Abstract
Overuttrykte peroxiredoxin 1 (Prx1) er observert i en rekke kreftformer, inkludert muntlig plateepitelkarsinom (OSCC). Den nøyaktige molekylære mekanismen for oppregulering av Prx1 i karsinogenese, men er fremdeles dårlig forstått. Målet med denne studien er å undersøke forholdet mellom Prx1 og hypoksi, og mulig mekanisme (r) av Prx1 i OSCC cellelinje SCC15 og xenograft modell. Vi behandlet villtype og Prx1 knockdown SCC15 celler med forbigående hypoksi fulgt av Reoksygeneringen. Vi oppdaget tilstanden av hypoksi, produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), og ekspresjon og /eller aktivitet av Prx1, hem oksygenase-1 (HO-1) og nukleær faktor kappa B-(NF-kB). Vi fant at hypoksi induserer ROS akkumulering, opp-regulerer Prx1 øker NF-kB trans og DNA-bindende aktivitet, og nedregulerer HO-en
in vitro
. I Prx1 knockdown-celler, ble ekspresjonsnivået av HO-1 økes, mens NFkB translokasjon og DNA-bindende aktivitet ble redusert etter hypoksi eller hypoksi /reoksygenering behandling. Dessuten, etterlignet vi den dynamiske oksygene svulsten mikromiljø i xenograft modell og vurderes de ovennevnte indekser i svulster med maksimal diameter på 2 mm, 5 mm, 10 mm eller 15 mm, respektivt. Våre data viser at tumor hypoksisk tilstand og ekspresjon av Prx1 er signifikant assosiert med tumorvekst. Ekspresjonen av HO-1 og NF-kB, og NF-kB-DNA-bindende aktivitet ble signifikant forhøyet i tumorer 15 mm, og nivået av 8-hydroxydeoxyguanosine ble øket i tumorer 10 mm og 15 mm, sammenlignet med de i størrelse fra 2 mm. Resultatene fra denne studien gi eksperimentelle bevis for at overekspresjon av Prx1 er assosiert med hypoksi, og Prx1 /NF-kB /HO-1 signalveien kan være involvert i oral karsinogenese
Citation. Zhang M, Hou M, Ge L, Miao C, Zhang J, Jing X, et al. (2014) Induksjon av Peroxiredoxin en av Hypoksi Regulerer Heme oxygenase-en via NF-kB i Oral Cancer. PLoS ONE 9 (8): e105994. doi: 10,1371 /journal.pone.0105994
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: Mai 20, 2014; Godkjent: 25 juli 2014; Publisert: 27 august 2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation (81070836), Beijing Natural Science Foundation (7102065) og ZYLX201407, Beijing Municipal Administrasjon av sykehus Key Medical Development Project. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) er den vanligste hode og nakke kreft på verdensbasis. Til tross for fordelene med kirurgi, cellegift og strålebehandling, har fem års overlevelse av OSCC ikke bedret seg markert de siste 30 årene [1] – [3]. Metastase og kjemoterapi /strålebehandling motstand er fortsatt største bekymringene i klinisk kreftbehandling. Hypoksi, en felles trekk ved kreft, fremmer tumorcelle-invasjon og metastase i tumormikromiljøet som fører til motstanden av tumorceller til kjemoterapi og strålebehandling [4], [5]. Det har blitt rapportert at de patologiske funksjoner, inkludert aktiv invasivitet, lymfeknutemetastase og vaskulær proliferasjon er forbundet med tumorvev hypoksi i OSCC [6], [7]. Eksponering for hypobar hypoksi fører til en betydelig økning i produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) i dyr. Oppbyggingen av ROS indusert ved hypoksi kan resultere i oksidativt stress og tumorprogresjon [8]. ROS-mediert reaksjon kan reguleres ved antioksidanter og antioksidant enzymsystemer, slik som superoksid dismutase, katalase og thioredoxin /peroxiredoxin [9].
