke.
2,1. Sera
Sera fra 70 pasienter med lungekreft. (AD: 29, SCC: 21, SCLC: 17, og LCNEC: 3) og 30 friske kontroller ble brukt i treningssettet. I tillegg er en valideringssettet bestående av sera fra 26 pasienter med lungekreft (AD: 20, SCLC: 5, og LCNEC: 1) og 30 friske kontroller ble også undersøkt. De clinicopathological kjennetegn ved pasientene data er oppsummert i tabell 1.
Pasient sera ble samlet ved Kitasato universitetssykehus, og sunt kontrollsera ble gitt av Kyowa MEDEX Co., Ltd (Tokyo, Japan) og holdt ved -80 ° C inntil bruk.
3. Generering av monoklonale antistoffer
A549 cellelysat ble utarbeidet med PBS (-) ved hjelp av en ultrasonisk homogenisator (UH-50; SMT Company, Tokyo, Japan). Fem uker gamle hunn BALB /c-mus ble immunisert intra-peritonealt med 50 mg våtmarksvektprosent A549 cellelysat i 500 ul PBS (-) 3 ganger med et to ukers intervall. Antistofftiteret ble testet ved IHC ved bruk av 100 ganger fortynnet serum fra de immuniserte mus som første antistoff på Amex-faste A549 celler. Tre dager før cellefusjon, dyret med den høyeste titer ble intra-peritonealt forsterket av den samme mengde av A549 lysat. Hybridom forberedelse og IHC screening med Amex-faste A549 celler ble tidligere beskrevet [4], [5].
4. Proteomikk analyse
4,1. Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).
Proteiner ble ekstrahert fra hver av A549, LC-2 /ad, RERF-LC-AI, N231, og LCN1 celler med detergent lyseringsbuffer [16 ] ved hjelp av en ultrasonisk homogenisator. Ti ug av hver av ekstraherte proteiner ble kokt og separert ved SDS-PAGE med 10% polyakrylamid-gel ved en konstant strøm på 20 mA. Etter SDS-PAGE ble proteiner i gelene overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) for immunoblotting.
4,2. Immunoblotting.
blotting Membranene ble blokkert med 0,5% kasein fra bovin melk (Sigma, St. Louis, MO, USA) i 30 minutter ved RT. Membranene ble deretter omsatt med ikke-fortynnet hybridomsupernatant i 1 time ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med 1.000 ganger fortynnet pepperrot-peroksidase-konjugert kanin anti-mus IgG polyklonalt antistoff (Dako, Glostrup, Danmark) med 0,025% kasein i 45 min ved RT. Endelig signalene ble utviklet ved hjelp av Immobilon Western HRP reagens (Millipore Corp.).
4,3. Fastsettelse av antistoff isotype.
For å bestemme isotypen av den etablerte KU-Lu-fem antistoff, brukte vi IsoStrip ™ monoklonalt antistoff Isotyping Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
4,4. Immunoutfelling.
immunoutfelling metoden som brukes i denne undersøkelsen er tidligere beskrevet [17]. I korte trekk, ble A549-cellene vasket med PBS (-) og behandlet med radioimmunopresipitasjonsanalyse analyse (RIPA) buffer inneholdende Complete mini-EDTA-fri (Roche Diagnostics) på is i 30 min. Etter sentrifugering ved 15 000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C, supernatanten ble oppsamlet og klaret med protein G Sepharose (50% oppslemming) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA) ved 4 ° C over natten. Å bøye det primære antistoff, ble 250 ul av primært antistoff (KU-Lu-5 hybridomsupernatant) og 20 ul av protein G-Sepharose-kuler suspendert i RIPA-buffer inkuberes under omrøring ved 4 ° C over natten. Etter sentrifugering antistoff-sepharose-konjugat og 500 ug totalt, cellulært protein fra klaret supernatanten ble inkubert under omrøring ved 4 ° C i 4 timer. Immunopresipitatene ble oppsamlet ved sentrifugering ved 15.000 rpm i 5 min ved 4 ° C. Etter vasking fire ganger med RIPA-buffer, supernatanten ble forsiktig fjernet og pelletene ble resuspendert i 15 ul av 1 x Laemmili buffer. Deretter ble 15 ul av prøver kokt og separert ved SDS-PAGE med 10% polyakrylamid-gel. Etter SDS-PAGE, geler var Zn-farget med Negative Gel Stain MS sett (Wako Pure Chemical, Tokyo, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner.
