Abstract
Tykktarmskreft er en kreft som utvikler i tykktarm og endetarm vev. Prognosen for metastatisk tykktarmskreft er fortsatt dårlig, og nye terapeutiske alternativer er nødvendig for å redusere tykktarmskreft dødelighet. Nylig har intracellulære cAMP-nivåer blitt foreslått å påvirke oppførselen av kreftceller. Forbløffende nok syklisk fosfatidinsyre (CPA) og dets strukturelle analoger hemmer vekst i mange kreftcellelinjer, og vår tidligere arbeid har foreslått at CPA øker cAMP produksjon. Fosfodiesterase (PDE) type 3 isoformene PDE3A og PDE3B uttrykkes hovedsakelig i hjerte-og fettvev, henholdsvis. Videre økning i intracellulære cAMP-nivåer er blitt assosiert med inhibering av veksten i tykktarmskreftceller. Disse funnene antyder at CPA kunne brukes i tykktarmskreft terapi. I denne studien, har vi funnet at CPA hemmet veksten av HT-29-celler, som uttrykker høye nivåer av PDE3B, men ikke veksten av DLD-1-celler som uttrykker lave nivåer av PDE3B. Videre, CPA hemmet fosforylering av Akt i HT-29-celler på en doseavhengig måte. Våre resultater tyder på at PDE3B uttrykk og intracellulære cAMP-nivåer er korrelert med spredning av tykktarmskreftceller. Disse funnene viser for første gang at CPA kan tjene som en nyttig et molekyl i målrettet behandling for tykktarmskreft
Citation. Tsukahara T, Matsuda Y, Haniu H (2013) Cyclic fosfatidsyre Stimulerer cAMP Produksjon og hemmer vekst i Human Colon kreftceller. PLoS ONE 8 (11): e81139. doi: 10,1371 /journal.pone.0081139
Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, USA
mottatt: 22 juni 2013; Godkjent: 18 oktober 2013; Publisert: 25.11.2013
Copyright: © 2013 Tsukahara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid for Scientific Research (C) 22591482 (til TT) fra Japan Society for Promotion of Science, Grant-in-Aid fra Takeda Science Foundation (til TT), Astellas grunnlag for forskning på stoffskiftesykdommer (til TT) og Nagano Society for Promotion of Science (til TT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Syklisk nukleotid fosfodiesterase (PDE) er et enzym som bryter fosfodiesterbindinger [1]. Hos mennesker er PDEs kodet av 21 PDE gener [1], som er delt inn i 11 familier basert på strukturelle likheter som protein sekvens homologi. PDEene omfatter en gruppe enzymer som spalter fosfodiester bindingen i andre messenger cAMP, som spiller en sentral rolle i cellulære responser til ulike ekstracellulære stimuli [2]. Intracellulært cAMP reguleres normalt av balansen mellom aktiviteter av to typer enzymer, leiren genererende enzymer (adenylate cyclases) og cAMP-nedbrytende enzymer (PDE), hovedsakelig som følge av hormoner og signalstoffer [3] [4] . PDE3B ble identifisert i mennesker og dens transkripter er funnet hovedsakelig i fettvev [5], og PDE3B har blitt rapportert å være fosforylert og aktivert som respons på insulin og hormoner som øke cAMP-nivåer [6].
Bioaktive lipider slik som syklisk fosfatidsyreinnhold (CPA) [7] [8] har blitt foreslått å øke cellulære cAMP-nivåer og føre til RhoA inaktivering i hepatomceller [9]. Tidligere viste vi at CPA redusert intracellulære triglyseridnivåer og hemmet PDE3B uttrykk [8]. Videre ble intracellulære cAMP-nivåer i 3T3-L1 celler funnet å øke etter eksponering for CPA. Disse resultatene tyder på CPA-PDE3B-cAMP veien er en bestemt molekylære mål. Fosfolipase D2 (PLD2) genererer CPA fra lysofosfatidylcholin (LPC), og lav dose insulin behandling av celler stimulerer PLD2 aktivitet og øker intracellulær CPA nivåer [7].
Nylig PDE3 har blitt foreslått å spille en nøkkelrolle i kreftcelleinvasjon og cellemotilitet [10]. PDE3-inhibitorer så som cilostazol hemmet veksten av små-celle lunge karsinom-celler [11], identifisere PDE3 som et mål for anti-proliferativ kreftterapi. Reduksjon i aktivitet PDE3B er ledsaget av en økning i intracellulære nivåer av cAMP, som aktiverer cAMP-avhengig proteinkinase A (PKA) [1]. I normale humane celler, fremmer cAMP proliferasjon og differensiering, men i kreftceller, påvirker cAMP spredning utpreget og undertrykker basal proliferasjon til nivåer betydelig enn i normale humane celler [12]. Videre kan høye intracellulære nivåer av cAMP reduserer effektivt in vitro kreftcellevekst [1].
