Abstract
Ukontrollert spredning, en viktig funksjon i kreftceller, er ofte utløst av feil i cellesyklus regulatorer som protein kinaser. Nylig har cellesyklusrelaterte proteinkinaser blitt attraktive mål for anti-kreftterapi, fordi de spiller fundamentale rolle i cellulær proliferasjon. Men, protein kinase-målrettede medikamenter som er utviklet så langt ikke vise imponerende kliniske resultater og også vise alvorlige bivirkninger; Derfor er det uten tvil et behov for å undersøke nye legemidler som målretter andre proteinkinaser som er kritiske i cellesyklusprogresjon. Vaccinia relaterte kinase 1 (VRK1) er en mitotisk kinase som fungerer i cellesyklus regulering av fosforylering cellesyklusrelaterte underlag som barriere-til-autointegration (BAF), histon H3, og cAMP respons element (CRE) -binding protein (CREB). I vår studie har vi identifisert luteolin som hemmer av VRK1 ved screening en liten molekyl naturlig stoff bibliotek. Her vurderte vi effekten av luteolin som VRK1 målrettet inhibitor for å utvikle en effektiv anti-kreft strategi. Vi har bekreftet at luteolin reduserer VRK1-mediert fosforylering av cellesyklusrelaterte substrater BAF og histon H3, og direkte kommuniserer med det katalytiske domene av VRK1. I tillegg regulerer luteolin cellesyklusprogresjon ved å modulere VRK1 aktivitet, som fører til undertrykkelse av cancer celleproliferasjon og induksjon av apoptose. Derfor antyder vår studie at luteolin-indusert VRK1 hemming kan bidra til å etablere en ny cellesyklus-målrettet strategi for anti-kreft terapi
Citation. Kim YS, Kim SH, Shin J, Harikishore A, Lim JK Jung Y, et al. (2014) Luteolin undertrykker Cancer Cell Proliferation av Targeting Vaccinia-Related kinase 1. PLoS ONE 9 (10): e109655. doi: 10,1371 /journal.pone.0109655
Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 24 april 2014; Godkjent: 02.09.2014; Publisert: 13 oktober 2014
Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle Relevent data er i avisen og dens Suppoting Informasjon filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Research Foundation of Korea (NRF) (2013-056085), Next-Generation BioGreen 21 Program (No. PJ009503) Rural Development Administration, republikken Korea. Dette arbeidet ble også støttet av Brain Korea 21 program av den koreanske departementet for utdanning, vitenskap og teknologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tumorigenesis er assosiert med en feilregulering av celledeling, som ofte utløses av feil i reguleringen av protein modulatorer som spiller viktige roller i cellesyklus sjekkpunkter og progresjon [1]. Blant de proteiner som utgjør cellesyklus maskiner, har de siste terapeutiske strategier forsøkt å dra nytte av målretting flere cellesyklus proteinkinaser for å forbedre legemiddel selektivitet og terapeutisk effektivitet [2], [3]. Følgelig har slike cellesyklusrelaterte proteinkinaser blitt attraktive mål for anticancerterapi, på grunn av deres grunnleggende funksjoner i å kontrollere cellevekst. For eksempel ble små-molekyl hemmere av DNA skade sjekkpunkt proteiner chk 1 og 2 brukes med den hensikt å forårsake cellesyklus og apoptose under inter [4] – [6]. I tillegg har noen mitotiske inhibitorer rettet mot cyclin-avhengig kinase (CDK) familie, Aurora kinaser, og Polo-lignende kinaser er utviklet for å provosere hindret mitotisk oppføring, mitotisk arrest, og mitotiske katastrofer ved å forårsake svikt i kromosom kondens, kromosom justering, spindel formasjon, og spindelenheten kontrollpunkt [1] – [3]. For flere lovende inhibitorer, har kliniske forsøk allerede blitt utført for å utvikle en ny klasse av anti-kreft medikamenter. I de kliniske forsøksfasen, dessverre, deres kliniske effekten ikke viser imponerende resultater, men snarere utløst begrensede responser eller uventede alvorlige bivirkninger [3]. Likevel er effektiv inhibering av visse faser av cellesyklusen fortsatt betraktet som en verdifull strategi for å behandle kreft, således identifisering av nye, cellesyklus-spesifikke, druggable målproteiner og utviklingen av deres selektive inhibitorer som kan ha potensial til å bli kjemoterapeutiske midler er utvilsomt kreves.
