Abstract
statistisk modellering, i kombinasjon med genom-wide uttrykk profilering teknikker har vist at den molekylære tilstand av svulsten er tilstrekkelig til å utlede patologisk tilstand. Disse studiene har vært svært viktig i diagnostikk og har bidratt til å øke vår forståelse av tumorbiologi. Imidlertid kan deres betydning i en dypere forståelse av kreft Patho-fysiologi være begrenset siden de ikke eksplisitt ta hensyn til grunnleggende rolle i vevet mikromiljøet i spesifisere svulst fysiologi. På grunn av viktigheten av normale celler i å forme vevet mikro formulere vi den hypotese at molekylære komponenter av profilen av normale epitelceller tilstøtende tumoren er prediktiv for tumor fysiologi. Vi adressert denne hypotesen ved å utvikle statistiske modeller som lenker genuttrykk profiler som representerer den molekylære tilstand av tilstøtende normale epitelceller til kreft funksjoner i prostatakreft. Videre nettverksanalyse viste at prediktive gener er knyttet til aktiviteten til viktige skilles faktorer, som har potensiale til å påvirke tumorbiologi, som IL1, IGF1, PDGF BB, AGT, og TGFfi
Citation. Trevino V, Tadesse MG, Vannucci M, Al-Shahrour F, Antczak P, Durant S, et al. (2011) Analyse av Normal-Tumor Tissue Interaksjon i svulster: Prediksjon av prostatakreft Funksjoner fra Molecular oversikt over tilstøtende normale celler. PLoS ONE 6 (3): e16492. doi: 10,1371 /journal.pone.0016492
Redaktør: Diego Di Bernardo, Fondazione TV-aksjonen, Italia
mottatt: 04.08.2010; Godkjent: 03.01.2011; Publisert: 30 mars 2011
Copyright: © 2011 Trevino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Victor Trevino var en mottaker av en Darwin Trust Fellowship og CONACyT. Dette arbeidet er delvis finansiert med tilskudd fra CRUK (C8504 /A9488), spanske departementet for vitenskap og innovasjon (BIO2008-04212), GVA-FEDER (PROMETEO /2010/001). Forfatterne takker også støtte fra National Institute of Bioinformatikk (www.inab.org) og RTICC (tilskudd RD06 /0020/1019) begge initiativer av Instituto de Salud Carlos III (MICINN). Marina Vannucci er delvis støttet av NIH-NHGRI R01-HG003319. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bruk av funksjonell genomikk teknologier, særlig genekspresjon profilering, har gitt det vitenskapelige samfunn med verktøy til å karakterisere molekylære tilstand av celler og vev på et genom nivå. Disse teknologi kombinert med evnen til å dissekere spesifikke celletyper fra en kompleks vev har skapt en enestående mulighet til å karakterisere molekyl identiteten til spesifikke celletyper i forbindelse med en sammensatt vev [1]. Ved å følge denne fremgangsmåten, har genekspresjon profilering blitt anvendt for å generere den transkripsjonelle profilen av tumorceller som er prediktive for både tumor-egenskaper og klinisk resultat i en rekke humane cancere [2]. Mange genom-wide studier er imidlertid ofte analyseres ikke tar eksplisitt hensyn til at deler av ekstracellulære matriks (ECM) (matrix proteiner, løselig vokse faktorer og chemokiner) som skilles ut fra normale celler, ved siden av tumorlokalisering, sterkt påvirke biologi av svulsten. Nylig har stromale celler dukket opp som primære kandidater til å spille en rolle i normal-tumor celle interaksjon [3]. Disse cellene utskiller de fleste av de som er involvert i ECM sammenbrudd enzymer, for eksempel de produserer vekstfaktorer som har en rolle i å kontrollere tumorcelle-proliferasjon, apoptose, og migrasjon. De skiller også pro-inflammatoriske cytokiner som er involvert i chemoattraction og aktivering av spesifikke leukocytter, og derfor spiller en rolle i å bestemme inflammatoriske responser [4]. Vekstfaktorer og cytokiner er også involvert i den neoplastisk transformasjon av celler, angiogenese, tumor klonal ekspansjon og vekst, passasje gjennom ECM, intravasation inn i blodet eller lymfekar og den ikke-tilfeldig homing av tumormetastase til bestemte områder. Mange av disse faktorer er også utskilt av normale epitelceller, immunceller og endotelceller i nærheten av tumormassen. Det har også vist seg at stroma kan påvirke responsen til anti-tumorterapi. Faktisk nærvær av CD11b + leukocytter gir resistens mot anti-angiogenese terapi [5].