Akt (Protein kinase B) er nylig blitt vist å dempe cAMP-signalering ved å aktivere PDE3B [13]. Siden den ble oppdaget som et proto-onkogen, har serin /treonin kinase Akt blitt et stort fokus for oppmerksomhet fordi Akt regulerer ulike cellulære prosesser kritisk, inkludert kreft progresjon [14]. I kreft, blir Akt-aktivitet ofte forhøyet på grunn av flere mekanismer, inkludert tap av funksjon av PTEN tumor suppressor-gen [15]. Når aktivert, kan Akt fosforylere flere molekylære involvert i regulering av celleproliferasjon og undertrykke apoptose [16]. Akt signalering er koblet til tumordannelse, og Akt inhibitorer har blitt utviklet for å kontrollere veksten av kreft [14]. Men for tykktarmskreft, behandlingsalternativer er i dag begrenset fordi disse behandlingene gi uønskede kardiovaskulære og trombotiske effekter [17]. Således må andre signalveier anses som kan anvendes for å utvikle nye terapeutiske strategier for å målrette mot tykktarmskreft. Intriguingly, CPA er blitt rapportert å produsere anti-mitogene effekter og forebygge kreft-celle invasjon in vitro og metastaser in vivo [18] [19].
Vi undersøkte ekspresjon av PDE3 isoformer PDE3A og 3B i human kolonkreft cellelinjer HT-29 og DLD-en. Sanntids polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) og western-blotting viste at PDE3D var den eneste PDE3 isoform uttrykt i begge cellelinjer. PDE3B mRNA og protein ble uttrykt i høye nivåer i HT-29-celler, og vi har observert at PDE3B uttrykk nivåer korrelerte med koloncancer celleproliferasjon. Vi fant ut at CPA behandling forhøyet intracellulært cAMP og undertrykte spredning av HT-29 celler. Videre, CPA hemmet Akt fosforylering i HT-29-celler på en doseavhengig måte. Sammen disse resultatene tyder på at CPA-PDE3B-cAMP pathway spiller en avgjørende i utviklingen av tykktarmskreft
Materialer og metoder
Reagenser
CPA (18:. 1 ) ble kjøpt fra Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). Deksametason ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cilostazol, anti-PDE3B antistoff (SC-20793), og anti-β-aktin-antistoff (SC-47778) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Akt (# 9272) og anti-Pakt S473 (9271S) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA).
Cell kultur
Menneskelig tykktarm kreft cellelinjer HT-29, LoVo, og Caco-2 ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VS). DLD-1 menneskelige adenokarcinomceller ble innhentet fra helsevitenskap Forskning Resources Bank (Osaka, Japan). Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) eller RPMI-1640 medium (Nacalai Tesque) inneholdende 10% (v /v) serum føtalt bovint (FBS), 100 U /ml penicillin, 10 ug /ml streptomycin, og 2,5 pg /ml plasmocin
TM (Nacalai Tesque) ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
Western blot-analyse
Cellene ble utsådd i 6-brønners plater (Iwaki, Tokyo, Japan) ved en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn. Etter diverse behandlinger (som indikert), ble cellene lysert på is i 30 minutter i en celle-lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl [pH 7,4], 10% [v /v] glycerol, 100 mM NaCl, 1% [v /v] Triton X-100, 1/100 protease inhibitor cocktail [Sigma], 1 mM ditiotreitol) og sentrifugert ved 16000 x
g
i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatantene ble lagret som cellelysater og analysert for proteininnhold ved anvendelse av Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad Protein Assay kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cellelysatene ble deretter separert på 5% -20% natriumdodecylsulfat (SDS) geler -polyacrylamide (e-PAGEL, Atto, Tokyo, Japan) og elektrooverført til Immobilon-P-membran (Millipore, Billerica, Massachusetts). Membranene ble blokkert i 1 time med Block Ace (DS Parma Biomedical Co Ltd, Osaka, Japan) og inkubert med primære antistoffer utvannet i TBS-T med 5% Block Ace i 12 timer ved 4 ° C. Proteinbånd ble visualisert ved hjelp EzWestLumi pluss (ATTO).