i denne forbindelse, undersøkte vi hvorvidt Vaccinia-relaterte kinase 1 (VRK1) kan være et tilfredsstillende molekylært mål i henhold til den cellesyklusen målrettingsstrategi. VRK1, som spesifikt fosforylerer serin og treoninrester, er et mitotisk kinase som spiller en viktig rolle i cellesyklusprogresjon ved å delta i mange forskjellige celledelingsprosesser [7], [8]. VRK1 uttrykk er spesielt rik på sterkt formerende celler slik som føtale og tumorvev, og viser i hovedsak en tendens til å oppregulere i den mitotiske fase av cellesyklusen [9], [10]. I G1 /S faser, fremmer VRK1 cyklin D1 (CCND1) uttrykk for å indusere G1 /S overgang ved fosforylering cAMP-responselementet (CRE) -binding protein (CREB) og derved øke bindingsaffiniteten CREB til CCND1 promoteren [11 ]. Videre tar VRK1 del i kjernefysisk konvolutt (NE) dynamikk som NE montering /demontering via fosforylering av barriere-til-autointegration (BAF) under interfase og mitotiske inngang /utgang [12]. BAF er en kromatin-assosiert protein som virker som et bindeledd mellom DNA og NE [13]. Den dynamiske status for BAF under cellesyklusprogresjon er strengt regulert ved VRK1 aktivitet; BAF fosforylering av VRK1 stimulerer kromatin utgivelse fra NE, og rekrutterer NE-assosierte proteiner til kjernen regionen i løpet telophase [12], [14]. I den mitotiske fasen, påvirker VRK1 histone modifisering av fosforylering histon H3 [10]. Fosforylering av histon H3 Ser10 av VRK1 og andre flere mitotiske kinaser er en velkjent histone kode indusere kromatin kondens på mitotisk oppføring eller G2 /M fase overgang. I cellesyklus, er VRK1-mediert histon H3 fosforylering påvirket av andre regulatorer. Mitogen-aktivert protein kinase fosfatase 2 (MKP2), en dobbel-spesifisitet fosfatase som inaktiverer MAP-kinaser (MAPK), spiller en rolle som en negativ regulator av VRK1-mediert histon H3 fosforylering ved den mitotiske fase [15]. Under inter, makro histon H2A1.2 (MacroH2A1), en kjerne histon variant, undertrykker tilnærming av VRK1 til histon H3 ved deponering [16].
I tillegg nyere studier også har vist betydningen av VRK1 i fremgangsmåte for celle-proliferasjon. VRK1 har en kritisk rolle ikke bare i somatiske cellevekst, men også i bakterie-celle utvikling [17], [18]. Videre VRK1 spiller også en rolle i opprettholdelsen av den telomere ved fosforylering hnRNP A1, som stimulerer telomerase og binder seg til den telomere DNA-sekvensen [19]. VRK1 er nødvendig for G0 utgang, Golgi fragmentering, DNA-skade-indusert apoptose, og stressresponser, som er nødvendige for å opprettholde cellesyklusprogresjon [20] – [24]. Således, tatt i betraktning cellesyklusrelaterte karakteristikker av VRK1, er identifiseringen av VRK1 inhibitor som er nødvendig for anti-cancer-terapier. Selv om det er rapportert at noen medikamenter for å hemme andre proteinkinaser kan hemme kinase aktiviteten til VRK1 [25], de hemmende mekanisme og anti-kreft effekt gjennom VRK1 hemming fortsatt var unnvikende.
