Abstract
Andrographis (Andro) undertrykker spredning og utløser apoptose i mange typer kreftceller. Taxifolin (Taxi) har blitt foreslått for å forebygge kreftutvikling lik andre kosttilskudd flavonoider. I denne studien ble det cytotoksiske og apoptotiske effektene av tillegg av Andro alene og Andro og Taxi sammen på menneskelige prostata carcinom DU145 cellene vurdert. Andro hemmet prostatakreft cellevekst av mitotisk arrest og aktivering av indre apoptotiske sti. Selv om effekten av taxi alene på DU145 celleformering var ikke signifikant, kombinert bruk av taxi med Andro forsterket anti-proliferativ effekt av økt mitotisk stopp og apoptose i betydelig grad ved å øke spaltning av poly (ADP-ribose) polymerase, og caspases- 7 og -9. Andro sammen med Taxi forbedret microtubule polymerisasjon
in vitro
, og de induserte dannelsen av vridde og langstrakte spindler i kreftcellene, og dermed fører til mitotisk arrest. I tillegg viste vi at uttømming av MAD2, en komponent i spindelenheten sjekkpunkt (SAC), mildnet den mitotiske blokade indusert av de to forbindelsene, tyder på at de utløser mitotisk arrest av SAC aktivering. Denne studien tyder på at anti-kreft aktivitet av Andro kan bli betydelig forbedret i kombinasjon med Taxi ved å forstyrre mikrotubulidynamikk og aktivering av SAC
Citation. Zhang ZR, Al Zaharna M, Wong MM-K, Chiu SK Cheung HY (2013) Taxifolin Forbedrer Andrographis-Induced Mitotisk og apoptose i human prostata kreft celler via spindelenheten Checkpoint aktivering. PLoS ONE 8 (1): e54577. doi: 10,1371 /journal.pone.0054577
Redaktør: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankrike
mottatt: 1 mai 2011; Godkjent: 13 desember 2012; Publisert: 28 januar 2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet beskrevet i denne artikkelen ble delvis støttet av to tilskudd fra City University of Hong Kong (prosjekt nr 7002714 og 7002872). Takket blir gitt til Department of Health, Hong Kong regjeringen SAR, for deres støtte gjennom HKCMMS prosjektet. Forfatterne erkjenner også student fra School of Graduate Studies, City University of Hong Kong til Miss Z. R. Zhang. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Andrographis (Andro) er en diterpenoid lakton isolert fra den funksjonelle urt
Andrographis paniculata
, som har blitt brukt som en folkemedisinen for å behandle øvre luftveisinfeksjoner, sår hals og mange andre smittsomme sykdommer. Denne forbindelsen har blitt foreslått å ha et stort potensial for kreftbehandling fordi det viser anti-kreft aktiviteter i både direkte og indirekte måter [1] – [5]. Andro kan direkte hemme tumorcellevekst gjennom induksjon av cellesyklus arrest, apoptose og differensiering, og det kan indirekte undertrykke kreftutvikling gjennom immunstimulerende, anti-inflammatorisk, anti-angiogene og chemoprotective egenskaper [4]. Andro kan endre p50-subenheten av NF-kB på en antagonistisk måte, og denne mekanismen kan være årsaken til sin flere aktiviteter [6]. Dens medikament aktivitet er avhengig av dets konsentrasjon, fordi det kan undertrykke apoptose i mange celletyper, ved visse konsentrasjoner [7], [8], [9], men det kan også indusere apoptose ved høye konsentrasjoner [10], [11], [ ,,,0],12]. Mange studier har vist at Andro induserer effektivt cellesyklusarrest i flere typer kreftceller ved G0 /G1 trinn [10], [13], [14] og i humane hepatoma HepG2 celler ved G2 /M fase [15]. Vår nylig studie viser at effekten av Andro er avhengig av celletype. For eksempel, arresterer det cellesyklusen ved G2 /M i flere hepatocellulær kreft-cellelinjer, men det fører til apoptose i HeLa-celler [16]. I henhold til tidligere studier, aktiverer Andro den ekstrinsiske reaksjonsvei død reseptoren og indusere apoptotisk celledød i forskjellige typer kreftceller. I de fleste celletyper, effektor caspaseaktivering krever også forsterkning av signalet via et mitokondriene avhengig apoptotiske reaksjonsvei [11], [17]. Pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer (Bud og Bax) antas å spille viktige roller som meglere i stafett av celledød signal stimulert av Andro [11], [12].