kvantitativ real-time PCR-analyse
Total cellulær RNA ble fremstilt ved bruk NucleoSpin RNA II (Takara, Shiga, Japan), og 0,5 mikrogram total RNA ble brukt for å syntetisere cDNA med ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo, Osaka, Japan) i henhold til produsentens anbefalinger. Vi målte mRNA nivåer ved hjelp av en ECO Real-Time PCR system (Illumina Inc., San Diego, California) og SYBR Grønn Realtime PCR Master Mix-Plus (Toyobo) med følgende primerpar blir brukt i reaksjonene: PDE3A, 5′ AAAGACAAGCTTGCTTGCTATTCCAAA-3 «(F) og 5′-GTGGAAGAAACTCGTCTCAACA-3′ (R); PDE3B, 5»-CCAGGTGTGCATCAAATTAGCA-3 «(F) og 5′-CAATGCCTTCTGTCCATCTCAA-3′ (R); 18S rRNA, 5»- CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 «(F) og 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3» (R). Alle PCR-reaksjoner ble utført i en 10 ul volum ved bruk av 48-brønners PCR-plater (Illumina). Syklusbetingelsene var 95 ° C i 10 min (enzymaktivering) etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 15 s, og 72 ° C i 30 sek. Etter amplifikasjon, ble prøvene langsomt oppvarmet fra 55 ° C til 95 ° C, og fluorescensen ble målt kontinuerlig for å oppnå en smeltekurve. Relative mRNA-nivåer ble beregnet ved anvendelse av formelen 2
-ΔΔCq, hvor ΔCq er forskjellen mellom terskelen syklus av et gitt mål-cDNA og det av et endogent referanse cDNA. Utledning av formlene og valideringstester er beskrevet i Applied Biosystems User Bulletin No. 2.
Måling av celleproliferasjon
Cellene ble sådd ut i 96-brønners kulturplater (5 x 10
3 celler /brønn) og inkubert i 24 timer. Celleproliferasjon ble målt ved hjelp av Cell telling leder-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan): 10 ul av celletelling leder-8-løsning ble tilsatt til mediet og inkubert i 2 timer i en inkubator med 5% CO
2; mengden av oransje formazanforbindelsen fargestoff produsert ble beregnet ved å måle absorbans ved 450 nm i en mikroplateleser (Awareness Technology, Inc., Palm City, Florida).
Syklisk nukleotid fosfodiesterase analysen
aktivitet av rekombinant PDE3B merket med GST (BPS Bioscience Inc., San Diego, CA) ble analysert ved bruk av en cyklisk nukleotid-PDE analysesett (Enzo Life Science, Farmindale, NY) i 96-brønners plater og måling av absorbansen ved 620 nm med et spektrofotometer ; Analysene ble utført i henhold til produsentens protokoll.
Effekt av CPA på intracellulært cAMP nivå
Cellene ble dyrket i serumfritt medium innehold CPA i 60 min. Cellular cAMP nivåene ble målt ved hjelp av ELISA (cAMP Biotrak Enzyme immunoassay system, Amersham Biosciences) i 96-brønners plater og ved å bestemme absorbans ved 450 nm med et spektrofotometer ved å følge produsentens instruksjoner.
RNA interferens
Vi trykkes PDE3B og Akt uttrykk i HT-29 celler ved transfeksjon cellene med små interfererende RNA (siRNAs) rettet mot PDE3B og Akt (Santa Cruz Biotechnology); Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) ble anvendt for å transfeksjoner. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater (Iwaki) ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn i DMEM inneholdende 10% FBS og deretter transfektert med 100 pmol /ml av mRNA-spesifikk sirnas eller egge (kontroll) sirnas . Reduksjon av PDE3B og Akt nivåer ble bekreftet av western blotting.
Statistisk analyse
Student
t
-test ble brukt for statistiske sammenligninger. Forskjeller ble betraktet som signifikant på
p
0,05 nivå.
Resultater
PDE3 isoformene PDE3A og PDE3B er kjent for å komme til uttrykk hos mennesker [1]. For å evaluere funksjonen av PDE3 i humane tarmkreftceller, anvendte vi 4 koloncancercellelinjer HT-29, LoVo, DLD-1, og Caco-2 (figur 1A), og undersøkt ekspresjon av PDE3B protein i disse cellelinjene . PDE3B ble uttrykt i høye nivåer i HT-29 og LoVo-celler.