Peroxiredoxins (Prxs) er en superfamilie av multifunksjonelle antioksidant thioredoxin avhengig peroxidases. Peroxiredoxin 1 (Prx1) er et viktig medlem i familien Prxs og virker som en antioksidant for å absorbere ROS i et bredt spekter av organismer. Prx1 er involvert i flere biologiske forhold /aktiviteter inkludert oksidativt stress, celleproliferasjon og celle apoptose [9]. Prx1 er overuttrykt i mange maligniteter inkludert spiserør, lunge, bryst og bukspyttkjertel kreft. Forhøyet Prx1 uttrykket er assosiert med redusert total overlevelse og dårlige kliniske resultatet [10], [11]. Overekspresjon av Prx1 har også blitt rapportert i OSCC, men den nøyaktige molekylære mekanismen for Prx1 i oral karsinogenese fortsatt uklar [12]. Uttrykket av nukleær faktor-kappa B (NF-kB) og Heme oxygenease-1 (HO-1) er økt i OSCC [13], [14]. Tallrike studier har vist at NF-kB reaksjoner på hypoksi-Reoksygeneringen
in vitro product: [15]. NF-kB kan reguleres ved Prx1, gjennom sitt aktiverings i cytoplasma [16], eller ved å endre konsentrasjonen av oksydasjonsmiddel som fører til oksidativ inaktivering av NF-kB [17]. HO-1, et 32-kDa heat shock protein, kan katalysere oksydativ nedbrytning av heme til biliverdin, som deretter blir redusert til bilirubin. HO-1 kan bli indusert ved hypoksi, varmesjokk og cytotoksiske oksydanter [18], [19]. HO-1 er ett av målene for NF-kB under stressbetingelser [20] – [23]. Selv om mekanismen for Prx1 i oksidant stress er ikke klart, flere bevis tyder på at Prx1 kan respons på hypoksi og regulere NF-kB veien kaskade. I denne studien undersøkte vi endring av Prx1 respons på hypoksi og evaluert mulige sammenhenger mellom Prx1 og NF-kB /HO-en ved hjelp av munnhulekreft cellesystem og xenograft modell.
Materialer og metoder
Cellekultur kultur~~POS=TRUNC
Humant OSCC celler, SCC15, (ATCC, Manassas, VA) ble opprettholdt i DMEM-F12 supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, USA) inneholdende 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. SCC15 celler ble dyrket ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft. Å slå ned Prx1 ble SCC15 celler transfektert med Prx1 shRNA Plasmid (i Santa Cruza Biotechnology) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kontroll shRNA Plasmid-A (i Santa Cruza Biotechnology) ble transfektert som kontroll. Effektiviteten av Prx1 shRNA knockdown ble bestemt ved QRT-PCR og Western blot analyser.
Pimonidazole flekker i SCC15 celler
Celler ble dyrket på dekkglass i 24 timer før hypoksi behandling. Under hypoksi behandling ble cellene satt på en hypoksi inkubator med gassinneholdende 1% O
2, 5% CO
2 og 94% N
2 ved 37 ° C i forskjellige tidsperioder. 200 uM av pimonidazole ble tilsatt til mediet og inkubert i 30 min. Etter å ha vasket med PBS, ble cellene fiksert med paraformaldehyd (3%) ved værelsestemperatur i 10 minutter og deretter vasket en gang med PBS. Etter blokkert med BSA, ble dekk inkubert med hypoxyprobe-1 mus monoklonalt antistoff MAB1 (1:100) i Hypoxyprobe-en Plus kit (Chemicon Int., Temecula, CA) over natten. En sekundær FITC-konjugert anti-mus antistoff ble anvendt. Dekk ble montert og immunostained celler ble undersøkt på en Olympus IX71 mikroskop (Tokyo, Japan).
ROS deteksjon
Produksjon av intracellulær ROS i cellene ble målt med 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) ved hjelp av FACS analyse. De SCC15 Cellene ble oppsamlet og suspendert i 500 ul fortynnet DCF-DA. Blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 20 minutter og deretter vasket to ganger med PBS. Prøvene ble analysert ved flow-cytometer innen 1 time. Data ble normalisert til verdier fra kontrollene. Den midlere DCF fluorescensintensitet ble målt med eksitasjon ved 488 nm og emisjon ved 525 nm. Forsøkene ble utført in triplo.
