Abstract
Apo2 ligand (Apo2L) /tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) er en lovende kreft terapeutisk middel. Rekombinant humant Apo2L /TRAIL har vært under kliniske studier, mens ulike typer ondartede svulster har motstand mot Apo2L /TRAIL. Vi og andre har vist at flere anticancermidler og flavonoider overvinne motstanden mot Apo2L /TRAIL ved oppregulering død reseptor 5 (DR5) i maligne tumorceller. Imidlertid er mekanismene som disse forbindelser induserer DR5 uttrykk er imidlertid ukjent. Her viser vi at kosten flavonoid apigenin bindes og hemmer adenin-nukleotid-translokase-2 (ANT2), noe som resulterer i forbedring av Apo2L /TRAIL-fremkalt apoptose ved oppregulering av DR5. Apigenin og genistein, som er store flavonoider, forbedret Apo2L /TRAIL-indusert apoptose i kreftceller. Apigenin indusert DR5 uttrykk, men genistein ikke. Ved å bruke vår metode identifisere de direkte mål av flavonoider, sammenlignet vi bindende proteinene ifølge apigenin med de av genistein. Vi oppdaget at ANT2 var et mål av apigenin, men ikke genistein. I likhet med apigenin, knockdown av ANT2 forbedret Apo2L /TRAIL-indusert apoptose ved oppregulering DR5 uttrykk på post-transkripsjonsnivået. Videre stanse av ANT2 svekket forbedring av Apo2L /TRAIL-indusert apoptose av apigenin. Disse resultatene tyder på at apigenin oppregulerer DR5 og forbedrer Apo2L /TRAIL-fremkalt apoptose ved å binde og å inhibere ANT2. Vi foreslår at ANT2 hemmere kan bidra til Apo2L /TRAIL behandling
Citation. Oishi M, Iizumi Y, Taniguchi T, Goi W, Miki T, Sakai T (2013) Apigenin sensitizes prostata kreft celler til Apo2L /TRAIL ved målretting Adenin nukleotid translokase-2. PLoS ONE 8 (2): e55922. doi: 10,1371 /journal.pone.0055922
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 9. oktober 2012; Godkjent: 03.01.2013; Publisert: 19 februar 2013
Copyright: © 2013 Oishi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Unge Forskere (Oppstart, 21890223) og (A, 20533178) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest vanligste diagnosen kreft og den sjette største årsaken til mannlig kreftrelaterte dødsfall i verden [1]. Selv om androgen uttak terapi er effektiv i behandling av prostatakreft, de fleste pasienter utviser resistens overfor denne terapi [2]. Det ble rapportert at docetaxel pluss prednison var effektive for hormon-ildfast prostatakreft [3]. Det er imidlertid fremdeles utilstrekkelig resultatet av denne behandling [4]. Derfor er nye strategier for å behandle hormon ildfaste prostatacancer.
Apo2 ligand (Apo2L) /tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) er et cytokin som tilhører familien tumornekrosefaktor. Apo2L /TRAIL binder seg til døden reseptor 4 (DR4) og død reseptor 5 (DR5) og selektivt induserer apoptose i forskjellige ondartede tumorer, men ikke i normale celler [5], [6]. Nylig ble flere rekombinant human Apo2L /TRAIL og agonistiske anti-DR5 antistoffer utviklet, og klinisk fase I /II studier er blitt utført hos pasienter med mange typer ondartede svulster [7]. Men en rekke svulster vise motstand mot Apo2L /TRAIL og overvinne denne motstanden er avgjørende for kjemoterapi bruker Apo2L /TRAIL sti [8]. Vi og andre har vist kosttilskudd forbindelser sensibiliserende kreftceller til Apo2L /TRAIL og identifisert flere polyfenoler som DR5 indusere [9] – [14]. Men de mekanismer som disse polyfenoler oppregulere DR5 er ukjent.
adenin nucleotide translocases (maur) er viktige transportører i indre mitokondriemembranen og spille en rolle i utvekslingen mellom ADP og ATP [15]. Maurene har fire isoformene hos mennesker og hver isoform viser en annen fordeling til vev. ANT2 er overuttrykt ved mange ondartede tumorceller, og har anti-apoptotiske egenskaper [16], [17]. For eksempel har knockdown av ANT2 blitt vist å forbedre apoptose ved lonidamine, et antitumormiddel rettet mot mitokondrier [17], og induserer apoptose i humane brystcancerceller med hemning av tumorvekst
in vivo product: [18]. Videre knockdown av ANT2 sensitizes brystkreft celler til Apo2L /TRAIL via oppregulering av DR5 [19]. Følgelig er ANT2 ansett for å være et lovende mål anticancer [20], [21].