4,5. Identifikasjon av antigen protein.
4.5.1. I-gel fordøyelse.
Protein base ble skåret ut fra SDS-PAGE-gel og hakket til 1 mm
3, avfarget med avfarging oppløsning (Wako Pure Chemical), dehydrert med 100% (v /v) ACN og tørket under vakuumbetingelser. Tryptisk fordøyelse ble utført med et minimalt volum av fordøyelse oppløsning som inneholdt 20 ng /ul trypsin (Trypsin gull, massespektrometri Grade, Promega, Madison, WI, USA) og 25 mM NH
4HCO
3 i 24 timer ved 37 ° C. Etter inkubering ble fordøyd proteinfragmenter eluert i oppløsning oppsamlet, og gelene ble vasket en gang i 5% (v /v) trifuloroacetic syre /50% (v /v) ACN og samles opp i det samme rør.
4.5.2. . Protein identifikasjon
De oppsamlede peptidfragmenter ble analysert ved hjelp av autoflex III matriks-assosiert laserdesorpsjon /ionisering-flyvetid /flukttiden massespektrometri (MALDI-TOF /TOF-MS: Bruker Daltonik, Bremen, Tyskland). En engangs tallerken, flekket α-cyano-4-hydroxycinnamic syre matrise for prøver, og PAC Peptide Calibstandard for kalibrering (Prespotted AnchorChip 96 satt for Proteomics, Bruker Daltonik) ble anvendt. Peptid masse fingeravtrykk (PMF) ble målt, og deretter et par topper hentet fra PMF ble videre målt for deres tandem massespektra som forelder massene. MASCOT (https://www.matrixscience.com) ved hjelp av IPI Menneskelig database (93,289 sekvenser; 36,994,704 rester), utgitt den 3. mai 2011 (https://www.matrixscience.com), ble brukt til å bestemme proteiner fra PMF og tandem masse data.
5. Immunoblot-analyse med rekombinant protein CAXII
Rekombinant CAXII protein og Venus protein som en negativ kontroll med GST-tag ble fremstilt ved anvendelse av en hvetekim cellefritt system [18]. Fjorten ug hver av rekombinant CAXII og Venus proteiner ble kokt og separert med SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting med KU-Lu-5-antistoff, som nevnt i 2.4.1.
6. Immunhistokjemisk farging
Tre-mikrometer tykke seksjoner, laget av 10% formalinfiksert og parafininnstøpte lungekreftcellelinjer og 37 kirurgisk resected lungekreft (AD: 28, SCC: 9) ble deparaffinized i xylen, rehydrert i en avtagende etanol serie, og deretter behandlet med 3% hydrogenperoksid i 20 min. Etter at antigenet ble hentet ved autoklavering i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0) med 0,1% Tween 20 ved 121 ° C i 10 minutter, ble seksjonene omsatt med ikke-fortynnet KU-Lu-5 hybridomsupernatant for 16-18 timer ved romtemperatur (RT). Etter skylling i TBS tre ganger i 5 minutter hver, ble seksjonene omsatt med ChemMate Envision reagens (Dako) i 30 minutter ved RT. Til slutt ble seksjonene visualisert med Stabil DAB-løsning (Invitrogen Corp.) og kontra med Mayers hematoksylin.
7. Dot blot analyse
7,1. Prøveopparbeidelse.
7.1.1. Fjerning av albumin og IgG fra serumprøver.
Fjerning av albumin og IgG fra sera ble utført ved anvendelse av en ProteoExtract Albumin /IgG fjerning kit (Merck, Darmstadt, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. En 60 ul prøve av hver sera ble fortynnet med 540 ul av bindingsbuffer, og tillates å passere kolonnen ved tyngdekraftstrøm. Gjennomstrømningsfraksjonen ble oppsamlet i et oppsamlingsrør. For å vaske kolonnen, ble bindingsbuffer tillatt å passere kolonnen ved tyngdekraftstrøm. Gjennomstrømnings fraksjon ble samlet i samme oppsamlingsrøret.
