Abstract
Bakgrunn
Vi bestemte nylig at dentin sialophosphoprotein (DSPP), et medlem av søsken (Small inte-bindende ligand N-koblede glykoproteiner) familie av phosphoglycoproteins, er sterkt oppregulert i menneskelige muntlig plateepitelkarsinom (OSCCs) hvor oppregulering er assosiert med tumor aggressivitet. For å undersøke effekten av
DSPP
-silencing på tumorigen profiler av munnhulekreft cellelinje, ble OSC2, short-hårnål RNA (shRNA) forstyrrelser ansatt til taushet
DSPP
i OSC2 celler.
metodikk /hovedfunnene
Flere regioner i DSPP avskrift var målrettet for shRNA interferens ved bruk HDSP-shRNA lentiviral partikler utformet for å dempe DSPP genuttrykk. Kontroll shRNA plasmid som koder for en kodet sekvens i stand til å nedbryte en hvilken som helst kjent cellulær mRNA ble brukt for negativ kontroll. Etter puromycin utvalg av stabile linjer av
DSSP
-silenced OSC2 celler, fenotypiske kjennetegnene ved oral kreft ble analysert ved western blot og RT-PCR-analyser, MTT (celle-levedyktighet), koloni-formasjon, modifisert Boyden-Chamber (migrering og invasjon), og flowcytometri (cellesyklus og apoptose) analyser.
DSPP
-silenced OSC2 celler viste endret celle morfologi, redusert levedyktighet, redusert koloni-formasjon evne, redusert migrasjon og invasjon, G0 /G1 celle-syklus arrest, og økt tumorcelle følsomhet for cisplatin-indusert apoptose. Videre, MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, Ki-67, p53, og EGFR ble nedregulert. Det var en direkte sammenheng mellom graden av
DSPP
-silencing og MMP undertrykkelse, som indikert av minste kvadraters regresjon: MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, og MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005, y = 0,809, p = 0,013)}.
Konklusjon /Betydning
DSPP
-silencing i OSC2 celle redusert fremtredende kjennetegnene ved oral tumorigenesis og gir den første funksjonelle bevis for en potensiell nøkkelrolle for DSPP i oral cancer biologi. Nedregulering av MMP-2, MMP-3, MMP-9, p53 og VEGF i
DSPP-
-silenced OSC2 celler gir en betydelig funksjonell /molekylære rammeverket for en forklaring på de mekanismer for DSPP-aktivitet i munnhulen biologi .
Citation: Joshi R, Tawfik A, Edeh N, McCloud V, Looney S, Lewis J et al. (2010) Dentin Sialophosphoprotein (DSPP) Gene-Lyddempningsplater hemmer Nøkkelsvulstfremkallende aktiviteter i Menneskelig Oral Cancer Cell linje, OSC2. PLoS ONE 5 (11): e13974. doi: 10,1371 /journal.pone.0013974
Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 1 juni 2010; Godkjent: 12 oktober 2010; Publisert: 12.11.2010
Copyright: © 2010 Joshi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institute of Dental og kraniofaciale forskning (NIDCR) /National Institutes of Health (NIH) Grant # K23DE017791-01A1 (KUEO); Medical College of Georgia Research Institute (MCGRI), Inc. Grant # STP00105W005 (KUEO); og av Wendy Will sak Cancer Foundation (KUEO). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Dentin sialophosphoprotein (DSPP) er medlem av søsken (Small Inte-bindingsligand N-bundet glykoprotein) familie av ekstracellulære matrix glycophosphoproteins [1]. Andre medlemmer av familien er bein sialoprotein (BSP), dentin matrix protein 1 (DMP1), dentin sialophosphoprotein (DSPP), osteopontin (OPN), og matrise ekstracellulære phosphoglycoprotein (MEPE) [1]. Uttrykk for søsken var opprinnelig tenkt å være begrenset til bein og tenner hvor de fungerer for å lette dentin og bein matrise mineralisering [1] – [3]. Nye rapporter indikerer imidlertid at søsken er også til stede i ikke-mineralise metabolsk aktive duktale epitelceller spyttkjertler, nephrons og ekkrine svettekjertlene hvor deres funksjon kan være forbundet med reparasjon av pericellulær og ekstracellulære matriks (ECM) proteiner skadet av frie radikaler som genereres gjennom intens metabolsk aktivitet [4] -. [6]
Tidligere rapporter har identifisert oppregulering av noen medlemmer av søsken i ulike kreftformer, inkludert bryst, lunge, og prostata cancer [7] . OPN er imidlertid søsken som det er utvetydig bevis for sin rolle i mange av trinnene i kreftutvikling og progresjon [6] – [8]. Samler data begynner å implisere andre familiemedlemmer, særlig BSP og DSPP, med roller i bestemte stadier av tumorprogresjon inkludert cellevekst, adhesjon, migrasjon, og /eller metastase [6] – [8]. Vi har nylig rapporterte oppregulering av BSP, DSPP, og OPN, i menneskelige muntlig plateepitelkarsinom (OSCCs) [9] og i noen menneskelig oral epitelial dysplasi (OEDs) [10]. Disse rapportene tyder på at DSPP er sterkt oppregulert i dårlig differensiert og histologisk aggressiv OSCC [9]. Betydelig, OEDs uttrykker DSPP med eller uten BSP viste en 4-fold tilbøyelighet for overgang til OSCC forhold til OEDs uttrykker BSP alene, noe som tyder på at DSPP uttrykk økt risiko for lokale barne OSCC mens BSP uttrykk redusert slik risiko [10]. Men det er foreløpig ingen data på funksjonelle og mekanistisk rolle DSPP i oral cancer utvikling og progresjon.
I denne studien designet for å etablere funksjonelle sammenhenger mellom DSPP uttrykk og den biologiske oppførsel av OSCC, kort hårnål RNA (shRNA) interferens ble brukt til å produsere stanse av
DSPP
i OSCC cellelinje OSC2.
DSPP
-silenced OSC2 celler ble deretter evalueres for å fastslå i hvilken grad støydempere undertrykker eller opphever taste ondartede fenotypiske kjennetegn OSC2 celler ved hjelp av ulike standard
in vitro
teknikker.
resultater
DSPP er oppregulert i orale kreftcellelinjer, OSC2 og SCC25, og i dysplastisk oral epitel cellelinje, DOK
OSC2 og SCC25 er menneskelige OSSC cellelinjer avledet fra regional livmorhalslymfeknutemetastase av en primær menneskelig tunge plateepitelkarsinom, og en primær tunge plateepitelkarsinom, henholdsvis [11] – [13]. DOK er en human oral epitel dysplastisk cellelinje avledet fra rygg tungen [14]. For å evaluere de endogene ekspresjonsnivåene av DSPP-protein og mRNA i OSC2, SCC25, og DOK celler, western blot og semikvantitativ-revers transkriptase (RT) -PCR analyser ble utført på hel-cellelysater og de totale RNA-ekstrakter, henholdsvis, slik det er beskrevet Materiell og metoder. Positive og negative kontroller bestod av hel-cellelysater og total RNA ekstrakter fra MCF-7 celle (avledet fra brystadenokarsinom) og HOK-celler (avledet fra primær kultur av humane keratinocytter oral), respektivt. DSPP er betydelig oppregulert i OSC2, SCC25, og i DOK sammenlignet med HOK celler ved det translasjonelle (figur 1A) og transkripsjon (figur 1B) nivåer. Disse
in vitro
funnene er i tråd med resultatene av våre nyere studier indikerer oppregulering av DSPP i OSCC fra pasienter og sin fullstendige mangel på normal munnslimhinnen epitel [9].