I vår studie har vi vist en små-molekyl naturlig forbindelse bibliotek og identifisert luteolin (3 «, 4», 5,7-Tetrahydroxyflavone) som små-molekyl for å inhibere VRK1 kinase-aktivitet. Luteolin er et naturlig forekommende flavonoid som er vanlig utbredt i planter og er godt kjent for å opptre som en kraftig antioksidant [26]. I tradisjonelle asiatiske rettsmidler, har luteolin-rike urter blitt brukt som tradisjonell medisin for behandling av mange sykdommer som smertefulle tilstander, inflammatoriske sykdommer, hypertensjon og kreft [27]. I dag har mange linjer av bevis viste tallrike farmakologiske virkninger av luteolin, inkludert anti-kreft, anti-inflammasjon, og anti-allergiske aktiviteter [27], [28]. Selv om det har blitt fastslått at den anti-kreft egenskaper luteolin er forbundet med pro-apoptotiske virkninger, anti-proliferative effekter, og hemming av angiogenese og metastase, de molekylære mekanismer som ligger under sin anti-kreft aktivitet er ikke helt klarlagt [29] , [30].
Her vi bekreftet at luteolin viser betydelig redusert fosforylering av cellesyklusrelaterte substrater histon H3 og BAF, og direkte kommuniserer med VRK1, spesielt til kai ved sin katalytiske domene. Videre demonstrerte vi at luteolin kan indusere cellesyklus-stans ved å inhibere VRK1 kinase-aktivitet, som fører til undertrykkelse av kreftcellevekst og apoptose. Derfor foreslår vi at luteolin er en hemmer av VRK1, som er en av gode kandidater til å behandle kreft.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Luteolin var av analytisk klasse og kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Eupatilin og Wogonin ble gitt fra Dr. Baek Lab i Kyung-Hee University. Disse forbindelsene ble fremstilt i DMSO (Sigma-Aldrich). [
32P-γ] ATP ble kjøpt fra Perkin Elmer /NEN (Waltham, MA, USA) og rekombinant histon H3 ble kjøpt fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Andre rekombinante proteiner som glutation sulfotransferaseaktivitet (GST), GST-VRK1, GST-aurora kinase B (AURKB) og Hans-BAF ble uttrykt i
E.coli plakater (BL21) og ble renset ved affinitetskromatografi. Lamin B, glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og GST antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA) og histon H3 fosfor-Ser10 antistoff ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK) og de som mot histon H3, fosfor-CREB og CREB ble hentet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). VRK1 og fosfor-BAF (gave fra Robert Craigie, NIH, USA) antistoff ble generert i kanin ved hjelp av rensede VRK1 proteiner. Hoechst 33342 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. CNBr-sefarose 4B ble anskaffet fra Sigma-Aldrich.
Cellekultur og transfeksjon
BEAS-2B-celler ble erholdt fra ATCC (Manassas, VA). Tidligere beskrevet HeLa [31], HEK293A [16], SH-SY5Y [32], U2OS [32], og A549 [31] celler ble anvendt i denne studien. Den humane cervikal adenokarsinom-cellelinje HeLa, ble humane embryonale nyrecellelinje HEK293A, human bronkial epitelcellelinje BEAS-2B og den humane neuroblastom-cellelinje SH-SY5Y dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Den humane osteosarcoma-cellelinje U2OS og human lunge adenokarsinom-cellelinje A549 ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Disse cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2. Transient transfeksjon av HeLa og U2OS celler ble utført ved hjelp av en MP-100 microporator (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll.
Protein kinase assay
En in vitro kinase assayet ble utført i henhold til fremgangsmåtene som tidligere er beskrevet [31]. I korte trekk, ble en in vitro kinase analyse utføres i kinasebuffer inneholdende GST-VRK1, GST-AURKB, His-BAF, histon H3, og [32P-γ] ATP. De kinaseanalyse Blandingene ble inkubert ved 30 ° C i 30 minutter og radioaktive inkorporering ble detektert ved autoradiografi. Mengdene av proteiner som brukes i kinasebestemmelser ble målt ved anvendelse av sølvnitrat (Sigma-Aldrich) eller Coomassie-blått (Sigma-Aldrich).
Celleviabilitet assay
Cellene ble behandlet i 24 timer eller 48 timer med flavonoider (luteolin, eupatilin, og wogonin) eller med dimetylsulfoksyd (DMSO) som en kontroll. Cellelevedyktigheten ble vurdert ved å bruke 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetarazolium-bromid (MTT) assay i henhold til produsentens protokoll. Den halvmaksimalt hemmende konsentrasjon (IC50) ble bestemt ved bruk Graphpad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA).