7.1.2. Avsalting og konsentrering ved ultrafiltrering.
Den albumin- og IgG-utarmet prøvene ble buffer-byttet og konsentrert ved anvendelse av 10-kDa molekylvekt cut-off ultrafiltrering VIVASPIN 2 (Sartorius, Gottingen, Tyskland). Prøvene ble sentrifugert ved 6000 x g ved 4 ° C inntil mindre enn 100 ul, og deretter buffer ble byttet ut med PBS (-) med konsentrasjon ved 6000 x g ved 4 ° C inntil konsentrert til mindre enn 50 pl. De konsentrerte prøver ble regulert til et endelig volum på 60 ul med PBS (-).
7,2. Dot blot-analyse
En ul hver av albumin- og IgG-utarmet prøvene fortynnet til 1:20 med PBS. (-) Og muse-IgG (renset i vårt laboratorium) for en positiv kontroll ble oppdaget på en PVDF-membran (Millipore Corp.) under anvendelse av det automatiske dot blot-system med en 256-faststoff pin-konfigurasjon (Kakengeneqs Inc., Chiba, Japan). To ark av membranen ble fremstilt for ett sett av forsøket. Flekket Membranene ble vasket i TBS i 10 minutter, og blokkert med 0,5% kasein (Sigma) i 1 time ved RT. En Membranen ble deretter omsatt med ikke-fortynnet KU-Lu-5 hybridomsupernatant, og den andre membranen ble omsatt med antistoff fortynnende oppløsning [20-ganger fortynnet 0,5% kasein med 0,1% Tween 20 tilsatt TBS (TBS-T)] i 30 min ved RT. Etter skylling i TBS-T 3 ganger i 5 minutter hver, ble membranene inkubert med 1.000 ganger fortynnet pepperrot-peroksidase-konjugert kanin anti-mus IgG polyklonalt antistoff (Dako) i 30 minutter ved RT. Endelig signaler ble utviklet med Immobilon Western reagens (Millipore Corp.). Dataene ble analysert ved hjelp DotBlotChipSystem Ver. 4.0 (Dynacom Co., Ltd., Chiba, Japan). Hver normaliserte signal ble presentert som forholdet mellom den positive intensitet i forhold til bakgrunnen negativ intensitet.
8. Statistisk analyse
Serum CAXII nivåer hos pasienter med lungekreft og friske kontroller ble statistisk analysert med Mann-Whitney
U
-test. Sensitivitet, spesifisitet og prediktive verdier ble beregnet med SPB programvarepakken (Ver. 9.42 for Windows) for hver variabel på en tilsvarende cut-off. Diskriminant funksjonsanalyse ble utført for å klassifisere pasientene i «lungekreft» vs «sunn kontroll» gruppe, i henhold til status for biomarkører, ved hjelp av SPB programvarepakken. Arealet under kurven (AUC) og beste cut-off point ble beregnet ansette mottaker drift karakteristikk (ROC) analyse. Resultatene ble betraktet som signifikant når
P
. 0,05
Resultater
1. Bekreftelse av antistofftiter i musesera
Antistofftiteret ble testet ved IHC med 1.000 ganger fortynnet sera fra immunisert mus som første antistoff på Amex-faste A549 celler. Som et resultat av sera fra immuniserte mus inneholdt antistoffer som reagerte med forskjellige komponenter av A549-celler.
Ved hjelp av Amex-fikserte A549 cellepreparater for immunhistokjemisk screening av hybridomer, vi endelig etablert 188 MoAb i total og en ytterligere studien ble utført med den KU-Lu-5-klon som viste intens farging i A549-celler (Fig. 1 A).