Videre forbehandling av stroma med anti-angiogenese-molekyler før tumorimplantering i musetumormodeller paradoksalt nok øke tumorutvikling [6], [7]. Dette illustrerer at kvaliteten på svulsten stroma kan betydelig påvirke kreftutvikling.
Betydningen av mikro-miljøet i å bestemme utbruddet og progresjon av kreft oppstår spørsmålet om det kan være mulig å forutsi Patho-fysiologi og klinisk utfall av tumoren fra bestemte komponenter i den molekylære tilstanden til normale celler. Hvis det er mulig, ville vi forvente at disse molekylære signaturer for å representere viktige komponenter i celle-celle krysstale involvert i å spesifisere utvikling av kreft.
Vi adressert dette spørsmålet ved å utvikle statistiske modeller basert på et genom bred profilering av normal vev tilstøtende tumor og identifisere aspekter som er prediktive for kreft egenskaper.
Vi har analysert to forskjellige prostatakreft microarray datasett som er tilgjengelig i den offentlige sfæren [8], [9]. Vi viser at i begge datasett den molekylære tilstanden til cellene som grenser til tumoren er prediktiv for klinisk relevante kreft egenskaper. Disse banene er informative molekylære signaturer og representerer trasé som er involvert i produksjon og respons på utskilles faktorer.
Disse funnene støtter den potensielle relevansen av normalt vev biopsi i diagnose og prognose av prostatakreft. Denne tilnærmingen gir også et generelt gjelder analyse strategi for å identifisere viktige veier involvert i celle til celle kommunikasjon.
Resultater
Statistisk modellering etablerer en kobling mellom den molekylære tilstand av normale celler og tumor histo-patologiske funksjoner
den første målet for vår analyse var å teste om den molekylære profilen til normale celler er prediktiv for kreft egenskaper. Vi i utgangspunktet vurdert to viktige aspekter av prostata svulst fysiologi: graden av organisering av tumorceller definert av en histo-patologiske scoring system som kalles Gleason score, og evnen av kreftceller til å trenge orgelet kapsel oppsummert av en binær histo-patologiske poengsum kalt kapsel penetrasjon. Graden av differensiering av tumorceller måler tendensen av celler til å aggregere i kjertel-lignende strukturer som minner om organiseringen av normalt vev. Gleason score kan brukes til å definere to hovedklasser. Den første er preget av lav grad av svulster som viser en svært organisert struktur (korrespondenten til en score under eller lik 6), mens en annen klasse er preget av høy grad av svulster celler som er dispergert i matrisen og ikke viser en tendens å danne kjertellignende strukturer (korrespondenten til en poengsum over eller lik 7). I motsetning kapselgjennomtrengning beskrive hvorvidt cellene er unndratt den kapsel som omgir prostata.
Analysen forsøkte å koble den molekylære profilen av normale celler til differensiering nivå (lav versus høy differensiering) og kapsel-gjennomtrengning (positiv versus negativ). Dette ble oppnådd gjennom utvikling av statistiske modeller som var basert på den molekylære profilen til normale celler og forutsigbare for eksempel klasser, spesielt Gleason score og kapsel penetrasjon.