Luteolin-Sepharose 4B forberedelse og in vitro pull-down analysen
Sepharose 4B vulst pulver ble suspendert i aktivering løsning for koblingsreaksjon. Aktiverte Sepharose 4B kuler ble inkubert i koplings oppløsning med luteolin på en rotasjonsrister ved 4 ° C over natten. For in vitro trekke ned analysen, ble GST-VRK1 og GST inkubert med luteolin-Sepharose 4B kuler i reaksjonsoppløsningen i 12 timer. Proteiner bundet til kulene ble analysert ved immunblotting. Vi har gjennomført de detaljerte prosedyrer som ble beskrevet tidligere [33].
Surface plasmonresonans (SPR) assay
De kinetiske parametere av samspillet mellom VRK1 og luteolin ble evaluert av en SPR analyse ved hjelp det automatiske systemet SR7500DC (Reichert Technologies, Depew, NY, USA). For fremstilling av VRK1-konjugert gull chip, ble VRK1 immobilisert på en CMDH brikke (# 13206066) og deretter luteolin, eupatilin og wogonin ble injisert på overflaten av brikken ved de angitte konsentrasjoner, fortynnet i 10 mM fosfatbufret saltvann (PBS ) inneholdende 1% DMSO som en rennende buffer. Analyse av innsamlede data ble utført av scrubber2 programvare (BioNavis, Tampere, Pirkanmaa, Finland).
ligand docking analysen
En homologi modell utviklet fra X-ray struktur av VRK1 ble ansatt for å vurdere molekylær interaksjon og binding modus for nylig identifiserte VRK1 fører. I denne studien, modellen strukturen var energi minimert for 5000 skritt av sjarmen kraftfelt og konjugert gradient metode i Discovery Studio 3.0 suite [34]. 3-D koordinatene luteolin ble utarbeidet etter den Forbered Ligand modul og energi minimert for 2000 trinn ved hjelp av Smart Minimizer algoritmen i Discovery Studio 3.0 suite. Den molekylære docking program GOLD 5.0 ble benyttet for å vurdere binding modus av VRK1 fører. Våre tidligere NMR bindende studier har identifisert de viktigste rester som er opprørt over ligand binding; disse ble brukt for å definere det aktive sete [34]. Standardinnstillinger og scoring funksjoner, GOLD PLP og GOLD scoring funksjon, var ansatt å score tilkoblings interaksjoner og deres sannsynlige dokkemodus bindende.
flowcytometri analyse
For cellesyklusanalyse, HeLa-celler ble transfektert med GFP, GFP-VRK1, GFP-BAF og deretter behandlet med DMSO (bærer) og 10 uM luteolin. Etterpå ble cellene fiksert med 70% etanol inneholdende 0,4% Tween-20 og farget med propidiumjodid i PBS. Cellecyklusen og cellulær DNA-innholdet ble analysert ved hjelp av strømningscytometri i et FACSCalibur strømningscytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Datainnsamlingen ble utført med Cell quest program (BD Biosciences). For apoptose-analyse, ble HeLa-celler behandlet med luteolin på en konsentrasjonsavhengig måte og dobbel farget med propodium jodid og Annexin V-allofykocyanin. Celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri.
Immunofluorescence farving
HeLa-celler ble transfektert med rødt fluorescerende protein (RFP), RFP-VRK1, GFP, og GFP-BAF ved hjelp microporation, og deretter behandlet med 10 uM av luteolin i 24 timer. Deretter ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd i 20 minutter og blokkert med 10% FBS i PBS i 1 time ved romtemperatur. Celler ble farget med Hoechst 33342 i PBS i 20 minutter ved romtemperatur og vises ved hjelp av en konfokal laser-skanning mikroskopi (Fluoview FV1000, Olympus, Tokyo, Japan). HeLa-celler ble behandlet med eller uten luteolin (10 uM) i 24 timer. Deretter gjennomførte vi detaljerte prosedyrer som ble beskrevet, og deretter ble cellene farget med Lamin B antistoff og vises ved hjelp av Zeiss fluorescens mikroskop (Carl Zeiss Ltd., Jena, Tyskland) eller konfokal laser-scanning mikroskopi.
kvantitativ revers transkripsjon (RT) -PCR
Total RNA fra Jakten celler ble fremstilt ved bruk av TRI middel (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio, USA) i henhold til produsentens instruksjoner og deretter revers transkribert for å generere komplementære DNA. Kvantitativ RT-PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn PCR-blanding (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) og et detektorsystem i sanntid (Applied Biosystems, Foster City, CA USA). GAPDH nivået ble brukt til å normalisere transkripsjonsnivåer.