(A) antistofftiter ble testet immunohistokjemisk ved hjelp av 1000-ganger fortynnet sera fra immuniserte mus som det første antistoff på Amex-faste A549-celler, som ble anvendt som et immunogen. Sera fra immuniserte mus inneholdt antistoffer som reagerte med forskjellige cellekomponenter, slik som nucleus (↑), plasmamembranen (▴), og cytoplasma (↑↑). (B) Immunpresipitasjon med KU-Lu-fem antistoff. Immunoblot-analyse ved hjelp av KU-Lu-5 hybridomsupernatant som det første antistoff [kjørefelt 1: A549 lysat, felt 2: A549 lysat kombinert med protein G, felt 3: KU-Lu-5-antistoff i kombinasjon med protein G, spor 4: A549 lysat kombinert med KU-Lu-fem antistoff]. Baner 2 til 3 er negative kontroller, og immunopresipitert produkt med KU-Lu-5-antistoffet ble påvist i spor 4 (↑). (C) Bekreftelse av identifiserte antigen protein. KU-Lu-fem antistoff reagerte med rekombinant CAXII protein (64 kDa), men ikke med rekombinant Venus protein.
2. Identifikasjon av antigen protein
For å identifisere antigenet protein gjenkjent av KU-Lu-fem antistoff, utførte vi IP med lysat fra A549 celler. Resultatene av IP-er vist i fig. 1 B, C. Den antigene protein ble observert ved omtrent 40 kDa. For å bestemme antigen protein gjenkjent av KU-Lu-fem antistoff, vi skåret ut og samlet stedet fra Zn-farget gel, og fortsatte med i-gel fordøyelsen. Etter analyse ved anvendelse av et MALDI-TOF /TOF MS og en MASCOT søk, ble proteinet bestemt som isoform 2 av karboanhydrase XII (CAXII, tiltredelse: IPI00221392), som består av 343 aminosyrer med en antatt molekylvekt på 38384 Da. Resultatet ble bekreftet ved immunblotanalyse med rekombinant CAXII protein ved hjelp av KU-Lu-5 hybridomsupernatant som det første antistoff (fig. 1 D). Den immunoglobulin isotype av KU-Lu-fem antistoff ble bestemt som IgG
1, κ.
3. Immunoblot analyse
Uttrykk for CAXII ble påvist kun i A549 celler som en omtrent 40 kDa protein, og ingen klar bånd ble påvist i andre celler brukt i denne studien (Fig. 2 A).
(A) Immunoblot-analyse av CAXII i lungecancercellelinjer. CAXII ble detektert som en tilnærmet 40-kDa-protein med A549-celler. (B) Farging av CAXII i A549 celler (a), adenokarsinom (b), og plateepitelkarsinom (c) av lungene, og hvert viste membran farging av CAXII.
4. Immunhistokjemisk farging for CAXII
immunohistochemically, membran uttrykk for CAXII ble kun observert i A549 celler (Fig. 2 B). Membran farging ble påvist i to av de 28 reklame (7,1%) og i to av de 9 SCCS (22,2%) (Fig. 2 C, D).