For å belyse de nøyaktige mekanismer gjennom hvilke flavonoider induserer ekspresjon DR5, benyttet vi magnetiske FG perler, som nylig avslørte målet av thalidomid og mekanismen av thalidomid teratogenisitet [22], [23]. Vi identifiserte ANT2 som en bindende protein i kosten flavonoid apigenin som oppregulert DR5. Som med behandling av apigenin, knockdown av ANT2 forbedret Apo2L /TRAIL-indusert apoptose ved oppregulering DR5. Videre knockdown av ANT2 svekket forbedring av Apo2L /TRAIL-mediert apoptose av apigenin. I denne studien, viser vi først at ANT2 er et mål på apigenin som oppregulerer DR5 og sensitizes ondartede kreftceller til Apo2L /TRAIL.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneske prostatakreft cellelinje DU145 ble oppnådd som en cellelinje av NCI-60 fra National Cancer Institute (MD, USA) Therapeutics Program (NCI DTP) Utviklings. Human prostatacancer LNCaP-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Vi har bekreftet at disse prostatakreft cellelinjene er negative for mykoplasma hjelp MycoAlert ™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Rockland, ME, USA). DU145-celler ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mmol /l glutamin, 50 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2. LNCaP-celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum, 4 mmol /l glutamin, 50 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2.
Reagenser
Apigenin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) og genistein (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) ble kjøpt og oppløst i DMSO. Humant rekombinant Apo2L /TRAIL ble kjøpt fra Pepro Tech (London, UK)
RNAi
Følgende sirnas (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble brukt. SiANT2 # 1, 5 « -AGAACAUUGGACCAUGCACCCUUGA-3 «; siANT2 # 2, 5»-UGUAUUGCUUAUCUGCAGUGAUCUG-3 «, og snik RNAi negativ kontroll høy GC. Bare fornuftig tråder vises. DU145 eller LNCaP-celler ble transfektert med sirnas ved hjelp av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).
Påvisning av apoptose
DU145 eller LNCaP-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av hver flavonoid i 24 timer eller transfektert med sirnas. Human rekombinant Apo2L /TRAIL (50 ng /ml) ble deretter tilsatt til cellene. Etter 24 timer ble cellene høstet og suspendert i PBS inneholdende 0,1% Triton X-100, 50 ug /ml propidiumjodid og 100 ug /ml RNase A (Sigma, St. Louis, MO, USA). Prosentandelen av hypodiploid DNA (sub-G1) ble kvantifisert ved FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Dataene ble analysert ved hjelp av Cell quest software (Becton, Dickinson and Company).
Western Blot analyse
DU145 eller LNCaP celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av hvert flavonoid eller transfektert med siRNAs. Cellene ble lysert med RIPA-buffer (50 mmol /liter Tris-HCl [pH 8,0], 150 mmol /l NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksykolsyre, 0,1% SDS, 1 mmol /l DTT, 0,5 mmol /L PMSF) ved 4 ° C i 30 min og ble deretter sentrifugert. Supernatantene ble samlet og separert ved 10,0% SDS-PAGE og deretter overført til Immobilon-P-membran (Millipore, Billerica, MA, USA) ved bruk av våtmetoden. Membranene ble dyppet i 5% melk i TBS ved 4 ° C natten over og inkubert med primære antistoffer ved romtemperatur i 60 min. Primære antistoffer ble et kanin polyklonalt anti-DR5 antistoff (Prosci, Poway, CA, USA) ved 1:500 fortynning i 5% melk i TBS og et mus monoklonalt anti-β-aktin-antistoff (Sigma) ved fortynning i 5 1:2,000 % melk i TBS. Membranene ble deretter inkubert med sekundære antistoffer konjugert med pepperrot-peroksidase ved 1:2,000 fortynning i TBS-Tween 20 i 60 minutter ved romtemperatur. Proteinbånd ble visualisert på Biomaks XAR Film (Carestream Health, Inc., Rochester, NY, USA) ved hjelp av Chemi-Lumi One L (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan).
Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse
DU145 eller LNCaP-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av hver flavonoid eller transfektert med sirnas. Total RNA ble ekstrahert fra cellene med Sepasol-RNA I super (Nacalai Tesque). Komplementær DNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp av High-Capacity cDNA revers transkripsjon Kits (Applied Biosystems, Melbourne, Australia). Komplementær DNA ble forsterket ved bruk av TaqMan prober for ANT2, DR5, og GAPDH (Applied Biosystems), og en ABI 7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems).