Rollen av kosttilskudd flavonoider i kreftforebygging har også vært mye diskutert. Overbevisende data fra laboratorieforsøk og kliniske studier indikerer at flavonoider spiller en viktig rolle i kreft forebygging og behandling [18] – [20]. Et betydelig antall undersøkelser har vist at flavonoider er i stand til å potensiere anti-tumor aktivitet av andre midler på flere typer av kreft [21] – [24]. Taxifolin (taxi), også kjent som dihydroquercetin, har en sterk antioksyderende effekt og besitter aktiviteter som ligner på quercetin, noe som forbedrer apoptose indusert av en rekke anti-cancer legemidler i begge celle og dyremodeller [25] – [28]. Imidlertid har kombinert bruk av Taxi med andre legemidler mot kreft ikke blitt rapportert.
Selv om Andro har blitt rapportert å utøve en anti-proliferativ effekt på mange typer kreftceller [29], detaljerte molekylære studier av dets effekt på androgen-ildfaste prostatakreftceller blir fortsatt mangler. Vi antok at multi-target behandling er en lovende metode for å gjøre bruk av anti-kreft-aktivitet av naturlig forekommende forbindelser. Denne studien ble gjennomført for å bestemme den enkelte og kombinerte effekten av Andro og Taxi på cellesyklus og apoptose i androgen-uavhengig prostatakreft DU145 cellene. De apoptotiske virkninger av Andro på cellene ble betydelig forbedret når de brukes i kombinasjon med Taxi ved å styrke den apoptotiske sti og indusere aktivering av spindelenheten sjekkpunkt (SAC).
Materialer og metoder
cellekultur og kjemikalier
menneske~~POS=TRUNC androgen-uavhengig prostata carcinoma celler DU145, udødeliggjorte menneskelige prostata celler PNT2, og normal human forhud fibroblaster Hs27 ble hentet fra American Type Culture Collection (MD, USA). Disse cellelinjene ble rutinemessig opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, CA, USA), 0,37% natriumbikarbonat, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet 5 % CO
2 luftinkubator. Renset Andro (97%) ble oppnådd fra Indofine Chemical Company (NJ, USA). Taxi som var 85% ren ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Corporation (MO, USA) og en 98% ren Taxi forberedelse ble kjøpt fra BioBioPha (Yunnan, P.R.C.). Begge preparatene hadde samme effekt på celle levedyktighet når det gis alene eller i kombinasjon med Andro. Begge kjemikalier ble først løst i DMSO (mindre enn 0,1%) og deretter fortynnet med komplett vekstmedium til den endelige ønskede konsentrasjon før behandling. Prøvene som ble behandlet med DMSO alene tjente som kjøretøykontroller. Alle andre reagenser ble oppnådd fra Sigma-Aldrich, med mindre annet er angitt.
MTT-celleproliferasjon /levedyktighet assay
celleproliferasjon og levedyktigheten ble bedømt ved 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl- ) -2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) (Invitrogen, CA, USA) assay. DU145-celler, PNT2, og Hs27 celler ble sådd ved 5000 og 1000 celler /brønn, respektivt, inn i en 96-brønns plate. Cellene ble inkubert i 24 timer, og deretter eksponert for forskjellige konsentrasjoner av Andro, drosje eller en blanding av de to for en på forhånd bestemt tidsperiode. Ved slutten av behandlingen, ble det medikamentholdige medium fjernet og 0,5 mg /ml MTT oppløst i det samme medium ble tilsatt til hver brønn. Platen ble videre inkubert i ytterligere 3 timer. Etter fjerning av supernatanten ved slutten av inkuberingen ble 100 ul DMSO tilsatt til hver brønn for å oppløse de formazankrystaller som hadde dannet. Absorbansen ved 570 nm ble målt med en multi-brønn-skanning spektrofotometer (modell 550, Bio-Rad, USA). Celleproliferasjon ble uttrykt som prosent av kontroll ved å sammenligne antall levende celler i behandlingsgruppen til nummeret i kjøretøygruppe.