Fire humane koloncancer cellelinjer (HT-29, LoVo, DLD-1, og Caco-2-celler) ble dyrket i DMEM supplert med 10 % FBS; proteinnivåer ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og Western-blotting med et anti-PDE3B antistoff, og proteinbånd ble visualisert ved hjelp av en forsterket kjemiluminescens reagens. Hvert felt ble ladet med 20 ug av hel-celle-lysat. β-actin var farget som en lasting kontroll. (B) Real-time PCR måling av uttrykk for PDE3A og 3B mRNA og 18S rRNA (internkontroll) i HT-29 og DLD-1 celler (gjennomsnitt ± SEM, n = 3, ** p 0,01, Student
t
test). (C) Real-time PCR-analyse (til venstre) og Western blotting (høyre) for å sammenlikne PDE3B ekspresjon i HT-29-celler etter behandling med CPA (1, 3 og 10 uM) i 60 minutter (gjennomsnitt ± SEM, n = 3 , ** p 0,01, Student
t
test)
for videre studier, valgte vi en cellelinje som uttrykker høye nivåer av PDE3B, HT-29, og en celle. linje som uttrykker lave nivåer av PDE3B, DLD-1. Enighet med protein uttrykk resultater, PDE3B mRNA var også til stede på et høyere nivå i HT-29 celler enn i DLD-1 celler (Figur 1b). I motsetning til dette ble PDE3A mRNA ikke detektert i begge cellelinjer. Disse resultater antyder at PDE3B er den viktigste PDE-isoformen i HT-29 og DLD-1-celler. Vi har testet effekten av CPA på ekspresjon av PDE3B mRNA og protein i HT-29-celler (figur 1C), og funnet at CPA ikke påvirker PDE3B genekspresjon, noe som tyder på at CPA ikke produserer sine virkninger ved avtagende PDE3B ekspresjon i HT- 29 celler. Deretter undersøkte vi effekten av CPA på intracellulære cAMP-nivåer i HT-29 og DLD-1 celler. Selv om cAMP kan enten fremme eller å undertrykke proliferasjon i mange celletyper, i de fleste tilfeller cAMP ser ut til å være anti-proliferativ. Behandling med CPA økt cAMP-nivåer betydelig i HT-29 celler, men ikke i DLD-1 celler (figur 2A). De ovennevnte resultatene indikerer at nivået av ekspresjon PDE3B ble korrelert med spredning potensialet av tykktarmskreftceller. Interessant, tid-retters eksperimenter viste at CPA behandling hemmet cAMP hydrolyse av PDE (figur 2B), noe som tyder på at blokkering PDE3 aktivitet med CPA øker intracellulært cAMP akkumulering. Imidlertid kan cAMP utøve sin anti-proliferative virkning ved forskjellige mekanismer i forskjellige cellelinjer.
Intracellulære cAMP-nivåer i kulturen lysatene ble målt ved anvendelse av cAMP Biotrak Enzyme immunoassay system. Cilostazol (5 uM; Cilo) ble anvendt som en positiv kontroll. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 4), ** p 0,01. (B) Tid løpet av CPA-avhengig hemming av cAMP hydrolyse av PDE3B. PDE3B ble inkubert med cAMP og 5′-nukleotidase med eller uten CPA (10 mm) for 10-50 min; PDE-inhibitor IBMX (50 uM) ble anvendt som en positiv kontroll.
Effekten av CPA på celleformering ble bestemt ved anvendelse av en kolorimetrisk analyse. Vi fant at CPA-inhiberte proliferasjon av HT-29 og LoVo-celler, men ikke av DLD-1 og Caco-2-celler (figur 3A), som har lavere nivåer av endogene PDE3B enn HT-29 og LoVo-celler [8]. For å teste om PDE3B påvirker spredning av HT-29 celler, ble PDE3B uttrykk slått ned ved hjelp sirnas. Den PDE3B målretting siRNA slått ned PDE3B effektivt, som vist ved western blotting med en anti-PDE3B antistoff (Figur 3B). Spesielt, 24 timer etter transfektering med PDE3B-siRNA, spredning av HT-29-celler ble redusert vesentlig. Disse resultatene indikerer at banket ned PDE3B hemmer veksten av HT-29-celler.