Utarbeidelse av flavonoid-fast Perler
Magnetiske FG perler med en epoxy linker ble kjøpt fra Tamagawa Seiki (Nagano, Japan). Fiksering av apigenin og genistein på perlene ble utført som beskrevet (Iizumi et al., Upubliserte data). I korte trekk, ble perlene blandet med apigenin i DMF inneholdende kaliumkarbonat ved 37 ° C i 24 timer for å genistein ved 60 ° C i 24 timer, vasket to ganger med DMF og deretter to ganger med deionisert vann. De resulterende kuler ble lagret ved 4 ° C.
rensing og identifikasjon av flavonoid-bindende proteiner
flavonoid-fikserte kuler eller tomme perler ble inkubert med DU145 hel celleekstrakter ved 4 ° C i fire hr. De bindende proteinene ble eluert med Laemmli fargestoff, underkastet SDS-PAGE og detektert ved hjelp av sølvfarging. De bindende proteinene ble deretter utsatt for i-gel fordøyelse ved hjelp av sekvensering Grade modifisert trypsin (Promega, Madison, WI, USA). De peptidfragmenter ble analysert ved en Autoflex II massespektrometer (Burker Daltonics, Billerica, MA, USA).
Resultater
Apigenin Forbedrer Apo2L /TRAIL-indusert apoptose via oppregulering av DR5 på innlegget -transcriptional nivå
Blant de vanligste flavonoider, apigenin er kjent for å øke Apo2L /TRAIL-indusert apoptose via oppregulering av DR5, mens genistein forsterker Apo2L /TRAIL-indusert apoptose uten oppregulering av DR5 [9], [24 ], [25]. I den foreliggende undersøkelse, er kombinasjonen av disse flavonoider og 50 ng /ml Apo2L /TRAIL markert indusert apoptose, mens hver flavonoid alene ikke i humane prostatacancer DU145-celler (fig. 1A, S1 og S2). Apigenin indusert DR5 protein uttrykk, men genistein ikke (Fig. 1B), mens apigenin ikke oppregulere DR5 mRNA (Fig. 1C og S3). Disse resultatene tyder på at apigenin forbedrer Apo2L /TRAIL-fremkalt apoptose av post-transkripsjonelt oppregulering DR5.
A, DU145-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av hver flavonoid i 24 timer, etterfulgt av behandling med eller uten 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Etter 24 timer ble sub-G1 populasjonen av cellene målt ved hjelp av flow cytometri. B, DU145-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av hver flavonoid i 24 timer og høstet. Lysatene ble analysert ved hjelp av Western blotting med et anti-DR5-antistoff. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. C, DR5 mRNA ble kvantifisert ved real-time RT-PCR og normalisert ved GAPDH. Kolonner, mener; barer, SD (n = 3). **
P
. 0,01 i forhold til å kontrollere
ANT2 er identifisert som en Binding Protein av Apigenin, men ikke Genistein
For å belyse den mekanismen som apigenin induserer DR5 uttrykk, vi utforsket proteiner som binder til apigenin, men ikke genistein, ved hjelp av FG perler med epoxy linker. Apigenin og genistein ble rettet mot disse kuler (fig. 2A). De bindende proteinene ifølge apigenin og genistein ble renset fra DU145 hel celle-ekstrakter, og ble identifisert ved MALDI-TOF-MS-analyse. Adenin-nukleotid-translokase-2 (ANT2) ble identifisert som et bindingsprotein av apigenin, men ikke genistein. På den annen side ble ribosomalt protein S9 (RPS9) identifisert som et bindingsprotein av disse flavonoider (Fig. 2B). Disse resultatene indikerer at ANT2 er en bindende protein av apigenin som induserer DR5 uttrykk.
A, Fiksering av apigenin og genistein på magnetiske FG perler. B, ble Apigenin- og genistein-bindende proteiner renset fra ekstrakter av hele celler DU145-celler med hver flavonoid-fast eller ikke (-) FG kuler og ble analysert ved hjelp av sølvfarging. De bindende proteiner ble identifisert ved et massespektrometer.