For dette formålet vi brukt to forskjellige multivariat modellering tilnærminger ( GA-MLHD og BVS metoder) til to uavhengige datasett utviklet av Singh et al. [9] og ved Lapointe et al. [8]. De to statistisk modellering tilnærminger er utviklet for å søke etter flere genmarkører som maksimerer skillet mellom prøveklassene. Ved hjelp av disse fremgangsmåter, har vi utviklet representative modeller som var forutsigende av tumor funksjoner ved hjelp av gen-ekspresjon profilen til normale celler. Klassifisering nøyaktighet og størrelse av disse modellene var sammenlignbare med de som er utviklet ved hjelp av den molekylære tilstanden til tumorceller (tabell 1). Representative modeller som er utviklet med BVS og GA-MLHD metoder representerer optimale prediktive undergrupper som er basert på en svært lik antall gener og har en høy grad av overlapping på gennivå, noe som tyder på at våre resultater er uavhengig av metoden som er benyttet (figur 1 og fig S1, S2 og S3). I samsvar med den relativt liten grad av overlapping mellom microarray plattformer ( = 8%, se Data Processing delen i Text S1 for detaljer), de representative modeller utviklet fra de to uavhengige datasettene har ingen gener felles
.
figuren viser varmekart som representerer uttrykket profilen til gener valgt av GA og BVS modeller i både Lapointe og Singh datasett fra normalt vev data. Hver kvadrant i figuren representerer en kombinasjon av en modelleringsmetode og et bestemt datasett. Gener stede i GA-MLHD og BVS for samme datasettet er uthevet i rødt. Nøyaktighet er rapportert under hvert heatmap. Genbanken sjonsnummer og genet symbol vises på venstre side av heatmap. Lysere grønne eller røde farger i heatmaps representerer lavere eller høyere relativ uttrykk hhv. t-test p-verdi er vist for sammenligning med differensial uttrykk kriteriene som vanligvis brukes i univariate variable utvalgs tilnærminger.
Videre analyser av det relative bidraget fra de enkelte genene til prøven separasjonen var utføres ved hjelp av en prinsipal komponent analyse (Figur 2). Denne tilnærmingen har avdekket at gener involvert i celle kommunikasjon trasé er prediktive for kapsel penetrasjon. Innenfor genet satt valgt av GA i normalt vev datasettet, en kombinasjon av økt ekspresjon av genet
PRELP
og en lavere ekspresjon av genene
UBE4A
,
ZNF146
i de normale cellene var prediktiv av svulst kapsel penetrasjon. I genet sett utviklet ved bruk av BVS prosedyren på normalt vev datasett, et høyt uttrykk for
PPP2R4
,
PRELP
,
CALLA
,
ISG20L2
var prediktiv av svulst kapsel penetrasjon. Modellene er utviklet fra Lapointe datasett avslørt at lavere uttrykk for
OAT Hotell og høyere uttrykk av
PCGF5 Hotell og
MYCN
i GA-modellen og lavere uttrykk for
IGF1 Hotell og
prac Hotell og høyere uttrykk av
PCGF5 Hotell og
CPSF7
er prediktive for kapsel penetrasjon.
figuren viser resultatet av en PCA som representerer prøven separasjon på grunnlag av ekspresjon i normalt vev av gener som er valgt av modellerings prosedyrer. Hver kvadrant i figuren representerer en kombinasjon av en modelleringsmetode og et bestemt datasett. Hver kvadrant inneholder en 2D plott som representerer separasjon av kapsel penetrasjon negative (svart nære sirkler) og positive (rød nære sirkler) prøver (plott B, D, F og H) og et stolpediagram (plott A, C, E og G) representerer PC ladninger (x-akse) for hvert gen komponent (y-aksen). Legg merke til at PC-belastninger representerer bidraget fra hver genet til klassen separasjon. Stiplede linjer avgrensning gener med større bidrag som er omtalt i manuskriptet. Gener stede i GA-MLHD og BVS for samme datasettet er uthevet i rødt.
Koblingen mellom normal og svulst vist i denne analysen er også støttet av en univariat analyse som vi har utført ved hjelp av en bred spekteret av tilgjengelige metoder (figur S4).
Spesifisitet av genet signaturer prediktive av kreft Histo-patologiske funksjoner
Tilstøtende normale og tumorvev er morfologisk distinkt. Imidlertid, de viser en viss grad av molekylært likhet som er delvis en følge av å dele de samme mikro-miljø [10]. Vi har derfor lurte på om de prediktive modeller vi har utviklet fra normale epitelceller representerer en molekylær signatur som er spesifikk for normalt vev eller om uttrykket av de prediktive gener i kreftceller kan også være forutsigbare for svulst funksjoner. For å løse denne hypotesen, tok vi gener utvalgt av våre modelleringsstrategier utviklet fra det normale vev datasett og testet om deres uttrykk i svulsten problemet var prediktiv av kreft egenskaper.