Observasjon av mobilnettet og kjernemorfologi
Celler ble sådd på sterilisert Dekkglass med en tilnærmet 30% konfluens, etterfulgt av 24 timers inkubasjon og kjemisk behandling. Cellene ble vasket kort med PBS og farget med 5 ug /ml Hoechst 33342 (Invitrogen, CA, USA) i ikke-FBS DMEM i 20 minutter ved romtemperatur. Morfologiske forandringer i cellene ble undersøkt ved hjelp av fasekontrast og fluorescerende mikroskop (Mikron Instruments, NY, USA).
Cell syklus analyse ved hjelp av flowcytometri
Kontroll og behandlede celler ble høstet og fikset i 70 % iskald etanol over natten ved 4 ° C. Etter å ha fjernet etanol og vasking med PBS, ble de fikserte cellene på nytt oppslemmet i en DNA-fargeløsning inneholdende 50 ug /ml propidiumjodid (PI) og 100 ug /ml RNase A i PBS ved en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml. De ble deretter inkubert i ytterligere 30 minutter ved 37 ° C i dempet lys. Den farget Cellesuspensjonen ble analysert med et strømningscytometer (Becton Dickinson, CA, USA). DNA-innhold på 10.000 celler per prøve ble brukt for å analysere cellesyklus ved hjelp av DNA-histogrammer. DNA-innholdet i cellesyklus av de analyserte celler ble beregnet ved MODFIT 3.0 programvare (Verity Software House, ME, USA).
Kvantifisering av mitotisk indeks ved flowcytometri
kontroll og behandlede celler ble samlet opp og fiksert i 4% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter permeabilisert ved langsom tilsetning av iskald metanol til en sluttkonsentrasjon på 90% og inkubert på is i 30 min. Omtrent 1 x 10
6-celler ble resuspendert i 100 ul inkubasjonsbuffer (0,5% BSA i PBS) i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert med phosphohistone H3 (Ser10) antistoff (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) i 1 time og deretter med et FITC-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) i ytterligere 30 minutter i mørket ved romtemperatur. Immunostained celler ble resuspendert i 0,5 ml propidiumjodid (5 ug /ml) i PBS og holdt i mørke før analyse med et strømningscytometer i løpet av 24 timer. Signalet fra 10.000 celler ble målt til å generere et spredningsplott.
Kvantifisering av apoptotisk renten med flowcytometri
Apoptose ble vurdert ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (Sigma-Aldrich) med framgangsmåten fastsatt av produsenten. I korte trekk ble celler på kulturskåler oppsamlet og vasket, og omtrent 5 x 10
5-celler ble resuspendert i 500 ul av 1 x bindingsbuffer (10 mM HEPE /NaOH, pH 7,5, 0,14 M NaCl og 2,5 mM CaCl
2). Deretter, 5 ul av 50 ug /ml AnnexinV FITC-konjugat (i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) og 10 ul av 100 ug /ml PI-løsning (10 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,4, 150 mM NaCl) ble tilsatt til cellesuspensjonen. Etter 10 min inkubering i mørke ved romtemperatur ble det fluorescens-signalet fra cellene måles straks med et strømningscytometer.
immunfluorescens-mikroskopi
Celler ble sådd ut ved 60% konfluens på dekk sterilisert slips og utsatt for de kjemikalier av interesse etter 24 timers inkubering. Etter en forutbestemt tidsperiode for behandling med kjemikalier, ble cellene fiksert med 4% formaldehyd i PBS i 10 minutter ved romtemperatur, vasket med PBS og permeabilisert med 0,25% Triton X-100 i PBS i 10 min. De permeabiliserte cellene ble deretter vasket og inkubert med inkuberingsbuffer (3% BSA i PBS) i 30 minutter ved romtemperatur for å blokkere ikke-spesifikk binding av antistoff. β-tubulin-antistoff (Cell Signaling Technology) ble inkubert med cellene i en time ved romtemperatur, og deretter FITC-konjugert geite-anti-kanin-IgG (Santa Cruz) og DNA-farging fargestoff Hoechst ble tilsatt i 1 time i dempet lys. Ved slutten av reaksjonen, ble dekkglassene skylt med PBS før de ble montert på objektglass med fluorescens monteringsmedium (Dako, Danmark). De forseglede lysbilder ble deretter undersøkt med et Leica SP5 konfokal mikroskop (eksitasjon ved 488 nm for FITC og 365 nm for Hoechst).