Resultater
Luteolin er en potent hemmer av VRK1 kinase aktivitet
For å undersøke om luteolin kan effektivt undertrykke den enzymatiske aktiviteten til VRK1, vi utførte en
in vitro
kinase-analyse og sammenlignet de inhiberende virkninger av luteolin med de andre flavonoid-lignende forbindelser. Luteolin vesentlig hemmet VRK1-mediert fosforylering av BAF og histon H3 på en doseavhengig måte. Dessuten ble det auto-fosforylering aktivitet av VRK1 dempes ved behandling med luteolin på en doseavhengig måte (fig. 1A og B). Selv om eupatilin og wogonin, flavonoid-lignende kjemiske forbindelser som viser strukturelle likheter med luteolin (fig. 1C), svakt hemmer VRK1 kinase-aktivitet (Fig. 1D og E) viste luteolin de mest fremtredende inhibitoriske effekter på BAF-fosforylering og VRK1 auto-fosforylering , noe som tyder på det spesielle ved luteolin. Spesifisiteten til luteolin for VRK1 ble ytterligere bekreftet ved dens normaliserte inhibitoriske effekter på BAF-fosforylering og VRK1 auto-fosforylering (fig. 1F og G). Disse resultatene indikerer at luteolin er en potent hemmer av VRK1 kinase aktivitet, som er nødvendig for modulering av cellesyklusprogresjon.
(A) og (B),
in vitro
kinase aktivitetsmålinger for VRK1 med BAF (A) eller VRK1 med histon H3 (B) ble utført ved å øke konsentrasjoner av luteolin (0,0, 1,0, 10, 50, 100 og 250 uM), og deretter VRK1 og substrat-proteiner ble farget med sølvnitrat. (C), kjemiske strukturer og molekylvekter på luteolin, eupatilin, og wogonin. (D) og (E),
in vitro kinaseanalyse
for VRK1 med BAF ble utført ved økende konsentrasjoner (0,0, 1,0, 10, 50, 100 og 250 uM) av eupatilin (D) eller (wogonin E), og deretter VRK1 og BAF proteiner ble farget med sølvnitrat. (F) og (G), Kvantifisering av VRK1 auto-fosforylering (F) eller BAF fosforylering (G) som er beskrevet i (B), (D) og (E). Data på (F) og (G) representere hjelp av tre uavhengige eksperimenter ± SEM.
Luteolin samhandler direkte med VRK1
Fordi luteolin trykt handlingen av VRK1 mot sine underlag, vi hypotese at luteolin kan hemme kinase aktivitet gjennom direkte binding til VRK1. For å undersøke samspillet mellom luteolin og VRK1, gjennomførte vi en pull-down analysen bruker luteolin-konjugert sepharosekuler. GST kunne ikke binde seg til enten luteolin-konjugert sepharosekuler eller kontroll perler. Men GST-VRK1 hell bundet til luteolin-konjugert sepharosekuler, men ikke binde seg til å kontrollere perler som ikke ble konjugert til luteolin (Fig. 2A). Vi neste utførte en pull-down analysen med SH-SY5Y cellelysater å inspisere om luteolin binder seg til endogent VRK1 i tillegg til rekombinant VRK1 (Fig. 2B). Endogen VRK1 kan også binde seg til luteolin-konjugert Sepharose-kuler. Disse resultatene tyder på at luteolin samhandler direkte med VRK1
in vitro
.