Vi utfordret også prediksjonsnøyaktigheten av modeller utviklet fra tumordata ved å utføre den tilsvarende sammenlignings i normal datasettet. I begge tilfeller prediksjonsnøyaktigheten av modellene er nær 50% (som svarer til den forventede nøyaktigheten av en tilfeldig gjetning) (figur 3). Denne analysen viser derfor at de molekylære signaturer vi har identifisert er spesifikke for vev (normal eller svulst) de har blitt valgt ut til å representere.
prediktiv nøyaktighet av modellene utviklet ved hjelp av normalt vev (panel A, fylte sirkler ) kan sammenlignes med disse modellene er utviklet ved hjelp svulstvev (panel B, fylt ruter). Når modeller utviklet ved hjelp av normalt vev er trent og testet ved hjelp av data fra svulstvev, er prediksjon makt minket betraktelig (tomme sirkler). Likeledes tumormodeller trent og testet med data fra normalt vev er også ikke-prediktive (tom diamanter).
Funksjonell nettverk knyttet til prediktiv signaturer som representerer normale epitelceller uttrykk profiler inneholder viktige cytokin og vekstfaktor signaler
for å lette den biologiske tolkning av genene som er representert i våre statistiske modeller har vi brukt IPA analyse programvaren for å utføre en grundig analyse på nettverksnivå. For å sikre vår analyse dekket hele spekteret av mulige løsninger, brukte vi som innspill til IPA programvare listen av gener som er representert i samlingen av prediktive modeller identifisert fra normalt vev ved GA prosedyren. Disse dekker et bredere spektrum av oppløsningen plass i forhold til de representative modellene som er beskrevet ovenfor (figur 1 og 2) og representerer 239 og 259 gener for Singh og LaPointe datasett respektivt. I denne analysen har vi fokusert på Capsular penetrasjon på grunn av sin kliniske og prognostiske relevans. Nettverket Analysen ble utført uavhengig i de to datasett og de mest betydningsfulle nettverk (statistisk signifikante og med 50% målgener representert i nettverket). Ble valgt ut for videre analyse
I begge datasett, prediktive gener var del av nettverk som knytter ekstracellulære molekyler som pro-inflammatoriske cytokin
IL1β
, de pro-metastatiske chemokiner
CX3CL1 Hotell og
CCL20 Hotell og vekstfaktorer
IGF1
,
TGFB Hotell og
PDGF BB
med aktiviteten av atomtranskripsjonsfaktorer
NFkB
,
HF4A
,
TP53
og
MYC
.
Figur 4 beskriver de viktigste nettverkene identifisert av IPA søknad representant av modellene basert på molekylær tilstand av normale celler og forutsigbare for kapsel penetrasjon i Lapointe m.fl. . datasett (se tabell S2 for den fullstendige listen over betydelige nettverk identifisert av IPA). Figur 4A viser et nettverk representert av samspillet mellom pro-inflammatorisk cytokin
IL1β Hotell og transkripsjonsfaktoren
NFkB
. Figur 4B-D representerer tre sammenhengende undernettverk som involverer samspillet mellom flere vekstfaktorer gener og transkripsjonsfaktorer P53 (
TP53
) og C-MYC (
MYC
). Mer spesifikt, figur 4C representerer et nettverk med vekst faktorer
IGF1
, sin reseptor
IGF1R Hotell og
PDGF BB
. Figur 4B representerer samspillet mellom ekstracellulære faktorer Angiotensin (
AGT
), vekstfaktor
TGFB
og Notch ligand Jagged (
JAG
). Figur 4D på den annen side representerer gener som enten er direkte eller indirekte koblet til transkripsjonsfaktoren c-myc (
MYC
).