Western blot analyse
Totalt cellelysat ble utarbeidet av lysere cellene i RIPA lysebuffer (150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoksykolat, 1% NP-40, og 50 mM Tris-Cl, pH 7,5) supplementert med proteasehemmere Cocktail sett III (Calbiochem, California, USA) og 1 mM PMSF ved en tetthet på 1-2 x 10
7 celler /ml buffer. Cellesuspensjonen ble omrørt i 30 min og deretter sentrifugert ved 14.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble oppsamlet som celleekstrakter. Deretter ble 50 ug proteiner fra cellelysatene separert ved 12% SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og elektrooverført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, CA, USA). Membranen ble blokkert med 3% BSA eller ikke-fettholdig melk i PBS med 0,05% Tween-20. Dette ble etterfulgt av inkubasjon natten over med en fortynnet oppløsning av primært antistoff mot α-tubulin, caspase-3, caspase-7, caspase-9, p-Cdc2 (Tyr15), cyklin A, cyklin B1, cyclin E2, Myt-1, p21, PARP (Cell Signaling), BCL-2 (Santa Cruz), BCL-xL (Invitrogen, CA, USA), eller Cdc2 (BD) ved 4 ° C. Dette ble etterfulgt av inkubasjon ved romtemperatur med HRP-konjugert antistoff (anti-mus IgG eller anti-kanin-IgG) i 1 time. Tre uavhengige eksperimenter ble utført. Blottene ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens (ECL) ved hjelp av Western blotting Luminol-reagens (Santa Cruz). Bilder utviklet ble tatt med en LAS-4000 gel dokumentasjonssystem (Fuji Film, Tokyo, Japan).
In vitro
tubulin turbiditet analysen
påvirkning av narkotika på microtubule polymerisasjon ble overvåket ved hjelp CytoDYNAMIX ™ Screen 01 kit (Cytoskjelett Inc., CO, USA). Kort sagt ble medikamentene ved forskjellige konsentrasjoner fremstilt i DMSO ved 10 x styrke i G-PEM-buffer, som inneholder 80 mM PIPES (pH 6,9), 2 mM MgCl
2, 0.5 mM EGTA, 1 mM GTP og 5% glycerol . DMSO fungerte som et kjøretøy kontroll. Deretter ble 10 ul 10 x G-PEM-buffer tilsatt til hver brønn i et forvarmet 96-brønnplate og inkubert i 2-5 min. Tubulin-protein (mer enn 97% renhet) ble blandet med G-PEM-buffer ved en konsentrasjon på omtrent 4 mg /ml og deretter 90 ul av tubulin oppløsning ble tilsatt til hver brønn inneholdende 10 mL av bufferløsningen. Etter risting, ble absorbansen ved 340 nm målt hvert minutt i 60 minutter ved 37 ° C.