Immunofluorescence
Celler dyrket på dekkglass ble skylt med PBS, fiksert og permeabilisert i aceton ved -20 ° C i 10 min. Etter inkubering med PBS som inneholdt 5% BSA i 1 time, ble monoklonale anti-NF-kB-antistoff (Cell Signaling Technology, 1:100 i PBS-BSA) tilsatt ved 4 ° C og inkubert over natten. Objektglassene ble vasket med PBS, inkubert med Alexa 546 Fluor-anti-kanin (Molecular Probes, 1:500) sekundært antistoff ved romtemperatur i 1 time, og montert i Dako Cytomation fluorescerende monteringsmedium. Confocal bilder ble samlet ved hjelp av en Leica SP2 laser scanning confocal mikroskop utstyrt med UV eksitasjon, en argon laser, en 633 /1.32 OIL PH3 CS objektiv, og en confocal pinhole sett på en Airy enhet. Alle confocal bilder var enkelt optiske seksjoner.
Xenotransplantat modell
Forty BALB /c naken mus (Beijing Vital River Laboratories, Kina) ble brukt til å produsere tumorigenicity av SCC15 celler
in vivo
. Forsøket protokollen ble godkjent av den lokale etiske komiteen for bruk av dyr. De SCC15-celler (6 x 10
6) ble suspendert i 100 ul av fosfatbufret saltvann og ble transplantert subkutant i høyre og venstre flanker av 4 uker gamle nakne mus. Den tumorvekst ble overvåket hver 3 dager etter transplantasjon. Tumorene ble høstet når den maksimale diameter av tumorer nådde 2 mm, 5 mm, 10 mm eller 15 mm, respektivt. Å merke hypoksiske celler, ble nakne mus injisert intraperitonealt med 0,1 ml saltoppløsning innehold pimonidazole-hydroklorid (1 – [(2-hydroksyl-3-piperidinyl) propyl) -2-nitroimidazol-hydroklorid) i en dose på 60 mg /kg kroppsvekt 1 time før svulst fjerning. Mus ble gjennomført eutanasi, og vevsprøver ble fjernet og umiddelbart lagret i flytende nitrogen for molekylær /cellulær analyse, eller i formalin for å gjøre parafininnstøpte vevsblokker. Totalt 80 svulster ble delt inn i fire grupper etter svulsten diameter (20 svulster /størrelse).
Pimonidazole flekker i tumorer
parafininnstøpte blokker med tumorprøver ble seksjonert for pimonidazole farging. Snittene ble inkubert med primært kanin-antiserum pimonidazole hypoxyprobe-1 MAB1 (fortynning: 01:50; Chemicon, USA) ved 4 ° C over natten. For å vurdere tilstanden til hypoksi, ble fem representative lette mikroskopiske områder beregnet på hver av delene (forstørrelse x 200) og den midlere optiske tetthet (MOD) ble beregnet ved bruk av Image Pro Plus 7.0 analysator, MOD = IOD /område.
QRT-PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler og tumorvev bruker TRIzol (Invitrogen Life Technologies, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert ved revers transkripsjon av to mikrogram RNA med høy kapasitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA). En mikroliter prøver av cDNA ble anvendt som templater. De FAMTM Dye /MGB prober av Prx1, ble HO-1 og ß-aktin syntetisert av ABI (Analyse ID: Prx1, HS0060202, HO-1, HS00015796, menneskelig ACTB, 4352935E). For dataanalyse ble to
-ΔΔCT metoden som brukes sammen med normalisering av dataene for interesserte gener til husholdningsgenet ß-aktin. Forsøkene ble utført in triplo.
Western blot-analyse
Celler og tumorvev ble lysert i immunpresipitering analysebuffer (50 mM Tris-Cl [pH 7,4], 1% NP40, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA, 1 M fenylmetylsulfonyl-fluorid, 10 ug hver av aprotinin og leupeptin, og 1 mM Na3VO4). Etter sentrifugert ved 12 000 g i 30 minutter, ble supernatanten samlet og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Lowry-metoden. Like mengder protein ble separert på 12% SDS-PAGE-geler og blottet på nitrocellulosemembraner. Blottene ble inkubert med anti-Prx1 (1:5000, Upstate, USA) og anti-HO-1 (1:2000, Abcam, USA) antistoff. Antistoff ifølge β-aktin (Sigma, St. Louis, MO) ble anvendt som en kontroll lasting. Immunoreaktive bånd ble påvist med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer og forsterket ved hjelp av kjemiluminescens reagenser (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
NF-kB DNA-bindende aktivitet deteksjon
Den kjernefysiske protein ble ekstrahert fra celler og tumorvev med Ne-PER Kjerne- og cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Thermo, USA) . I korte trekk ble celler og vev suspenderes i hypotonisk buffer og inkubert på is i 10 minutter fulgt av sentrifugert ved 12000 g og 4 ° C i 10 minutter for å felle ut kjerner. Etter å ha vasket i hypotonisk buffer, ble kjernene lysert i en lyseringsbuffer for å få kjerner ekstrakter. NF-kB DNA-bindende aktivitet ble oppdaget ved hjelp av NF-kB (p65) transkripsjonsfaktor Assay Kit (Cayman Chemical Company, USA).