(A), Pull-down-analyse ved hjelp luteolin-konjugert sepharose 4B kuler eller kontroll sepharose 4B kuler med rekombinant VRK1 protein. Renset GST og GST-VRK1 proteiner inkuberes med angitte perler, og deretter dra ned analysen ble utført. Hver proteiner ble påvist ved immunblotting med GST antistoff. (B), Pull-down-analyse ved hjelp luteolin konjugert sepharose 4B kuler med SH-SY5Y cellelysat. Cellelysat inkuberes med angitte perler, og deretter rullegardin ble utført. Proteinene ble påvist ved immunblotting med VRK1 antistoff. (C), SPR deteksjon for samspillet av luteolin med VRK1. Dataene ble oppnådd ved kinetisk titreringsmetode med sekvensmessig injeksjon av analytter uten regenerering trinn. Data for eupatilin og wogonin ble oppnådd ved klassiske metoder.
direkte interaksjon mellom luteolin og VRK1 ble ytterligere analysert ved hjelp av overflate-plasmonresonans (SPR) for å overvåke bindingskinetikken. Rekombinant VRK1 proteiner ble kovalent immobilisert på en sensorbrikke som en ligand; Deretter ble luteolin, eupatilin og wogonin tilsatt i en konsentrasjonsavhengig måte som en analytt (Fig. 2C). Kinetiske parametere for interaksjonen mellom VRK1-belagte sensorbrikken og disse analyttene ble evaluert ved hjelp av programvare og er representert i tabell 1. Beregnede konstanter av disse analyttene mot VRK1 utstilling som luteolin har mest sterk bindingsaffinitet mellom dem. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at luteolin bindes direkte til VRK1 med høy bindende affinitet.
Den hemmende effekten av luteolin er mediert av sin direkte binding til den katalytiske domenet av VRK1
Å bestemme bindende regionen VRK1 for luteolin, var samspillet mellom luteolin og VRK1 vurdert av NMR titrering eksperimenter og
i silico
modellering. Aminosyrerester påvirket ved interaksjon med luteolin viste dramatisk økt kjemisk skift perturbasjoner (fig. 3A). Disse rester er representert i spekteret for kjemisk skift forstyrrelser og også er tildelt på den molekylære kart over VRK1 (figur 3B), hvilket antyder at disse rester er i hovedsak lokalisert i nærheten av katalytisk domene, som er involvert i ATP-bindings [34].
(A), NMR titrering eksperimenter ble utført. Spektrum av kjemiske shift perturbasjoner versus aminosyrerester i VRK1 protein etter binding av luteolin. (B), Kartlegging av kjemiske shift forstyrrelser på VRK1 protein. De fleste av de forstyrrede rester (vist i rødt), som ligger nær det katalytiske domenet av VRK1. (C),
in silico
modellering av bindingen måte luteolin til VRK1 proteinet. Luteolin er spådd til å passe i nærheten av G-loop, katalytiske setet, og α-C lapp.
I
i silico
modellering av bindingen modusen for luteolin mot VRK1 , luteolin er spådd å passe i nærheten av G-loop, katalytiske sete, og α-C lapp (fig. 3C). De 2, 3-dihydroksyldiarylenforbindelse -deler av den 2-fenyl-gruppen i kromen stillaset interagere med E83 rest av α-C-lobe. Videre er 2-hydroksyl-gruppe interagerer med det D197 resten av den katalytiske sløyfen. Tilsvarende 4-keto gruppen på kromen stillaset samhandler med S181 via en hydrogen-binding interaksjon. Den 7-hydroksylandelen på kromen stillaset gjør også hydrogen-binding interaksjoner med i43 og Q45 rester fra G-loop. Bortsett fra disse hydrogenbindingsvekselvirkninger, har kromen stillaset også sterke stablings hydrofobe interaksjoner med F48 rest av G-løkke og de hydrofobe rester som omgir det aktive sete (ikke vist). Luteolin har de fleste av sine viktige interaksjoner med G-løkke og katalytiske språk rester som fast stabiliserer luteolin molekyl inn i det aktive nettstedet og hemmer dens kinase aktivitet.