RNAi uttømming av MAD2
DU145-celler ble sådd ut i 60 mm plater for å tilveiebringe en sammenflytning på 50 -70% i 24 timer. Cellene ble transfektert med enten en av de to Mad2L1 siRNA (Origene, MD, USA) eller kontroll siRNA i nærvær av siTran transfeksjon reagens (Origene) i Opti-MEM-medium (Invitrogen, CA, USA) i 24 timer. De transfekterte celler ble skylt en gang med PBS og inkubert med DMEM (Invitrogen, CA, USA) medium i 24 timer og ble videre inkubert i ytterligere 24 timer i medium inneholdende 20 uM Andro og 100 uM taxi. Cellene ble deretter vasket en gang med PBS, trypsinert, og fiksert med 70% etanol og lagret ved -20 ° C over natten. De mitotisk indeks Cellene ble deretter kvantifisert ved flowcytometri basert på signaler fra antistoff mot fosfor-histon H3 (på S10) og propidiumjodid.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Origin 7.5 programvare (Originlab Corporation, MA, USA) og Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Alle data ble analysert fra 3 eller 4 uavhengige eksperimenter. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. Forskjellene mellom prøvene ble analysert ved bruk av to-prøve Student t-test. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Andro er mye mer cytotoksisk enn Taxi i å hemme veksten av prostata kreft celler
Menneskelig prostata carcinom DU145 cellene ble eksponert for 0 og 50 uM Andro for 24, 48 og 72 timer, og celleproliferasjon ble vurdert ved anvendelse av MTT-analysen, til en vanlig metode for å måle metabolsk aktivitet av celler gjenspeiler den celletallet eller proliferasjon. Andro inhiberte proliferasjonen av DU145-celler i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte sammenlignet med ubehandlede prolifererende celler (figur 1A). Den beregnede IC
50 verdier av Andro på DU145-celler var 42,76 ± 3,29 (24 h), 13,70 ± 1,45 (48 h) og 8,36 ± 0,77 uM (72 h). IC
50 verdi etter 48 timer oppnådd i denne studien var bare litt høyere enn den verdi (12 pM) som tidligere rapportert ved Nanduri
et al.
[29]. Ved høyere konsentrasjoner enn IC
50 verdi, Andro induserte endringer i den cellulære morfologi av behandlede DU145 cellene, som dukket opp rundt og krympet og viste blebbing (figur S1). Disse cellene oppviste også kromatin kondensasjon og fragmenterte kjerner (figur S2).
Cellene ble behandlet med en rekke konsentrasjoner av (A) Andro og (B) taxi for den angitte tidsperiode og celleproliferasjon ble overvåket ved MTT-assay. Dataene fra tre uavhengige eksperimenter ble uttrykt som prosentandel av levedyktighet sammenlignet med bærerkontroll (DMSO). Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik
Vi evaluerte også cytotoksisitet av Taxi på DU145 cellene ved hjelp av MTT analysen. Resultatene viste at taxi er mye mindre cytotoksisk til DU145 celler enn Andro og at en konsentrasjon på 500 uM Drosje var nødvendig for å inhibere cellevekst med 52% etter 48 timers eksponering (figur 1B). Resultatet av denne studien er i samsvar med en tidligere rapport om cytotoksisitet av Taxi på pattedyrkreftceller [30].
Andro induserer mitotisk arrest og apoptose
Cell syklus analyse indikerte at behandling DU145 cellene med Andro ved konsentrasjoner mellom 0-40 uM førte til en akkumulering av celler i G2 /M, men en reduksjon i cellene ved G0 /G1 i en konsentrasjonsavhengig (figur 2A) og tidsavhengig måte (figur 2B). Vi har også bestemt om økningen i G2 /M-populasjonen var på grunn av en økning av mitotiske celler ved 24 timer etter Andro behandling. Vi overvåket mitotisk indeks (forholdet mellom mitotiske celler til resten av cellepopulasjonen) ved strømningscytometri ved bruk av immunfarging med fosfo-histon H3, en mitotisk markør, og vi har observert at Andro induserte en signifikant akkumulering av mitotiske celler i et dose avhengig måte (figur 2C). Det ble observert en 11-gangers økning i mitotiske celler etter behandling med 40 uM Andro i 24 timer sammenlignet med de bærerkontrollen (cellepopulasjonen i rektanglene merket med M på figur 2C og 2D). En sammenligning mellom den mitotiske indeksen og prosentandelen av G2 /M-celler i populasjonen foreslått at akkumulering av G2 /M-celler var hovedsakelig på grunn av mitotisk stopp (figur 2D). Dette settet av eksperimenter viste at etter 24 timers behandling med Andro, ble cellene først og fremst i mitotisk stopp