Immunohistochemistry
parafininnstøpte blokker ble seksjonert for immunhistokjemi analyse. Snittene ble behandlet med 20 mg /l proteinase K (fortynning: 1:1000; Sigma-Aldrich, USA) ved 37 ° C i 30 minutter for antigen gjenfinning. Etter å blokkere endogen peroksidase-aktivitet med 0,3% hydrogenperoksidase i 15 minutter, ble delene behandlet med 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG; 1:8000, Abcam, USA) eller NF-kB (Cell Signaling Technology, 1:100) primære -antistoff ved 4 ° C over natten. Platene ble inkubert i biotinylerte sekundære IgG-antistoffer ved 37 ° C i 30 minutter, og deretter visualisert ved hjelp av DAB i 2-5 min. Mayers hematoxylin ble brukt til å counterstain de seksjoner, som så ble dehydratisert og montert. For negativ kontroll ble PBS brukt i stedet for primære antistoffer. De celler med positiv farging ble bestemt ved å telle hvor mange prosent av fargede celler ved bruk av Image Pro Plus 7.0 analysator. Minst 1.000 celler ble regnet for hver kreftprøve.
Statistisk analyse
uttrykk nivåer av Prx1, HO-1, NF-kB og 8-OHdG og data fra ROS produksjon, pimonidazole farging, immunfluorescens og NF-kB-DNA-bindende aktivitet ble analysert og sammenlignet ved hjelp av en-veis analyse av varians (ANOVA). All statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS programvare for Windows 17,0. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på
P
0,05. Alle
P
verdiene var tosidig.
Resultater
Prx1 knockdown øker hypoksi og intracellulær ROS produksjon
Vi brukte shRNA plasmid å slå ned Prx1 i SCC15 celler. Som vist i figur 1A og 1B, ble nivåene av Prx1 mRNA og protein ekspresjon reduseres til 40-50% av shRNA transfeksjon i SCC15 celler. Etter Prx1 knockdown, vi har oppdaget at hypoksisk tilstand i begge Prx1 knockdown celler og kontrollceller, som ble transfektert med tom vektor. Våre data viste at hypoksisk tilstand ble økt med hypoksi eller hypoksi /Reoksygeneringen bortsett fra 12-h hypoksi behandling i kontrollceller (figur 1C, øvre panel). I Prx1 knockdown celler, hypoksisk tilstand økt mer betydelig sammenlignet med kontrollceller (figur 1C, lavere pannel). Den høyeste hypoksi ble observert i Prx1 knockdown-celler etter 24 timer hypoksi /2 h reoksygenering behandling, og 2 h reoksygenering behandlingen minsket ikke hypoksi nivået forhøyet ved hypoksi behandling. Vi har også oppdaget at produksjonen av intracellulær ROS. I likhet med hypoksi tilstand, ble produksjonen av intracellulær ROS økes ved hypoksi behandling bortsett fra 12 timer hypoksi og i 12 timer hypoksi /2 h reoksygenering behandling (figur 1D). Oppbyggingen av intracellulær ROS er høyere i Prx1 knockdown celler sammenlignet med den i kontrollceller.