(A) Western blot (WB) og densitometriske analyser viser signifikant oppregulering av DSPP i OSC2, SCC25, og DOK celler sammenlignet med HOK negative kontroller. Det er en basal ( 10%) nivå av DSPP uttrykk i grunnskolen HOK celler. MCF7 cellelinje kjent for å uttrykke DSPP ble anvendt som positiv kontroll. Normalisering var med β-aktin. (B) semikvantitativ RT-PCR analyse viser DSPP-mRNA uttrykk i OSC2, SCC25, og DOK celler konsistente med WB resultater i (A) med ikke målbare DSPP-mRNA nivåer i HOK celle. Normalisering var med GAPDH. Celler som brukes i studien: OSC2, en human OSCC cellelinje avledet fra regional livmorhalslymfeknutemetastase av en primær menneskelig tunge plateepitelkarsinom; SCC25, en primær tunge plateepitelkarsinom; DOK, en human oral epitel dysplastisk cellelinje avledet fra dorsal tunge; og MCF7 (akronym of Michigan Cancer Foundation – 7)., en human brystkreft cellelinje isolert fra en 69 år gammel kaukasisk kvinne
Transient DSP-shRNA transfeksjon resulterer i endret morfologi OSC2 celler
Etter å ha etablert baseline uttrykk nivåer av DSPP i to OSCC cellelinjer, fortsatte vi å undersøke hvor stabil
DSPP
-silencing via lentiviral-mediert liten hårnål RNA (shRNA) forstyrrelser påvirker tumorigene profiler OSC2 celler. Vi valgte OSC2 celler over deres SCC25 motstykke på grunn av de beviselig høyere uttrykk nivåer av DSPP i OSC2 celler ved både protein og mRNA-nivåer (figur 1) og også fordi OSC2 cellene oppviser meget sterk invasive fenotype, noe som gjenspeiles i eksperimentelle nakne musemodeller [11 ]-[1. 3]. For å kunne vurdere de umiddelbare virkningene av DSP-shRNA transfeksjon på OSC2 celle morfologi, ble transfektert celler sammen med kontroller fotografert på 24- og 48-timer etter transfeksjon (forbigående stadium) før oppstart av puromycin utvalg av stabilt transfekterte celler. Som vist på figurene 2C og 2F (illustrerende områder fotografert), DSP-shRNA transfektert OSC2 celler oppviste en langt større antall celler med betydelig tap av celle-celle-kontakt og en mer ovale og uregelmessig omriss sammenlignet med ikke-transfekterte OSC2 cellene (Figur 2A) eller eggesekvensstyring (figurene 2B, 2E). Fluorescens mikroskopi av transient transfektert coGFP-shRNA kloner viste en sterk grønn fluorescens indikerer høy prosentandel transfeksjonseffektiviteten (figur 2D). Vi fortsatte å etablere stabile DSP-shRNA-forstummet OSC2 celler via puromycin utvalg for å undersøke omfanget av eventuelle endringer i andre fremtredende fenotypiske kjennetegn på OSCC.
(A) OSC2 celler før lentiviral-transduced transfeksjon med DSP-shRNA stille karakteristisk morfologi av levedyktige epiteliale kreftceller i kultur. (B, E) Egge (kontroll) sekvens transfektert OSC2 celler på 24- og 48 h utstilling levedyktige epitelceller og morfologi sammenlignes med (A). (C, F; illustrer områder) DSP-shRNA transfeksjon OSC2 celler som utviser betydelig økt antall celler med tap av celle-celle kontakt, mer avrundet og uregelmessig disposisjon, fremtredende atom blebbing, og mobilnettet oppløsning i samsvar med de av effete og døende celler på 24- og 48-h, henholdsvis. (D) copGFP transfektert OSC2 celler bekrefte meget høy transfeksjon effektivitet (grønn fluorescens).
Generering av et stabilt
DSPP
-silenced OSC2 cellelinje
Stabile linjer DSP-taushet og eggesekvens kontroller ble valgt ved hjelp av puromycin antibiotika som beskrevet i materialer og metoder. Effektiviteten av DSP-shRNA lentiviral konstruere i stabilt stanse DSPP i OSC2 celler ble verifisert av western blot og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyser. Som vist i figur 3, western blot og densitometriske analyser av seks forskjellige DSP-shRNA transfektert OSC2 stabile linjer viste DSPP lyddemping i området fra ~ 5% [linjen (L) 4] for å ~95% L2 sammenlignet med stabil shRNA-egge sekvens (SHC ) kontroll (figur 3A). Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved immunfluorescens konfokalmikroskopi viser betydelig redusert DSPP signal (grønn fluorescens) i L2 stabile linjer sammenlignet med kontroll (figur 3C).