celler (1 x 10
5-celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater og inkubert i 24 timer eller 48 timer ved 37 ° C med 5% CO
2, hvoretter 10 ul av celletellingsleder-8-løsning ble tilsatt til mediet. Etter inkubering i 2 timer mer, er mengden av formazan oransje fargestoff generert ble bestemt ved å måle absorbansen ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplateleser. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 4), ** p 0,01. (B) Knocking ned PDE3B uttrykk i HT-29 celler. Totalt protein ble ekstrahert fra ikke-transfekterte celler og fra celler transfektert med kontroll siRNA eller PDE3B-spesifikk siRNA og analysert ved western blotting med et anti-PDE3B antistoff; β-actin var farget som et protein-lasting kontroll. (C) Inhibering av cellevekst følgende PDE3B knockdown ble målt ved hjelp av Cell telling leder-8. -Celler (1 x 10
5-celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater og inkubert i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO
2, hvoretter 10 ul av celletellingsleder-8 løsning ble tilsatt til mediet. Etter inkubering i 2 timer mer, er mengden av formazan oransje fargestoff generert ble bestemt ved å skaffe absorbansen ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplateleser. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 4), ** p 0.01.
Våre resultater tyder på at PDE3B nivåer korrelerer med celleproliferasjonsprosesser priser og at effekten av PDE3B avhenger av celletype. Deretter fant vi ut om CPA hemmer Akt fosforylering i HT-29 celler, fordi mange effekter av cAMP formidles gjennom aktivering av Akt [20] [21]. Akt er forbundet med tumor-celleoverlevelse, proliferasjon og invasivitet [22] [23]. For å fastslå om CPA bidrar til effekten av Akt i HT-29 celler, testet vi hvordan CPA påvirker Akt aktivering. Inhibering av Akt signalering har vært forbundet med de biologiske virkninger av chemo-forebyggende forbindelser slik som epigallocatechin gallat, noe som vesentlig undertrykker pakt nivåer i tarmsvulster uten å endre total Akt nivåer i hovedsaken [24]. Akt aktivering involverer fosforylering av to rester, Thr308 i aktiveringen sløyfe og Ser473 i den C-terminale hydrofobe motiv; fosforylering av Ser473 har blitt undersøkt vidt i tumorprøver som en indikator for Akt-aktivitet [25]. Først undersøkte vi baseline Akt Ser473 fosforylering i HT-29 celler og fant dette stedet i Akt å være konstitutivt fosforylert (Figur 4A). Videre fant vi ut om CPA hemmet Akt fosforylering i HT-29 celler. Våre resultater viste at CPA-blokkerte den konstitutive fosforylering av Akt i en doseavhengig måte (figur 4, A og B), og at denne CPA-mediert inhibering av Akt-fosforylering varte opp til 120 min (figur 4C). Selv om CPA er en stabil lipid og 75% av molekylet kan forbli intakt i kulturmedium i 24 timer [19] kan CPA omdannes til LPA ved åpning av ringstrukturen av CPA. Dette øker muligheten for at hydrolytiske spaltning av det cykliske fosfat ring av CPA med fosfolipid-fosfataser i HT-29-celler fører til dannelse LPA, som kan aktivere Akt [26].
(A) Akt fosforylering i HT- 29 celler behandlet med CPA (1, 3 og 10 uM), NGF (50 ng /ml, positiv kontroll), eller deksametason (Akt inhibitor, 25 uM). Fosforylert Akt (p-Akt) og total Akt ble påvist ved immunblotting. (B) De intensiteter av Akt bånd ble kvantifisert, og forholdet av fosforylert til total Akt ble beregnet. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 3), ** p 0,01. (C) HT-29 celler ble behandlet med CPA (10 pM), og lysatene ble samlet opp ved 30, 60, 90 og 120 min. Akt inhibering ble målt som tap av Ser473 fosforylering. (D) Knocking ned Akt uttrykk i HT-29 celler. Totalt protein ble ekstrahert fra ikke-transfekterte celler og fra celler transfektert med kontroll siRNA eller Akt-spesifikk siRNA og analysert ved western blotting med et anti-Akt antistoff; β-actin var farget som et protein-lasting kontroll. (E) Intracellulære cAMP-nivåer i HT-29 ble behandlet med 1, 3 eller 10 pM CPA i 60 minutter etter Akt knockdown; cAMP-nivåer ble bestemt i cellelysatene ved hjelp av cAMP Biotrak Enzyme immunoassay system. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 3), ** p . 0,01
Til slutt, vi målt cAMP-nivåer i HT-29 celler i nærvær og fravær av CPA etter banket ned Akt; Western-blotting med et anti-Akt-antistoff bekreftet at Akt-targeting siRNA slås ned Akt ekspresjon effektivt i HT-29-celler (figur 4D). Spesielt, CPA behandling av HT-29 celler med forminskede Akt nivåer klarte å øke cAMP nivåer betydelig (figur 4E).