knockdown av ANT2 Forbedrer Apo2L /TRAIL-indusert apoptose via oppregulering av DR5 på Post-transcriptional nivå
Det har blitt rapportert at knockdown av ANT2 forbedrer Apo2L /TRAIL-indusert apoptose via oppregulering av DR5 i menneskelige brystkreft celler [19]. Derfor undersøkte vi om knockdown av ANT2 forbedret Apo2L /TRAIL-indusert apoptose i menneskelig prostata kreft DU145 cellene. ANT2 siRNAs potent trykt uttrykk for ANT2 mRNA (fig. 3A og S4). Som vist på fig. 3B og S5, ANT2 sirnas tilsynelatende økt Apo2L /TRAIL-mediert apoptose. Vi neste undersøkt om ANT2 knockdown indusert DR5 uttrykk. DR5-ekspresjon ble indusert ved ANT2 sirnas i DU145-celler (Fig. 3C), mens DR5 mRNA ikke ble indusert (fig. 3D og S6). Samlet utgjør disse funnene tyder på at knockdown av ANT2, samt apigenin, forbedrer Apo2L /TRAIL-indusert apoptose av post-transcriptionally upregulating DR5.
DU145 cellene ble transfektert med to forskjellige ANT2 sirnas (siANT2 # 1 og # 2) eller et ikke-målsøkende siRNA (siCtrl) og ble inkubert i 48 timer. A, ANT2 mRNA ble kvantifisert ved real-time RT-PCR og normalisert ved GAPDH. B, Cellene ble behandlet med eller uten 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Etter 24 timer ble sub-G1 populasjonen av cellene målt ved strømningscytometri. C, Protein nivåer av DR5 og β-aktin ble analysert ved Western blotting. D, mRNA nivåer av DR5 ble målt ved real-time RT-PCR og normalisert ved GAPDH. Kolonner, mener; barer, SD (n = 3). *
P
0,05, **
P
. 0,01 i forhold til å kontrollere
knockdown av ANT2 Demper Apo2L /TRAIL-indusert apoptose forsterkes av Apigenin
for å belyse hvilken rolle ANT2 i forbedring av Apo2L /TRAIL følsomhet ved apigenin, undersøkte vi om knockdown av ANT2 påvirket denne forbedringen som tidligere utført som til andre target proteiner [26], [27]. Apigenin (20 umol /L) forbedret 50 ng /ml Apo2L /TRAIL-mediert apoptose i DU145-celler introdusert ved kontroll siRNA, men ikke i DU145-celler introdusert av ANT2 siRNA (Fig. 4A og S7). Stanse av ANT2 senket forbedring av DR5 uttrykk ved 20 mikromol /L apigenin (Fig. 4B). Disse resultater indikerer at inhibering ANT2 er nødvendig for å forbedre apigenin DR5 ekspresjon og Apo2L /TRAIL-fremkalt apoptose.
DU145-celler ble transfektert med siANT2 # 1 eller siCtrl. Etter 48 timer ble cellene inkubert med 20 pmol /L apigenin i 24 timer. A, Cellene ble behandlet med eller uten 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Etter 24 timer ble sub-G1 populasjonen av cellene målt ved hjelp av flow cytometri. Forskjellen i sub-G1 populasjoner med og uten Apo2L /TRAIL ble definert som Apo2L /TRAIL aktivitet. Den Apo2L /TRAIL aktivitet i prøver uten apigenin ble normalisert til 1. B, ble Protein nivåer av DR5 og β-actin analysert ved Western blotting. Kolonner, mener; barer, SD (n = 3). **
P
. 0,01 i forhold til å kontrollere
Vi neste undersøkt hvilken rolle ANT2 i en annen kreftcellelinje, hormonavhengig human prostatakreft LNCaP. ANT2 mRNA ble effektivt brakt til taushet av ANT2 sirnas (Fig. 5A og S8), og knockdown av ANT2 også indusert DR5 uttrykk (Fig. 5B) og forbedret 50 ng /ml Apo2L /TRAIL-indusert apoptose (Fig. 5C og S9). I tillegg knockdown av ANT2 attenuert forbedring av Apo2L /TRAIL følsomhet og DR5-ekspresjon ved 20 umol /L apigenin (fig. 5D, E og S10).