Stall linjer utvalg av lentiviral-transduced shRNA ble gjennomført via puromycine utvalg. (A) WB og tilsvarende densitometriske analyser av nivået av DSPP-stanse følgende utvalg av seks stabile linjer viser nivået av tie i området fra ~ 5% (line [L] 4) for å ~95% (L2) sammenlignet med egge sekvens (SHC) kontroll. (B) QRT-PCR-analyse viser signifikant redusert DSPP-mRNA i DSPP-stilnet L1 (mer enn 90%) og L2 (mer enn 95%)-celler (som oppviser den mest knockdown på IM) i forhold til SHC kontroll. (C) Immunfluorescence konfokalmikroskopi verifiserer DSPP-lyddemping som betydelig redusert DSPP signal (grønn fluorescens) i L2.
Parallelt verifisert vi effektiviteten av DSP-shRNA i nedbrytende DSPP mRNA i lentivirally infiserte celler ved QRT-PCR ved anvendelse av L1 og L2 som oppviser den mest knockdown av de seks linjer (se figur 3A) på western blot. Resultatene indikerer betydelig redusert DSPP mRNA-nivåer i L1 (mer enn 99%) og L2 (mer enn 95%) sammenlignet med shRNA SHC styreledningen (figur 3B). De C
T verdier hentet fra QRT-PCR analyse av de relative DSPP mRNA nivåer i SHC kontroll og
DSPP
-silenced L1 og L2 var normalisert med husholdningsgenet GAPDH. Dette shRNA-mediert effekt var spesifikk, som GAPDH nivåer ikke avvike betydelig blant DSP-shRNA transfekterte celler og kontroller.
DSPP
-silencing reduserer p53, Ki-67 og PCNA, og hemmer celleproliferasjon og kolonidannelse i OSC2 celler
virkningene av
DSPP
-silencing på nivåene av proliferativ markør, Ki-67, PCNA, og cellesyklusregulator p53 ble analysert ved hjelp western blot for alle seks
DSPP
-silenced OSC2 stabile linjer. Sammenlignet med SHC kontrolledning, nivåene av Ki-67, PCNA, og p53 ble betydelig redusert, noe som indikerer at DSPP kan forbedre spredning i orale cancerceller via mekanismer som involverer p53, Ki-67, og PCNA (figur 4A).
(A) WB av ki-67, PCNA, og p53 følgende
DSPP
-silencing i OSC2 cellene vise betydelig nedregulering for hver av disse proteinene. (B) Statusen til
DSPP
-silenced OSC2 celler i forhold til foreldre OSC2 og SHC kontroll utført via MTT analysen viser redusert celleproliferasjon av 53% for L2 (demonstrere mest grad stanse) sammenlignet med 0,05, n = 3). (C) L2 celler dannes mindre og betydelig færre ( 25%) kolonier i soft agar sammenlignet med foreldre OSC2 og SHC kontrollceller (* p 0,05).
For å fastslå omfanget som
DSPP
stanse påvirker spredning av OSC2 celler, gjennomførte vi MTT analyser for tre av de seks
DSPP
-silenced stabile linjer som inkluderte L2 demonstrere den høyeste grad av
DSPP
-silencing, L4 demonstrere minst stanse, og L6 viser moderat demping. Sammenlignet med SHC kontroll og sperre OSC2 cellelinjer, stanse av
DSPP
var forbundet med et gjennomsnitt på 53% reduksjon i celleformering på dag 6 i L2 (figur 4B; P 0,05, n = 3). Med hensyn til evnen til å danne kolonier, L2-celler dannet kolonier i bløt agar som var betydelig mindre og færre enn de fra SHC kontroller, og fra foreldre OSC2 celler (Figur 4C). Antallet kolonier som dannes i L2-celler ble signifikant redusert ( 25% av moder OSC2 celler, og omtrent 20% av kontroll SHC) som vist i figur 4C søylediagram. Disse resultatene tyder på en betydelig rolle for DSPP i oral cancer cellevekst og proliferasjon. L2 celler som viser den mest betydelige graden av
DSPP
-silencing av alle seks linjer ble ansatt for undersøkelser av effektene av tie om migrasjon og invasjon, og på celle-syklus aktiviteter.