(A) Celler ble utsatt for 0-40 uM av Andro i 48 timer.; (B) celler ble eksponert for 40 uM av Andro i 0-72 timer. Cellulær DNA ble farget med propidiumjodid (PI) og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Prosentandelen av celler i hver spesifikk fase av cellesyklusen ble beregnet med den ModFit programmet, og uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3 eller 4). (C 0,01)
Vi har også undersøkt forholdene som forårsaket Andro å indusere apoptose.. Andro-behandlede celler ble farget med Annexin V-FITC og analysert ved strømningscytometri. Tidsforløpet studie av apoptotiske priser etter behandling med Andro viste at den høyeste tidlig apoptotiske sats (9,38%) forekom etter 48 timer; imidlertid, ved 72 timer, redusert tidlig apoptotiske hastighet, og den celledød hastigheten øket (figur 3C). Videre økende konsentrasjoner av Andro påvirket både tidlig og sen apoptose i en doseavhengig måte (figur 3A og 3B). Vi konkluderer med at behandling med Andro hemmet proliferasjonen av DU145-celler ved G2 /M fase, og at flere av disse cellene utviklet mot apoptose ved lengre behandling, med langvarig mitotisk stopp som fører til apoptose
(A og B). etter behandling i 48 timer med 0-80 uM av Andro ble cellene oppsamlet og dobbelt farget med Annexin V-FITC-antistoff og PI før analysert ved hjelp av strømningscytometri. (A) Ett sett med representative dot tomter viser prosentandelen av tidlige apoptotiske celler (Annexin V-FITC
+ /PI
-, lavere hånd panel til høyre) og andelen av sent apoptotiske og døde celler (Annexin V- FITC
+ /PI
+, panel øverst til høyre). (B) Handlingen i andelen av tidlig apoptotisk og sene apoptotiske og døde celler under forskjellige Andro konsentrasjoner uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (N = 4). (C) Cellene ble utsatt for 40 uM av Andro i 0-72 timer. Plottet av prosent tidlig apoptotiske og apoptotiske sene og døde celler mot tiden for behandlingen uttrykt som middel ± S.D. (N = 4).
Effekt av Andro på uttrykk for cellesyklus regulatorer, caspases og BCL-2 familie proteiner
For å utforske de molekylære mekanismene for mitotisk arrest indusert av Andro , uttrykket nivåer av flere viktige celle-syklus regulatorer ble analysert ved western blotting. Analyse av immunoblot viste at 24 timer etter behandling, en 5,7-ganger, 3,2 ganger, og 3-ganger økning i cyklin B1, P21, og fosforylerte (Tyr15) Cdc25c proteinnivåer, henholdsvis, ble observert (figurene 4A-D) , mens protein nivåer av cyklin A og cyklin E2 avtok med økende konsentrasjoner av Andro. Klare parallelle mobilitet skift på grunn av fosforylering av Cdc25c, Myt1 og p21 var til stede på 24 timer (Figur 4A). Spesielt, ekspresjonen av cyclin B1 var avhengig av konsentrasjonen av Andro. For eksempel uttrykket var høyest på 40 mikrometer, men redusert på 80 mikrometer. Tilsvarende fosforyleringen nivåene av Cdc25c og Myt1 var den mest intense etter behandling med 40 uM Andro.
(A) Cellene ble inkubert med 0-80 uM av Andro i 24 eller 48 timer. 40 ug av cellelysatet ble løst ved elektroforese i en 12% polyakrylamidgel, overført til nitrocellulosemembran, og immunoblottet mot de indikerte celle-syklus regulator antistoffer. Dataene er kvantifisering av de vestlige blotter av tre uavhengige forsøk. (B) Endringen i cyklin B1 nivå sammenlignet med kontrollen (0 uM) fra kvantifisering av Western blot ble plottet mot konsentrasjonen av Andro ved 24 og 48 timer. (C) Forandringen i nivået av fosforylert Cdc25c ble plottet mot konsentrasjonen av Andro. (D) Endringen i nivåene av p21 ble plottet mot konsentrasjonen av Andro. Standardavvik av tre uavhengige forsøk er vist.