I figuren representerer de fire mest signifikante nettverk som er valgt av IPA programvare. Gener som representeres av blå figurene er til stede i samlingen av modeller som samles inn av GA-MLHD prosedyre. Gener representert med røde figurer representerer gener i samlingen av modeller, men også inkludert i de representative mest prediktive modeller. Gener i nettverkene er arrangert av cellulær lokalisering (ekstracellulært, membran, cytoplasma og kjernen). Merk at IPA programvare søket etter statistisk signifikante undernettverk i en gitt maksimal størrelse for å forenkle sin visualisering. Likevel, i dette tilfellet de knytter som indikert av stiplede røde piler forbinder spesifikke nettverkskomponenter.
De fire mest betydningsfulle nettverk identifisert fra Singh datasettet (figur S5) representerer gener knyttet til de samme cytokiner og vekstfaktorer som er identifisert i Lapointe datasett. Dette interessant observasjon tyder på at til tross for den begrensede mengden overlapping på gennivå, modeller avledet fra to datasett kan representere funksjonelt tilsvarende molekylære nettverk.
Uttrykk av prediktive cytokiner, vekstfaktorer og deres reseptorer i prostata kreft progresjon
for å bedre forståelsen av den biologiske betydningen av IPA nettverkene vi analysert uttrykket av gener i ulike stadier av prostatakreft progresjon. Vi fokuserte etterforskningen på en liten undergruppe av 20 gener som representerer de skilles forhold som inngår i IPA nettverk og deres reseptorer (Tabell S3).
Med den hensikt å begrense forstyrrelser av stromal celle forurensninger, valgte vi et datasett representerer en microarray analyse av syv typer normale og tumor epitelceller populasjoner, renset med laser-fangst mikro-disseksjon (LCM) rapportert av Tomlins et al. [11]. Disse inkluderte, normale prostataceller renset fra friske prostata (Nor), normale celler fra benign prostata hyperplasi (BPH), normale celler tilstøtende svulsten (adj) tumorceller fra prostata intraepitelial neoplasi (PIN), tumorcellene fra lav karakter prostata carcinoma (L-PCA), tumorceller fra høy klasse prostata carcinom (H-PCA) og kreftceller fra prostata kreft metastaser (Meta).
Vi hypotese at siden de 20 genene vi valgte var inkludert i modellene svært prediktive av tumor kapselgjennomtrengning, kan de også bli uttrykt forskjellig i løpet av prostatakreft progresjon. Vi testet denne hypotesen ved å sammenligne de syv LCM cellepopulasjoner. Vi oppdaget at en overraskende stor andel av disse genene ble uttrykt forskjellig (75% ved p
0,001
og 95% på
p 0,05
) (tabell S3, figur 5, S7 og S8). Ytterligere støtte til relevansen av genekspresjon signaturen vi hadde identifisert kom fra den observasjon at den todimensjonale klynge analyser foretatt ved hjelp av matrise av differensial genekspresjonsprofiler (gjennomsnitt uttrykk for hver gruppe), rekapitulert det forventede forhold mellom de forskjellige trinn i utvikling av prostatakreft (figur 5A). Mer presist, normal celle populasjoner gruppert sammen etterfulgt av PIN og en klynge av L- PCA og H-PCA. Den metastatisk cellegruppe klynget til side.
I figuren representerer resultatene av analysen utført på datasettet utviklet av Tomlins et al. [11]. Ulike cellepopulasjoner er merket som følger. Normale celler (norm), normale celler tilstøtende svulsten (adj), benign prostata hyperplasi (MPH), lav karakter prostata carcinom (L-PCA), høy grad av prostata carcinom (H-PCA) og metastatiske celler (meta). Panel A viser en todimensjonal klyngeanalyse utført på genene forskjellig uttrykt (
p 0,01
) over de syv LCM renset normale og svulst epiteliale cellepopulasjoner. Panel B representerer ekspresjonsnivået (y-aksen) av gener uttrykt forskjellig mellom norm, tilstøtende og BPH (representert på y-aksen). Nivåene av enkelte gener på tvers av alle trinn presenteres i paneler CF og i figur S8.