DSPP
-silencing reduserer OSC2 migrasjon og invasjon
som beskrevet i Materiale og metode delen, vi gjennomført invasjon og migrasjonsanalyser med modifiserte Boyden Chamber eksperimenter for å finne ut i hvilken grad
DSPP
lyddemping påvirker migrasjon og invasjon av OSC2 celler. Som vist i figur 5, å stanse all
DSPP plakater (L2) ble redusert invasjon (figur 5A) og migrasjon (figur 5B) av OSC2 celle med 25% i hvert tilfelle, sammenlignet med SHC kontroll og paren OSC2 celler (p L2 =
DSPP
-silenced OSC2 celler linje 2; OSC2 = foreldre (uten knockdown) osc2 celler, M1 = levende celler; M2 = avtale celler.
Videre er det nivå av EGFR ble signifikant redusert i L2-celler sammenlignet med SHC kontroller, noe som tyder på at EGFR-inhibering er nødvendig for cisplatin-indusert apoptose i OSC2 celler (figur 7C). Sammen er disse resultatene tyder på at DSPP stanse i OSC2 celler, mens noe som resulterer i G
0 /G
1 rest (se figur 6A), og derfor redusert proliferativ aktivitet, øker ikke apoptose; kan imidlertid DSPP undertrykkelse betydelig forbedre følsomheten OSC2 celler til cisplatin-indusert apoptose via mekanisme som involverer nedregulering av EGFR.
Stall
DSPP
-silencing i OSC2 celler undertrykker MMP-2, MMP -3, og MMP-9 uttrykk
Tidligere rapporter har identifisert spesifikke interaksjoner mellom noen medlemmer av søsken familie av proteiner med spesifikke matriksmetalloproteinaser (MMP). Nærmere bestemt, for å BSP partnere med proMMP-2, OPN med proMMP-3, og DMP-1 med proMMP9 i rekkefølge å aktivere de respektive proteasene [4], [17]. Men MMP partner (e) til DSPP og MEPE, om noen, har ikke blitt identifisert. Likevel, vi søkt å bestemme uttrykket status for disse tre kjente søsken-partnerskap MMP i alt seks generert
DSPP
-silenced OSC2 linjer.
Som vist ved western blot og densitometriske analyser, nivåer både pro- og aktiverte MMP-2, MMP-3, og MMP-9 ble redusert i alle unntatt én av de seks
DSPP
-silenced OSC2 linjer sammenlignet med SHC kontroller (8A, 8B). Like viktig er en direkte sammenheng mellom graden av
DSPP
-silencing og MMP undertrykkelse, som indikert av minste kvadraters regresjonsanalyse gjennom origo: MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001)}, MMP-3 {(y = 0.994x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, og MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005 , y 0,809, p = 0,013); Figur 8C)}. Men den nivå av MMP undertrykkelse ikke signifikant forskjellig mellom pro- og spaltet former. Tilsvarende reduksjon av VEGF-nivåer i stabil
DSPP-
-silenced linjene varierte fra mindre enn 5% (L4) til 86% (L2) med graden av undertrykkelse direkte proporsjonal med graden av
DSPP
-silencing (figur 8D), noe som tyder på en doseavhengig forhold mellom DSPP ekspresjon og angiogen aktivitet i OSCCs. Sammen er disse resultatene tyder på en regulerende rolle for DSPP i oppregulering og aktivering av søsken-samarbeid MMP samt angiogenese i munnhulekreft.