Vi har også undersøkt uttrykket nivåer av proteiner knyttet til apoptose, caspases og BCL-2 familiemedlemmer ved immunoblotting med sine spesifikke antistoffer. Treringstrinnet og tidsavhengig spalting av PARP (poly (ADP-ribose) polymerase), kaspase 7, 9 og 3, ble observert (figur 5A). Den pro-apoptotiske protein Bax ble ikke påvist enten ved kontroll eller de behandlede celler; imidlertid pro-overlevelse medlem Bcl-2 ble svakt uttrykt. Ekspresjonen av Bcl-XL, et anti-apoptotisk protein, ble tydelig påvist, men en lavere migrerende form ble observert i behandlede celler 48 timer etter eksponering til 80 pM Andro (figur 5B). Disse dataene tyder på at apoptose var mest signifikant induserte etter 48 timers behandling med 80 uM Andro.
Cellene ble inkubert med 0-80 uM av Andro i 24 eller 48 timer, høstes og lyseres. 40 ug av cellelysatet ble separert på 12% polyakrylamidgel, overført til en nitrocellulosemembran, og immunoblottet med antistoffer mot (A) caspase-7, -9, og -3 og substratet PARP; og (b) Bcl-2 familien proteiner, inkludert BCL-XL, Bcl-2, og Bax. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter
Taxi forsterker veksthemmende virkning av Andro
Vi foreslo at Taxi kan påvirke den cytotoksiske effekten av Andro på kreftcellene.; Derfor vurderte vi combinatory effekten av Andro og Taxi på celleproliferasjon ved hjelp av MTT analysen. Som vist i figur 6A, når den utsettes for 100 uM Drosje uten Andro, den relative andelen av prolifererende celler var 93,33 ± 6,27% (gjennomsnitt ± SD, n = 4), som ikke var vesentlig lavere enn bilen kontroll (ubehandlede celler) . I motsetning til dette ble en signifikant reduksjon i andelen av prolifererende celler (% av kontroll av celletall = 65,6%) ble observert i nærvær av 10 uM Andro alene, men ytterligere tilsetning av 100 uM Drosje resulterte i et noe lavere prosentandel av prolifererende celler (54,78%). Men den veksthemmende virkning av 20 uM Andro i kombinasjon med 100 uM Drosje (% av kontroll = 20,92 ± 1,89%) var omtrentlig to ganger effekten av behandling med taxi alene (% av kontroll = 39,58 ± 1,79%, n = 4) , og forskjellen i celleproliferasjon oppstod når mengden av taxi ble øket i kombinasjon med høyere Andro konsentrasjoner. En lignende trend ble også observert når 200 mikrometer Taxi ble lagt sammen med høyere konsentrasjoner av Andro; imidlertid var det en 14,7% reduksjon i celletallet i nærvær av taxi alene (85,27%), som var betydelig lavere enn for celler behandlet med bærerkontrollen. Derfor, i alle etterfølgende undersøkelser, ble 100 pM Drosje anvendes i kombinasjon med forskjellige konsentrasjoner av Andro. Resultatene fra de morfologisk analyse av de behandlede celler ved hjelp av differensialinterferenskontrastmikroskopi korrelerer godt med data angående celleformering (figur 6B). Cellene ble behandlet med de to forbindelser som viste mer krymping, lavere celletetthet, et høyere antall flytelegemer og mer atomkondensering og fragmentering (ikke vist) enn cellene behandlet med Andro alene.
(A) cellene ble behandlet med 0-40 uM av Andro, 0, 100 eller 200 pM av taxi i 48 timer, og celleformering ble bestemt ved MTT-analyse. Data fra fire uavhengige eksperimenter ble uttrykt som prosentandel av levedyktighet sammenlignet med bærerkontroll (DMSO) med standardavvik (gjennomsnitt ± S.D., n = 4). * Indikerer signifikant forskjell fra kontrollgruppen (
p
0,01). (B) Cellene ble behandlet med 20 pM av Andro i 48 timer i nærvær eller fravær av 100 uM av taxi, og observert i henhold til differensialinterferenskontrastmikroskopi. Bar = 50 mikrometer. (C) En sammenligning av levedyktighet ved MTT-analyse av DU145, PNT2, og HS-27-celler etter behandling med 20 uM av Andro og 100 uM av taxi. Forsøkene ble utført in triplo, og standardavvikene er angitt.