5. Serum CAXII hos pasienter med lungekreft
Serum CAXII nivåene var signifikant høyere hos lungekreftpasienter enn hos friske kontroller i treningssettet (P 0,0001). Relative verdier av serum CAXII nivåer varierte 0,101 til 4,01 (median: 1,520) i lungekreftpasienter, men 0,006 til 1,679 (median: 0.290) hos friske kontroller (Fig. 3 A). I lungekreft, CAXII serumnivåer av SCC pasienter som var betydelig høyere enn de av AD pasienter (P = 0,03) (fig. 3 A). Arealet under ROC-kurven (AUC) mellom lungekreft og friske kontroller var 0,794 (fig. 3 B). Når optimal cut-off-verdi på 0,387 for CAXII var påført, ble diagnostisk sensitivitet og spesifisitet for lungekreft var 82,9 og 70,0, henholdsvis, og de negative og positive prediktiv verdi var 0,617 og 0,863, respektivt. Videre innenfor SCCS, serum CAXII nivåene var signifikant høyere hos pasienter med brønn og moderat differensierte svulster enn de med dårlig differensierte de (P = 0,027) (fig. 4 A), og hadde en tendens til å være høyere hos pasienter med tumor størrelse mindre enn 3 cm i stedet for mer enn 3 cm (p = 0,0538). Imidlertid var det ingen forskjell i røke historie av pasienter (fig. 4 b). CAXII nivåer i stadium I, II og III annonsene var 1,501, 0,704 og 1,001, henholdsvis, og CAXII nivåer i stadium I, II og III SCCS var 1,764, 2,093 og 1,854, henholdsvis. Disse dataene ble sammenfattet i tabell 2. Det ble identifisert noen relasjoner mellom CAXII serumnivåer og tumorstadium eller tilstedeværelse av metastaser for enten annonser eller SCCS. For ytterligere å bekrefte nytten av serum CAXII nivå som en sero-diagnostisk markør, ble 56 flere prøver av sera analysert ved dot blot analyse som en valideringsstudie. De serum CAXII nivåene var også betydelig høyere i lungekreftpasienter enn hos friske kontroller i valideringssettet (P = 0,030). Relative verdier av serum CAXII nivåer varierte 0,000 til 8,023 (median: 3,921) i lungekreftpasienter, men 0,000 til 8,331 (median: 2,806) hos friske kontroller (Fig. 5). Når optimal cut-off verdi på 3,086 for brukt, diagnostisk sensitivitet og spesifisitet for lungekreft var 65,4 og 70,0, henholdsvis.
Serum CAXII nivåer hos pasienter med lungekreft og friske kontroller. (A) Median CAXII nivået i sera fra friske kontroller var 0,29, og at det i sera fra lungecancerpasienter var 1,52. Serum CAXII nivåene var signifikant høyere hos lungekreftpasienter (* P 0,001). Videre serum CAXII nivåene var høyere i SCCS enn ADS (** P = 0.0381). (B) Mottaker ende karakteristikk analyse av CAXII som et serum markør for lungekreft. De tilsvarende områder under kurvene var 0,794 for CAXII. Med en 70,0% spesifisitet, sensitivitet av CAXII for lungekreft var 82,9%, ved en cut-off verdi tilsvarende 0,387.
(A) CAXII nivåer i sera fra pasienter med annonser og SCCS med et fokus på scenen og differensiering. I SCCS, CAXII nivåene var signifikant høyere i brønn og moderat differensierte svulster enn i dårlig differensierte de (*** P = 0,0272). I annonser, ble ingen signifikant forskjell basert på differensiering grad oppdaget. (B) Røyking historie i lungekreftpasienter. Median CAXII nivået i sera fra ikke-røykerne var 1,56, og som hos røykere var 1,54, og viser ingen signifikant forskjell.
For å bekrefte nytten av serum CAXII nivåer som en sero-diagnostisk markør, 56 ekstra sera ble analysert ved dot blot analyse som en valideringsstudie. De serum CAXII nivåene var også betydelig høyere i lungekreftpasienter enn hos friske kontroller (p = 0,030). Relative verdier av serum CAXII nivåer varierte 0,000 til 8,023 (median: 3,921) i lungekreftpasienter, men 0,000 til 8,331 (median: 2,806) hos friske kontroller
Diskusjon
.
i denne studien tar sikte på å oppdage nyttige Sero-diagnostiske markører for lungekreft, genererte vi monoklonale antistoffer ved hjelp av lunge AD-avledet A549 celler som antigener. Fra de oppnådde 188 antistoffer, fokuserte vi på et antistoff som gjenkjenner CAXII, og utforsket den kliniske nytte som en sero-diagnostisk markør for lungekreft. Dette tilfeldig immunisering metoden er ventet å gi antistoffer mot tumor-spesifikke proteiner med post-translasjonelle modifikasjoner, som er vanskelig å oppnå ved konvensjonelle immuniseringsmetoder. Egentlig har flere forfattere rapportert at monoklonale antistoffer som genereres ved denne fremgangsmåte er nyttige som diagnostiske og prognostiske markører for cancer [5], [17], [19]. Battke
et al. Product: [20] etablert en 6A10 antistoff som gjenkjenner CAXII bruker en lignende immunisering metodikk. Imidlertid, de oppnådde antistoffene var begrenset til de som bare reagerer med celleoverflateantigener på grunn av ved hjelp av strømningscytometri for screening av hybridomer. I den foreliggende studien ble hybridomene immunhistokjemisk vist som rette for oppnåelse av antistoffer som reagerer med tumorassosierte proteiner lokalisert i flere intra-cellulære rom. CAS utgjør en familie av allestedsnærværende enzymer med viktige roller i mange fysiologiske og patologiske prosesser som omvendt katalysere omdannelsen av CO
2 + H
2o til HCO
3
– og H
+ og bidrar til regulering av intracellulær pH [6] – [11], [19]. Flere kliniske studier har vist en klar sammenheng mellom høy CAXII uttrykk nivåer i tumorceller og en gunstig prognose.