(A) WB og (B) tilsvar densitometriske analyser viser betydelig ned- regulering av pro- og aktiverte MMP-2, MMP-3, og MMP-9 i alle bortsett fra én (L4) av fem
DSPP
-silenced stabile linjer. (C) Minst torget regresjonsanalyser viser betydelig reduserte nivåer av pro-og aktivert MMP-2 {(y = 0.850x, p 0,001) (y = 1.156x, p 0,001)}; MMP-3 {(y = 0.0.994x, p 0,001) (y = 1.324x, p = 0,004)}, og MMP-9 {(y = 1.248x, p = 0,005, y = 0,809, p = 0,013) }, og en direkte sammenheng mellom graden av
DSPP
-silencing og MMP undertrykkelse; Men den nivå av MMP undertrykkelse ikke signifikant forskjellig mellom pro- og spaltet former. (D) Densitometrisk analyse av WB av VEGF-nivåer viste nedregulering som strekker seg fra mindre enn 5% (L4) til 86% (L2) med nivået på nedregulering direkte proporsjonal med graden av
DSPP
– lyddemping.
In vivo
anti-tumor effekter av
DSPP
-silencing på OSC2 celler
Den anti-tumor effekt av DSPP- stanse i OSC2 celler ble testet i to Balb /c naken mus implantert subkutant DSPP-forstummet OSC2 celler (L2 linjer) på venstre flanke, mens egge sekvens kontroll (SHC linjer) ble implantert subkutant på høyre flanke. Som vist i Supplerende Figur S1, ble det observert en trend mot bremset tumorutvikling og vekst som resulterer i en samlet mindre tumorvolumet for L2 tumor sammenlignet med SHC kontroll svulster i en periode på 6 uker [Tall S1A og S1G (spredningsplott]. Histologisk evaluering av hematoxylene og eosin (H E) seksjoner viste godt differensiert og aggressiv plateepitelkarsinom knyttet til SHC (kontroll) avledet tumorer (figur S1B) sammenlignet med de mindre differensierte L2 avledet tumorer (figur S1C) i tillegg L2. avledet svulster tendens til å danne i små krympende øyer med mer synlig tumor nekrose enn SHC avledet svulster (figur S1C). Betydelig, immuostain for DSPP bekreftet DSPP reduksjon i L2 avledet tumorer (figur S1E) sammenlignet med høy DSPP nivå i SHC avledet tumorer (figur S1D). Figur S1F er et representativt pre-immun IgG negativ kontroll. Disse resultatene antydet at de reduserte tumorigen kjennetegnene på OSCC følgende
DSPP
-silencing observert i
in vitro
eksperimentene beskrevet ovenfor er reproduserbar
in vivo
.
Diskusjoner
Denne studien, som tar sikte på å få innsikt i den funksjonelle rollen DSPP i biologi kreft i munnhulen, er designet som en logisk oppfølger til våre tidligere rapporter som indikerer at DSPP er sterkt oppregulert i aggressive menneske OSCCs [6] og i de OEDs med betydelig høy tilbøyelighet for overgang til invasiv OSCC [10]. Så langt vi kjenner til, representerer vår nåværende rapport den første demonstrere oppregulering av DSPP i to muntlige kreftcellelinjer i forhold til, i beste fall, basal nivå i grunnskolen normale orale keratinocytter (NOK). Mer vesentlig, er dette den første rapporten om en studie som undersøkte effekten av
DSPP
-silencing på tumorigen profiler av en munnhulekreft cellelinje.
DSPP
, den største medlem av SØSKENMODERASJON genfamilien, koder for et ~1300-aminosyreprotein post-translasjonelt spaltet i to hovedproteiner, tannben sialoprotein (DSP) og dentin fosfoprotein (DPP, også kalt phosphorin) [2], [18] – [ ,,,0],20]. Ekspresjonen av DSP og DPP ble opprinnelig tenkt å være begrenset til dentin (og odontoblaster), hvor de spiller en viktig rolle i mineralisering, med DPP blir mer rikelig av de to proteinene [2], [19], [21]. Imidlertid påfølgende studier har vist at lavere nivå av ekspresjon DSPP er tilstede i bein [1] – [3]. Nyere studier har også vist betydelige nivåer av uttrykk for DSPP (og andre medlemmer av søsken familie) i metabolsk aktive duktale epitelceller [4] – [6], og dens oppregulering i en undergruppe av brystkreft, oral, lunge og prostata kreft [6] – [9]. Fordi DSPP inneholder høyt konserverte MQXDPP motiv som er vist i DMP1 å være involvert i proteolytisk prosessering, er det blitt antatt at de samme tolloid-relaterte proteaser (særlig BMP1) henge fast DSPP inn i DSP og DPP [19], [20]. Proteolytisk behandling av DSPP av MMP-2, MMP-20, og kallikrein-relaterte peptidase 4 har blitt rapportert [19].