Vi var interessert i å teste hvorvidt nevnte dobbeltport-behandling var spesifikk for kreftceller i forhold til udødelig, men ikke-kreftceller. MTT-assay ble anvendt for å sammenligne proliferasjon av DU145-celler med PNT2-celler, en human prostata cellelinje udødeliggjort med SV40 virus, og med HS-27-celler, en human foreskin fibroblast-cellelinje, ble behandlet med 20 uM Andro og 100 uM taxi . Under de samme betingelser, bare 30,3% av DU145-celler var levedyktige, mens 48,6% og 62,4% av PNT2 og HS-27-celler, henholdsvis, var levedyktig (figur 6C). Resultatet tyder på at DU145 cellene mer følsomme for de to stoffene enn de andre to udødeliggjorte humane cellelinjer.
Taxi og Andro-indusert mitotisk arrest førte til opphopning av cyclin B, Cdc25c, og p21
for å undersøke om den kombinerte hemmende effekt på veksten av DU145 skyldes cellesyklus arrest, celle syklus hendelser og mitotisk indeks ble vurdert i Andro-behandlede celler med eller uten Taxi. Når Andro ikke var til stede, prosentandelen av celler i G2 /M i begge grupper var ikke signifikant forskjellig. Imidlertid, når konsentrasjonen av Andro ble øket fra 10 uM til 40 uM, prosentandelen av celler i G2 /M i de kombinerte behandlingsgruppene var signifikant høyere enn prosentandelen av celler i Andro alene (figur 7A). Videre ble det observert betydelige forskjeller i kultur behandlet i 24 timer med 20 uM Andro i kombinasjon med 100 uM Drosje (figur 7B). Andelen av behandlede celler i M fase ble også målt med anti-fosfo-histon H3 (S10) antistoff. Den mitotiske indeksen av den kombinerte gruppen var omtrent dobbelt så høyt nivå av cellene behandlet med Andro alene (23,67 ± 4,21% 10,65 ± 0,22 vs.%, n = 4), mens den mitotiske indeksene i begge kontrollgrupper var ikke forskjellige fra hverandre (figur 7C), noe som tyder på at Taxi alene ikke induserer en M fase arrest. Immunoblotting ble anvendt til å analysere effektene av medikamenter på uttrykket nivåer og modifisering av Cdc25c, cyklin B1 og p21 proteiner (figur 7D). Øke konsentrasjonen av Andro økte fosforylerte formene for Cdc25c to ganger, p21 protein nesten 5-fold, og cyclin B1 4,1 ganger (figur 7E-G). Etter 100 mikrometer Taxi ble lagt til 20 mikrometer Andro, ble fosforyleringen av Cdc25c og proteinnivået av cyclin B1 forhøyet nesten 2 ganger og henholdsvis 3,5 ganger. I motsetning til dette ble det ekspresjonsnivået av p21 ikke signifikant endret i den kombinerte behandlingsgruppen. Imidlertid, 40 uM Andro i kombinasjon med 100 uM Drosje minsket cyklin B1 og Cdc25c nivåer, men økt p21 nivå med 1,8 ganger sammenlignet med 20 uM Andro og 100 uM taxi behandling. Disse eksperimentene viser at den kombinerte behandlingen resulterte i en opphopning av mitotisk stansede celler.
Cellene ble behandlet med (A) 0-40 uM av Andro i 48 timer (B) 20 uM av Andro for 0-48 h i nærvær eller fravær av 100 uM av taxi. Cellular DNA ble farget med PI og analysert ved flowcytometri. Fordelingen av cellesyklusen ble beregnet med den ModFit program. Mean ± S.D. (N = 4) i prosentandel av G2 /M-celle i nærvær av taxi (100 uM) og i fravær av taxi (taxi-) ble sammenlignet. * Indikerer signifikant forskjell mellom to grupper, * p 0,01, **
p
0,05. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