Watson
et al.
[12] rapporterte at CAXII ble uttrykt i 75% av invasiv brystkarsinomceller tilfeller, og er signifikant assosiert med en lavere histologisk grad (p = 0,001), østrogenreseptor positiv status (P 0,01), og negativ epidermal vekstfaktor-reseptor-overekspresjon (P 0,001). Ved hjelp av univariat analyse, ble CAXII-positive tumorer assosiert med en lavere tilbakefallsrate (P = 0,04) og et bedre OS (P = 0,01). På den annen side, var selv om 98% av astrocytomas immunhistokjemisk positiv for CAXII, høyere CAXII ekspresjonsnivåer var korrelert med en høyere histologisk karakter og en dårligere pasient resultat enten ved univariate (P = 0,010) eller multivariable (P = 0,039) overlevelsesanalyse [ ,,,0],9].
en immunhistokjemisk studie av uttrykk for CAXII i lungekreft ble rapportert av Ilie
et al.
[13]. CAXII overekspresjon ble observert i 105/555 tilfeller, og var signifikant assosiert med en bedre differensiering (P = 0,015) og SCC histologisk type (P 0,001). Videre høy CAXII uttrykk var også signifikant korrelert med bedre samlet og sykdomsspesifikk overlevelse. Fra våre resultater, CAXII nivåene var høyere i sera fra SCC pasienter enn annonser (Fig. 3 A). Dessuten korrelerer de mer gunstig med differensiering (fig. 4 A). Integrere disse resultatene, kan CAXII ikke bare være en kandidat vev markør, men også en sero-diagnostisk markør for lungekreft.
Selv om foreningen av CAXII uttrykk og clinicopathologic faktorer og pasientens utfall i ulike svulstene har blitt rapportert, til vår kunnskap, har ingen studier angående serum CAXII protein nivåer eller dets autoantistoffnivåer hos pasienter med svulster blitt rapportert.
for å bekrefte muligheten for CAXII som en sero-diagnostisk markør, vi målte sine serumnivåer hos pasienter med lungekreft og friske kontroller. Vi viste at CAXII protein strømmet ut i sera og nivåene hos pasienter med lungekreft var betydelig høyere enn hos friske kontroller i både treningssettet (P 0,0001) og valideringssett (P = 0,030). Det er mulig at gapet i den P-verdi mellom treningssettet og valideringssettet er forårsaket av det faktum at serumnivåer av CAXII av SCC pasientene var generelt høyere enn de av pasienter med andre histologier, og valideringssettet inkluderte ikke SCC tilfellet . Til sammen skal de serum CAXII nivåene være gjeldende markører diskriminerende lungekreftpasienter fra friske kontroller. Foreløpig CT scan eller brystet X-ray er den viktigste metoden for lungekreft screening [21]. Mazzone et al. antydet at blod og promilletester bør også inkluderes for lungekreft screening, fordi de er både lett å utføre og fri for risiko knyttet til test administrasjon [21], [22]. I denne studien, analyserte vi CAXII nivåer i sera fra lungekreftpasienter og friske kontroller ved anvendelse av monoklonalt antistoff, og resultatene antydet at serum CAXII nivået var et nyttig sero-diagnostisk markør for lungekreft.