A, Prx1 protein ble betydelig redusert med shRNA transfeksjon. B, Prx1 mRNA ble betydelig redusert ved shRNA transfeksjon. C, Pimonidazole farging viste økt hypoksi status i cellene etter hypoksi /Reoksygeneringen behandling. D, intercellulære ROS nivå identifisert ved flowcytometri i celler etter hypoksi /reoksygenering behandling. *
P
0,05 vs. WT SCC15 celler;
#
P
. 0,05 vs. kontroll hypoksiske WT SCC15 celler
Prx1 regulerer negativt HO-1 etter hypoksisk forhold
For å bestemme enten Prx1 var relatert til HO-1 i SCC15 celler i henhold hypoksiske forhold, vi vurdert uttrykket nivåer av Prx1 og HO-1 etter hypoksisk behandling. Som vist i figur 2A (a, b), protein ekspresjon av Prx1 ble økt med hypoksiske behandling. Imidlertid protein ekspresjon av HO-1 ble redusert ved innledende stadier av hypoksi da Prx1 ekspresjon ble økt, og deretter økes mens Prx1 ekspresjon ble redusert i 12 timer hypoksi /2 h reoksygenering, 24 h hypoksi og 24 timer hypoksi /2 timer reoksygenering, som vist i figur 2A (c og d). I 4 timer hypoksi /2 h reoksygenering gruppe, ble nivået av Prx1 protein økes med 50%, mens HO-1-protein ble nedregulert med 30% sammenlignet med ubehandlede celler (figur 2A-B og D). Men i Prx1 knockdown-celler, HO-1 var signifikant oppregulert etter hypoksi eller hypoksi /reoxygenantin behandling med unntak av den 24 h-gruppen. Proteinet ekspresjon av HO-en ble øket med 30% (figur 2A-d) og mRNA-nivå ble økt med 1,4 ganger i Prx1 knockdown SCC15 celler behandlet med 4 h hypoksi /2 timer reoksygenering sammenlignet med ubehandlede celler (figur 2C) . MRNA-ekspresjon av Prx1 ble økt med 2,7 ganger, mens ekspresjonen av HO-1 mRNA ble nedregulert med 40% (figur 2B og 2C).
A (a), protein ekspresjon av prx-1 og HO-1 oppdaget av Western blot etter hypoksi /Reoksygeneringen behandling; A (b og d), Prx1 og HO-1-protein quantitation i forhold til p-aktin; A (c), korrelasjon av prx-1 og HO-1 etter hypoksi /reoksygenering behandling. B og C, mRNA ekspresjon av prx-1 og HO-1 detektert ved QRT-PCR etter hypoksi /reoksygenering behandling. *
P
0,05 vs. WT SCC15 celler;
#
P
. 0,05 vs. kontroll hypoksiske WT SCC15 celler
Prx1 knockdown hemmer NF-kB trans og DNA-bindende aktivitet
Vi oppdaget den endogene NF-kB uttrykk i celler etter hypoksi behandling. Vi observerte en økt kjerne uttrykk for NF-kB i SCC15 celler etter behandling, spesielt i 24 timer hypoksi gruppe (figur 3A, øvre panel). Videre, i Prx1 knockdown celler, ble NF-kB trans fra cytoplasma til kjernen redusert sammenlignet med kontrollceller (figur 3A, lavere panel). Vi oppdaget da NF-kB aktivitet i celler etter hypoksi behandling. Vi fant ut at NF-kB p65 DNA bindingsevnen ble betydelig redusert i Prx1 knockdown celler etter hypoksi behandling sammenlignet med kontrollceller (Figur 3B).
A, endogene kjerner uttrykk for NF-kB. B, NF-kB-DNA-bindende aktivitet påvist ved ELISA. *
P
0,05 vs. WT SCC15 celler;
#
P
0,05 vs. kontroll hypoksiske WT SCC15 celler
Hypoksi er forbundet med tumorvekst i xenograft modell
For å evaluere endring. av de hypoksiske betingelser i løpet av tumorutvikling, vurderte vi hypoksi i tumorer med maksimal diameter på 2 mm, 5 mm, 10 mm eller 15 mm. Som vist i figur 4A, ble små og spredte positive celler observert i tumorer 2 mm. På 5 mm, 10 mm og 15 mm tumorer ble de hypoksiske celler i hovedsak plassert ved sentrene av kreft reir. Hypoksi i 5 mm, 10 mm og 15 mm tumorer var betydelig høyere enn den i 2 tumorer mm (figur 4B). Vi har også oppdaget at nivået av 8-OHdG for å vurdere den oksidative DNA-skade i tumorceller. Ekspresjonen av 8-OHdG økt fra 2 mm til 15 mm tumorer (figur 4C). Det var signifikant høyere i tumorer 10 mm og 15 mm i forhold til 2 mm tumorer (figur 4D).