LNCaP-celler ble transfektert med siANT2 eller siCtrl og var inkubert i 48 timer. A, ANT2 mRNA ble kvantifisert ved real-time RT-PCR og normalisert ved GAPDH. B, Protein nivåer av DR5 og β-aktin ble analysert ved Western blotting. C, Cellene ble inkubert med eller uten 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Etter 24 timer ble sub-G1 populasjonen av cellene målt ved strømningscytometri. D, Cellene ble inkubert med 20 pmol /L apigenin i 24 timer, etterfulgt av behandling med eller uten 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Den Apo2L /TRAIL-aktivitet i prøver uten apigenin ble normalisert til 1. E ble cellene inkubert med 20 pmol /L apigenin i 24 timer. Protein nivåer av DR5 og β-aktin ble analysert ved Western blotting. Kolonner, mener; barer, SD (n = 3). *
P
0,05, **
P
0,01 i forhold til å kontrollere
Diskusjoner
I denne studien, vi. identifisert ANT2 som et bindende protein ifølge apigenin som oppreguleres DR5 ved hjelp av magnetiske kuler FG (fig. 2). Knockdown av ANT2 forbedret Apo2L /TRAIL-indusert apoptose ved oppregulering DR5 (Fig. 3), tilsvarende behandling med apigenin (Fig. 1). Videre knockdown av ANT2 attenuert forbedring av DR5 ekspresjon og Apo2L /TRAIL-fremkalt apoptose av apigenin (fig. 4 og 5). Disse resultatene tyder på at Apigenin binder og hemmer ANT2, som induserer DR5 uttrykk og forsterker Apo2L /TRAIL følsomhet (Fig. 6). Den foreliggende undersøkelse viser også at apigenin post-transkripsjonelt induserer DR5 ved å hemme ANT2 (Fig. 1 B og C). Vi antar at flere agenter, som har blitt rapportert å oppregulere DR5 på transkripsjonsnivået [10] – [13], kan også indusere DR5 uttrykk på post-transkripsjonsnivået ved å hemme ANT2
Apigenin binder og hemmer. ANT2. Hemming av ANT2 forsterker Apo2L /TRAIL følsomhet via oppregulering av DR5.
Det har blitt rapportert at knockdown av ANT2 løfter ROS-nivåer [17] og aktiverer JNK og p53 [19], i samsvar med det apigenin også øker ROS nivåer [25], [28] og aktiverer JNK [29] og p53 [30]. I tillegg er den foreliggende studien viste at apigenin bundet til ANT2 og oppregulert DR5 lik knockdown av ANT2. Disse resultatene antyder sterkt at Apigenin funksjonelt hemmer ANT2.
Flere polyfenoler, som for eksempel apigenin, har blitt rapportert å forbedre Apo2L /TRAIL følsomhet via ulike veier [25], [31]. Men de detaljerte mekanismer der hver polyphenol øker Apo2L /TRAIL følsomhet er fortsatt ukjent. Vår metode identifisere målene av polyfenoler kan være nyttig for å belyse disse mekanismene.
Vi belyst den mekanisme som apigenin oppregulert DR5 ved å sammenligne bindende proteiner av apigenin at oppregulert DR5 og genistein som ikke (Fig. 2) . Strategien som sammenligner de direkte bindende proteiner av ulike agenter er gunstig. For eksempel har det blitt avklart at ligander av VDAC proteiner selektivt indusere ikke-apoptotisk celledød i tumorceller mutasjoner i onkogener
HRAS
,
KRAS
, eller
BRAF
ved å sammenligne bindende proteiner av erastin A6 og erastin B2, en erastin analog som mangler sin aktivitet [32]. Sammenligning av de bindende proteiner av forskjellige midler kan avsløre de proteiner som forårsaker de største eller ugunstige virkninger av disse midler. Videre kan farmakologiske kontroll av disse bindende proteiner utvikle dagens cellegift.
Til dags dato flere agonistiske anti-DR5 antistoffer og humant rekombinant Apo2L /TRAIL har blitt utviklet og er under kliniske studier, mens noen kreftformer har vist motstand mot disse midler [7]. I denne studien, knockdown av ANT2 sensibilisert kreftceller til Apo2L /TRAIL ved oppregulering DR5. Denne studien tyder også på at apigenin kan være en ANT2 inhibitor. Følgelig kan Apigenin og romanen ANT2 hemmere forsterke effekten av disse midlene ved å overvinne motstanden mot Apo2L /TRAIL.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Histogrammene i figur 1A som å apigenin.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Histogrammene i figur 1A som til genistein.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Den forsterknings kurvene i figur 1C.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Den forsterknings kurver på figur 3A.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s004 plakater (TIF)
Figur S5.
Histogrammene i figur 3B.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s005 plakater (TIF)
Figur S6.
Den forsterknings kurvene i Figur 3D.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s006 plakater (TIF)
Figur S7.
Histogrammene i figur 4A.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s007 plakater (TIF)
Figur S8.
Den forsterknings kurver på figur 5A.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s008 plakater (TIF)
Figur S9.
Histogrammene i figur 5C.
doi: 10,1371 /journal.pone.0055922.s009 plakater (TIF)
Figur S10.
Histogrammene i figur 5D.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0055922.s010 plakater (TIF)
Takk
Vi er takknemlige for M. Horinaka og Y. Sowa for nyttig diskusjon