Luteolin induserer cellesyklus arrest via hemming av BAF fosforylering av VRK1
Luteolin har vist seg tidligere å indusere cellesyklus arrest i G1 /S og G2 /M faseoverganger [35] – [39]. Imidlertid er den molekylære mekanisme av cellesyklus-stans ved luteolin ukjent, bortsett fra muligheten for at Aurora B kinase kan være et molekylært mål for luteolin for å regulere cellesyklusprogresjon, på grunnlag av bevis for at Aurora B inhiberes av luteolin og spiller en rolle som en viktig formidler av mitotisk progresjon [40]. VRK1 er en annen mitotisk kinase som har vært kjent å utføre samordne roller i cellesyklusutvikling ved fosforylering av flere cellesyklusrelaterte substrater som BAF, histon H3, og CREB [10] – [12]. Derfor vurderte vi om luteolin induserer cellesyklus arrest ved å hemme VRK1. PI-fargede celler behandlet med DMSO eller luteolin ble analysert ved strømningscytometri for å vurdere cellesyklusen. Ved behandling med luteolin, ble befolkningen i G1 fasen betydelig økt sammenlignet med den i DMSO-behandlede celler (fig. 4A, venstre panel). I motsetning til dette forsvant den økte G1-fase populasjon ved overekspresjon av GFP-merket VRK1 (figur 4A, til høyre panel), som indikerer at luteolin forårsaker arrest i den tidlige fasen av cellesyklus ved inhibering av VRK1.
( A), ble cellesyklusanalyse utført ved strømningscytometri. HeLa-celler transfektert med GFP eller GFP-VRK1 ble behandlet med luteolin i 24 timer, og 10.000 celler ble gated for analyse. Kvantitative data er under histogrammet plott. (B) og (C), for å HeLa-celler behandlet med bærer eller luteolin ble farget med lamin B antistoff visualisere atom konvolutt og med Hoechst 33342 til visualisert DNA. Alexa 488 fargestoff-konjugert antistoff ble anvendt som sekundært antistoff. Platene ble visualisert ved fluorescens mikroskopi (B), eller konfokal laser-skanning mikroskopi (C). (D), fluoriserende farging av VRK1, BAF, og DNA for analyse av fosforyleringen-mediert re-lokalisering av BAF. Celler ko-transfektert med GFP eller GFP-BAF med RFP eller RFP-VRK1 ble behandlet med DMSO eller 10 uM luteolin i 24 timer.
Som nevnt ovenfor, VRK1 deltar i fosforyleringen-mediert re- lokalisering av BAF til cytoplasma, kromatin kondensasjon via histon H3 fosforylering, og CCND1 ekspresjon ved CREB fosforylering for å lette cellesyklusprogresjon [10] – [12]. For ytterligere å forklare mekanismen av cellesyklus arrest av luteolin-indusert forstyrrelse med VRK1 aktivitet, evaluert vi enten luteolin forstyrrer disse prosessene. Fordi det har blitt vist at VRK1 forbedrer ekspresjonen av CCND1, som er korrelert med G1 /S progresjon gjennom økt aktivitet av CRE element i CCND1 promoteren av fosforylert CREB-binding, vi spekulert i at CREB fosforylering og mRNA-nivået av CCND1 mai bli påvirket av luteolin behandling. Men det var ingen signifikante forskjeller i CREB fosforylering og mRNA nivået av CCND1 mellom DMSO og luteolin behandling (fig. S1), noe som tyder på at luteolin-indusert G1 /S arrestasjonen kan ha vært en konsekvens av feil i andre prosesser snarere enn undertrykkelse av CREB fosforylering.
Vi neste testet mulig involvering av BAF i G1 /S arrest forårsaket av luteolin. I
Drosophila Hotell og
C. elegans
, er det vel etablert at BAF har grunnleggende roller i organiseringen av atomstruktur og cellecyklusprogresjonen [13], [41]. I tillegg er den nukleære lokalisering av BAF påvirker cellesyklusprogresjon i humane celler; VRK1, den eneste identifiserte oppstrøms kinase av BAF, kan endre BAF lokalisering av fosforylering å indusere frigjøring av BAF fra både DNA og LEM-domene proteiner som Lap2, emerin, og MAN1 [12], [14], [31], [42]. VRK1-mediert BAF re-lokalisering er viktig prosess for DNA utgivelse i løpet av G1 /S overgang. For å oppdage eventuelle forstyrrelser forårsaket av luteolin i atomkonvolutt dynamikk i cellesyklusprogresjon, farget vi atom konvolutten med kjernefysisk Lamin B antistoff. Lamin B er løsrevet fra kromatin i mitose, men tap av VRK1 eller ekspresjon av mutant BAF perturbs kromatin atskillelse fra NE [12], [42], [43]. Vi observerte om kjernefysisk Lamin B ikke ble spredd ved behandling med luteolin. Nuclear lamin B ble frigjort i cytoplasma på sen anaphase som vist i kjøretøy-behandlede celler, mens lamin B er fastlåst i kromosomer ved samme fase som vist i luteolin-behandlede celler (Fig. 4B), noe som tyder på at luteolin-indusert VRK1 hemming forstyrrer VRK1-mediert fosforylering BAF.