A, Hypoksi ble detektert i 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) og 15 mm (d) tumorer hos pimonidazole farging. B, øker Hypoksi MOD betydelig i 5 mm, 10 mm og mm svulster 15 sammenlignet med svulster 2 mm. C, 8-OHdG ble detektert ved immunohistokjemi på 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) og 15 mm (d) tumorer. D, Nivået av 8-OHdG var høyere i 10 mm og mm 15 tumorer sammenlignet med tumorer 2 mm. *
P
0,05; **
P
. 0,01
Overuttrykte Prx1 og HO-1 under tumorigenesis i xenograft modell
Som vist i figur 5A, mRNA uttrykk for Prx1 betydelig økt i 5 mm, 10 mm og 15 mm tumorer sammenlignet med tumorer 2 mm. Proteinet ekspresjon av Prx1 ble også forhøyet i 10 mm og mm tumorer (figur 5B) 15. Overekspresjon av HO-1 ble observert i tumorer 15 mm som vist i figur 5C og 5D.
A og C, mRNA-ekspresjon av Prx1 og HO-1 detektert ved QRT-PCR. B og D, Protein uttrykk for Prx1 og HO-1 oppdaget av western blot. *
P
0,05; **
P
0,01
NF-kB trans og DNA-bindende aktivitet er økt i xenograft modell
NF-kB trans og DNA-bindende aktivitet begge. ble forhøyet når svulst utviklet. Den immunhistokjemi analyse viste at ekspresjon av NF-kB ble økt signifikant i tumorer 15 mm sammenlignet med 2 mm tumorer (figur 6A og 6B). På samme måte, NF-kB-DNA-bindende aktivitet ble signifikant forhøyet i mm tumorer enn 2 mm tumorer (figur 6C) 15.
A, NF-kB-ekspresjon ble påvist ved immunhistokjemi i 2 mm (a), 5 mm ( b), 10 mm (c) og 15 mm (d) svulster. B, er prosentandelen av kjernefysiske NF-kB positive celler betydelig økt i 15 mm svulster sammenlignet med den i svulster 2 mm. C, NF-kB-DNA-bindende aktivitet var betydelig høyere i tumorer 15 mm sammenlignet med tumorer 2 mm. *
P
0,05; **
P
. 0,01
Diskusjoner
Det overordnede målet med denne studien er å undersøke hvilken rolle Prx1 i hypoksi i OSCC. Først brukte vi shRNA å slå ned Prx1 i SCC15 celler og deretter oppdaget Prx1, NF-kB og HO-1 i hypoksi. Vi har også undersøkt Prx1 med hypoksi under svulst utvikling i xenograft modell. Våre data viser at etter eksponering for hypoksi eller hypoksi /reoksygenering, intracellulær hypoksi og ROS-nivåer ble forverret. Vi fant også at HO-1 uttrykk var oppregulert i Prx1 knockdown celler, mens NF-kB trans og DNA-bindende aktivitet ble redusert. Samlet utgjør disse data tyder på at den forhøyede opphopning av ROS indusert av hypoksi kan opp-regulere Prx1, som kan aktiveres NF-kB og negativt regulerer HO-1 i hypoksi-indusert muntlige kreftceller. Vår
in vivo
data viste at overekspresjon av Prx1 er assosiert med hypoksi og tumorvekst. Disse resultatene tyder på at Prx1 /NF-kB /HO-1 signalveien kan spille en nøkkelrolle i kreftutvikling av hypoksi-indusert kreft i munnhulen.
En av de viktigste funksjonene i Prx1 er thioredoxin avhengig peroxydaseaktivitet stole utelukkende i cystein i den N-terminale region [24]. Det rensker ekstra ROS som en antioksidant. Hypoksi øker inter ROS-nivåer via mitokondrielle elektrontransportkjeden. Hypoksi er en av de viktigste faktorene som påvirker startfasen og progresjon gjennom økt oksidativ DNA skade [25]. I de senere årene, var den overekspresjon av Prx1 rapportert å spille en viktig rolle i mange ondartede sykdommer på grunn av sin avgjørende rolle i patogenesen av hypoksi. I lungekreftceller, kan hypoksi /Reoksygeneringen øke Prx1 uttrykk ved å aktivere kjernefysiske faktor erytropoide 2 relatert faktor 2 (Nrf2), en viktig transkripsjonsfaktor involvert i oxidant stresset [26]. Tapet av Prx1 uttrykk kan forbedre følsomheten til oksidanter og dermed oppnår en bedre ROS produksjon og oksidativ DNA-skade [27]. I foreliggende studie, mRNA og protein ekspresjon av Prx1 var oppregulert i SCC15 celler ved enten hypoksi (4 H, 12 h) alene eller etterfulgt av reoksygenering (2 timer). I en annen studie rapportert av Kim
et al.,
Prx1 var bare oppregulert ved hypoksi /Reoksygeneringen, men ikke ved hypoksi alene [27]. Vi fant at SCC15 cellene fremdeles er hypoksiske etter 2 timer reoksygenering behandling, noe som indikerer at Prx1 kan fortsatt bli indusert ved hypoksi, selv etter 2 timer reoksygenering behandling. Vår resultat antyder at hypoksi er nært knyttet til overekspresjon av Prx1 i OSCC. Den oppregulering av Prx1 øker cellenes evne til å fjerne ekstra ROS og beskytte kreftceller, noe som kan øke tumorprogresjon og redusere efficacies av kjemo- og radiotherapies.