Diskusjoner
Lysophospholipid har lenge vært anerkjent som en membran fosfolipid metabolitt. Nylig har imidlertid den lysophospholipid dukket opp som en kandidat molekyl for diagnostiske og farmakologiske formål, og LPA har blitt rapportert å være en potent induser av kreft progresjon på flere nivåer. Selv CPA ligner kjemisk på LPA, funksjoner av CPA er forskjellig fra eller til motsatt for de av LPA. For eksempel stimulerer LPA men CPA hemmer celleproliferasjon og kreft-celle invasjon [19] [27] [9]. Videre kan CPA undertrykke kreft invasjon og øke intracellulære cAMP nivåer [27]. PDE3 enzymer utgjør en av de mest omfattende studerte familier av cAMP-hydrolyser PDE’er, fordi PDE3 enzymer spiller flere roller i fysiologiske og patofysiologiske prosesser i kreft [28]. I sammenheng med kreft i tykktarmen, den PDE3-spesifikk hemmer cilostazol, som har blitt brukt tidligere for å behandle pasienter med trombose, ble brukt for å vurdere effektene av PDE3B inhibering på cellevekst. Proliferasjon av celler blir hemmet av cAMP via forskjellige mekanismer som kan indusere cellesyklus-stans ved G1 og apoptose [29]. Imidlertid har den mekanisme som PDE3B er involvert i intracellulær cAMP-produksjon som reaksjon på CPA forble uklart. Vi gjennomførte denne studien på tykktarmskreftceller ved hjelp av CPA, som hadde blitt vist tidligere for å øke intracellulære cAMP-nivåer direkte [8], en funksjon av CPA som også foreslått av anti-invasive egenskapene til CPA [9]. Vi fant at CPA hemmet veksten av HT-29 og LoVo-celler, som uttrykker høye nivåer av PDE3B, men ikke veksten av DLD-1 og Caco-2-celler som uttrykker lave nivåer av PDE3B. Støtte disse funnene, CPA hemmet PDE3B aktivitet i celler som uttrykker høye nivåer av PDE3B, og siRNA-mediert hemming av PDE3B uttrykk hemmet cellevekst. Disse resultatene tyder på at PDE3B regulerer intracellulære cAMP-nivåer i kolon kreftceller og er involvert i kreftcellevekst. I denne studien fant vi at CPA hemmet fosforylering av Akt i HT-29 celler på en doseavhengig måte. Akt regulerer flere cellulære funksjoner, inkludert celle overlevelse og spredning og ulike aspekter av intermediær metabolisme. I neoplastisk kolonepitelet ble Akt funnet å være ikke bare uttrykt på et høyere nivå, men også hyperactivated [30], og studier på kjemiske modeller har bekreftet at Akt er oppregulert i de tidlige stadiene av tarm tumorigenesis. PDE3B uttrykk og intracellulære cAMP-nivåer er korrelert med spredning potensial for tykktarmskreftceller. Vi bekreftet våre funn ved hjelp av siRNA analyse og viste en nedgang i pSer473-Akt med god korrelasjon mellom grad av cAMP produksjon og nedregulering av Akt fosforylering. Disse resultatene tyder på at Akt relatert signalveien er tett knyttet til CPA-PDE3B-cAMP vei og dermed indikerer for første gang at CPA kan tjene som en nyttig molekyl i målrettet behandling for tykktarmskreft.
Konklusjoner
Våre funn tyder på at cAMP spiller en avgjørende rolle i hemming av tykktarmskreft cellevekst av CPA. Basert på våre resultater, foreslår vi at belyse de molekylære mekanismer som CPA induserer cAMP produksjon ved å hemme PDE3B i tykktarm kreft celler kan gi verdifull innsikt som bidrar til å forklare hvordan kreftcellevekst er regulert. Å forstå hvordan kreftcellevekst blir regulert vil i sin tur bidra til å løse de molekylære mekanismer for kreftcelleinvasjon og metastase og lette analysen av signaloverføringsreaksjonsveier som fører til celleproliferasjon. Selv om videre forskning er nødvendig for behandlingen av krysstale mellom signalmolekyler vi har beskrevet her, våre resultater kollektivt støtte potensiell bruk av CPA som en terapeutisk sammensatt for behandling av tykktarmskreft.