Av relevans for å forstå det biologiske grunnlaget for prediktiv kraft av normale celler signatur er observasjonen at normale celler tilstøtende svulsten viste signifikante forskjeller i forhold til normale celler og BPH (figur 5B). Fem gener (
IL1R, LOX Hotell og
TGFBR, CX3CL1 Hotell og
CYR61
) ble uttrykt forskjellig mellom de tre bestandene av normale celler. Mer spesifikt, ble normale celler ved siden av tumor (Norm), karakterisert ved et lavere ekspresjon av tumor-suppressor-gen
LOX
, reseptorer for interleukin 1 (
IL1R
) og
TGFp product: (
TGFBR
) og av en høyere uttrykk av de pro-svulst gener
CYR61 Hotell og
CX3CL1
.
Vi har undersøkt uttrykk enkelte gener på tvers av de ulike stadier av tumorprogresjon i forhold til de nettverkene identifisert av IPA-programvaren (figur 4).
cytokin
IL1β
, identifisert av IPA analyse som er knyttet til aktivering av pro-metastatiske chemokiner
CX3CL1 Hotell og
CCL20 plakater (figur 4A), var oppregulert i tumorcellepopulasjoner PIN og H-PCA (figur 5A og 5C), mens uttrykket for
IL1R1
, som mediert av aktiviteten av
IL1β
, følger en motsatt trend (figur 5A, B og C). Den pro-metastatisk kjemokin
CX3CL1
ble uttrykt på et høyere nivå i tilstøtende celle befolkningen i forhold til PIN, L-PCA og H-PCA men ikke i Meta celler (figur 5E). Ekspresjonen av
LOX
genet ble funnet høyere i alle tumorcellepopulasjoner i forhold til tilstøtende og normale celler (figur 5F) i samsvar med det faktum at høyere ekspresjon av
LOX
har vært knyttet til hypoksi indusert metastaser i bryst, hode, nakke kreft [12], [13].
uttrykk for
AGT
,
TGFB Hotell og
JAG1
ble koblet sammen i et annet nettverk IPA (figur 4B). Uttrykket av Angiotensinogen (
AGT
) er høyere i tilstøtende celler sammenlignet med PIN, L-PCA og H-PCA mens
JAG1
følger en motsatt trend (ned regulert i tilstøtende celler respekt til L -PCA, H-PCA og Meta). Hvis angiotensinogen produseres ved høyere nivåer i tilstøtende celler et av de aktiverende enzymer som omdanner produktet av
AGT
genet i angiotensin II (
ACE
) i stedet er høyere i PIN og L-PCA , noe som tyder på muligheten for anvendelse i tumorceller ved lavere stadier av prostatakreft utvikling. Oppdagelsen av at
AGT Hotell og
JAG1
ha motsatte tendenser støtter hypotesen om at
AGT
kan undertrykke uttrykk for
JAG1 plakater (Figur S8 paneler E og F). Denne forbindelsen ble rapportert av IPA programvare (figur 4B), men ble støttet av et endotelisk cellekulturforsøksmodell [14]. Disse resultatene er konsistent med hypotesen om at denne mekanismen kan også være aktuelt i prostatakreft.
En tredje IPA nettverk representerer samspillet mellom kreftfremmende faktorer
IGF1, PDGF BB Hotell og
CYR61 product: (Figur 4C). Selv om uttrykket av
PDGF
er konstant i alle cellepopulasjoner, dens reseptor (
PDGFR
) er høyere i H-PCA og Meta cellepopulasjoner i forhold til tilstøtende celler. Uttrykket av
CYR61
er høyere i tilstøtende celler forhold til tappen og Meta cellepopulasjoner (figur S8).
Diskusjoner
Vi har vist at normale epiteliale cellesignaturene er prediktive av viktige trekk ved prostatakreft. Dette funnet har potensial kliniske implikasjoner som kan det tyder på at den molekylære tilstand av normale celler har prognostisk verdi. På molekylært nivå, har nettverk analyse viste at vår tilnærming har potensial til å identifisere gener som er involvert i patogenesen av sykdommen. Disse inkluderer viktige gener som koder for cytokiner og vekstfaktorer uttrykt av normale epitelceller og kjent for å påvirke biologi av svulsten.
cytokin indusert produksjon av pro-metastatiske chemokiner
Nettverket vist i figur 4A