En fersk studie viste at i Hela celler , cytoplasmatisk Prx1 endret cytoplasmisk NF-kB translokasjon inn i kjernen. Nuclear Prx1 regulerer NF-kB /DNA-binding gjennom eliminering av H
2o
2 [23]. Wang
et al.
Rapporterte at Prx1 samhandler med NF-kB på DNA-nivå, og antagelig modulerer dens transkripsjonen aktivitet i brystkreftceller [10]. Som et potent antioksidant, letter HO-1 tumorprogresjon i en vevsspesifikk måte. Studier har vist at NF-kB induserer ekspresjon av HO-1 i tumorvev, [28] – [31]. Videre har tallrike studier antydet en direkte sammenheng mellom NF-kB og HO-1, men funksjonen av NF-kB i regulering HO-1-ekspresjon i humane celler er kontroversiell [32] – [35]. I denne studien våre data viste at hypoksi induserer Prx1 og NF-kB, og Prx1 regulerer HO-en via aktivering av NF-kB.
Prx1 har nylig blitt identifisert som en endogen ligand for toll-like receptor (TLR ) ligander [36]. I normoksisk forhold, kan Prx1 øke ekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) via induksjon av hypoksi-induserbar faktor-1 alfa-promoter-aktivitet gjennom Prx1: TLR4 interaksjon. Denne prosessen er mediert av NF-kB. NF-kB samvirker med VEGF-promoteren, men er ikke nødvendig for Prx1, noe som tyder på at NF-kB kan regulere VEGF uten Prx1 induksjon [37]. Prx1 og HO-1 er begge karakterisert som oksidativt stress-induserbar og heme-relaterte proteiner. Prx1 har heme-bindende aktivitet. Den tiol-spesifikk antioksidantaktivitet av Prx1 kan inhiberes av heme. Ko-ekspresjon eller ko-induksjon av Prx1 og HO-1 er blitt observert i noen vev eller celler, noe som indikerer at Prx1 og HO-1-proteiner kan samtidig lokalisere og kommunisere å oppvise antioksidantaktivitet [15]. Studier har vist at ekspresjon av HO-en er hovedsakelig oppregulert ved Nrf2. Nrf2 er også en av de viktigste transkripsjonsfaktorer for Prx1 genekspresjon i hypoksiske kreftceller. For første gang, rapporterer vi at Prx1 og HO-1 kan ha en negativ regulatoriske forhold på en indirekte måte. De nøyaktige molekylære mekanismer, men må bekreftes og undersøkes i fremtidige studier.
I OSCC xenograft modell, fant vi tilsvarende resultater som betydelig heving av HO-en henger etter at av Prx1. Under hypoksiske tilstand og oksidativ DNA-skade, er Prx1 og HO-1 oppregulert og NF-kB-DNA-bindende aktivitet er forbedret. Våre data tyder på at Prx1 spiller antioksidative rolle ved å aktivere NF-kB og regulere HO-1 i hypoksi-relaterte OSCC progresjon. I konklusjonen, fant vi at hypoksi spiller en viktig rolle i OSCC gjennom regulering Prx1 /NF-kB /HO-1 signalveien. Vår studie gir en systemisk undersøkelse av Prx1 i cellesystemer og xenograft modell av OSCC, hver med spesifikke fordeler for biomarkør forskning. Videre studier på funksjonell rolle Prx1 i oral karsinogenese er garantert. Informasjon fra denne studien kan være nyttig i utviklingen chemopreventive /terapeutiske midler rettet mot Prx1.