Det monoklonale antistoff, LF-Mb21, anvendt i denne studien gjenkjenner både full-lengde (DSPP) og DPP del, men ikke DSP. Det 97 kDa proteinbånd i figur 1A er en indikasjon på et spaltningsprodukt, DPP, men med lavere molekylvekt band som ville representere DSP var ikke til stede. Videre er molekylvektbånd tilnærmet lik i hele lengden DSPP var fraværende. Etter tie med en konstruksjon design som målrettet full lengde
DSPP
, bare svært lave nivåer av 97KD bandet ble sett i de fleste av de stabile linjer, noe som indikerer stanse av
DPP Hotell og full lengde
DSPP
. Selv om det kan tenkes at vår knockdown strategi også kan ha redusert DSP nivå, vi kan ikke fastslå, basert på vår nåværende data, om de ulike effektene av knockdown på tumorigent profilen til OSC2 celler som er beskrevet eller ikke var et resultat av redusert nivå av DPP, DSP, eller begge (eller til og med intakte DSPP). Det er likevel svært tankevekkende på dette punktet at, i det minste, kan DPP eller dets modifiserte former spille en rolle i tumorigen regulatoriske aktiviteter orale kreftceller. Videre studier, inkludert strategier (f.eks legge noen furin inhibitorer, jf. Referanse [20]), som fører til at cellene til å skille ut bare full lengde DSPP som kunne brukes som en standard vil være nødvendig for senere henvendelser adresserings noen bestemt mekanistisk rolle for DPP DSP eller full lengde DSPP i biologi oral cancer.
Anmeldelser av spesifikke gener produkter profilert i denne studien, etter
DSPP
stanse, tyder på at ingen av dem har, til nå, vært forbundet med den potensielle rolle DSPP i kreft i munnhulen. Som et utskilt protein DSPP representerer et ideelt mål for en shRNA-mediert stanse, og ved å analysere de funksjonelle effekter av
DSPP
-silencing i OSC2, viser vi at
DSPP
-silencing nedregulerer viktige proteiner involvert i tumorcelleformering, angiogenese, og lokal invasjon. Spesielt våre data viser at stanse av
DSPP
i orale kreftceller er forbundet med betydelig nedregulering av søsken-samarbeid MMP, VEGF, p53, og celleproliferasjonsprosesser markører Ki-67 og PCNA. Up-reguleringer av MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, og p53 med nivåer sammenfaller med utfallet og prognostiske parametre som avansert stadium av sykdommen, invasjon og metastasering har tidligere vært forbundet med oral cancer [22] – [ ,,,0],24]. Således våre resultater indikerer en betydelig nedregulering av MMP-2, MMP-3, MMP-9, VEGF, og p53 følgende stabil
DSPP
-silencing i OSC2 celler antyder at DSPP kan operere oppstrøms for disse proteiner produkter. Videre er nedregulering av p53 indikerer at DSPP kan direkte, eller i det minste eksternt, regulere aspekter av cellesyklusaktiviteten.
Nye rapporter tyder også på at MMP-mediert remodellering av ekstracellulær matriks (ECM) er faktisk en av flere initierende hendelser slik OSCC celler til å invadere omkringliggende stroma [25]. Det er postulert at tidlig ekspresjon av MMP ved tumor eller omkring stromale celler muliggjør ombygging av ECM, noe som resulterer i frigjøring av vekstfaktorer for å sikre en levedyktig nidus for primær tumorvekst [26], [27]. I sin tur fører til tumorvekst angiogenic switch under hvilken balansen av proangiogenic faktorer som VEGF overvinner ekspresjonen av angiogene inhibitorer [28]. VEGF-mediert angiogenese er et kjennetegn på OSCC progresjon [25], [29], og MMP-2 og MMP-9 har begge vært implisert i induksjon av den angiogene bryter i forskjellige modeller [26], [27].