i tillegg har vi videre funnet at luteolin skyldes abnorm atom konvolutt morfologi såsom invagination og bleb (fig. 4C), som er et fenomen til å bli indusert ved uttømming av VRK1 [44] . Derfor foreslår vi at luteolin-mediert demping av BAF fosforylering kan gi opphav til VRK1 utarming-indusert unormal kjernefysiske morfologi. For å bekrefte at luteolin forstyrrer VRK1-mediert BAF fosforylering, observerte vi fosfor-BAF nivå ved immunoblotting. Fosfor-BAF nivået ble redusert i 10 mm luteolin behandlet cellelysat (fig. S2), noe som indikerer at VRK1 katalytisk aktivitet reduseres med luteolin
in vivo
.
En tidligere studie viste at ektopisk ekspresjon av VRK1 resulterer i BAF re-lokalisering til cytoplasma [12], [31]. Dermed vi videre undersøkt om fenomenet BAF re-lokalisering er påvirket av luteolin-mediert hemming av VRK1. Når både RFP-VRK1 og GFP-BAF ble innført sammen, BAF syntes å være dispergert gjennom hele cellen, som har blitt rapportert tidligere [31]. Imidlertid bekreftet vi at dette fenomenet ble avbrutt ved behandling med luteolin (fig. 4D). Lokalisering av GFP-BAF ble begrenset til nukleoplasma på tross av VRK1 overekspresjon, noe som tyder på at luteolin behandling effektivt redusert BAF fosforylering ved å hemme VRK1, etterfulgt av cellesyklus arrest. For å undersøke hvilken rolle BAF under cellesyklusen, analyserte vi DNA-innholdet etter luteolin behandling. Ektopisk uttrykt BAF ikke påvirker cellesyklusprogresjon (Fig. S3A). Ved luteolin administrasjon, svangerskap utenfor uttrykt BAF kunne ikke redde luteolin-indusert G1 opphopning (Fig. S3b), noe som tyder på at luteolin-indusert G1 arrest er ikke resultert av BAF hemming, men det ved å hemme VRK1-mediert BAF fosforylering.
luteolin induserer redusert cellelevedyktighet og påfølgende apoptose
Når den hemmende effekten av luteolin mediert ved binding til det katalytiske domenet av VRK1 ble bekreftet, evaluerte vi sin anti-tumor-effekt på tumorcellevekst og overlevelse. Effekten av luteolin på cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av MTT-analysen ved forskjellige konsentrasjoner. Vi har observert at luteolin behandling betydelig redusert veksten av tumorigen cellelinjer HeLa og U2OS sammenlignet med de ikke-tumorigene cellelinjer BEAS-2B og HEK293A (Fig. 5A). IC
50 Verdiene i HeLa og U2OS celler ble bestemt som 15,41 uM og 36,35 uM, henholdsvis, mens de i BEAS-2B og HEK293A cellene ble økt flere ganger i forhold til tumorigene celler (74.41 uM og 263,3 uM, henholdsvis) . Dette resultatet viser at den inhiberende effekt av luteolin på celleproliferasjon er mer uttalt i tumorigene celler enn ikke-tumorigene celler, selv om VRK1 proteinnivå i cellelinjer som ikke er korrelert med tumorgenisitet (fig. S4). Videre hemmer luteolin cellelevedyktigheten av HeLa-celler i en tidsavhengig måte (fig. 5B).
(A), Virkningene av luteolin på cellelevedyktighet på karsinogent (HeLa og U2OS) og ikke-tumorigene (BEAS-2B og HEK293A) cellelinjer.
