Abstract
Magekreft er en ondartet sykdom som oppstår fra mage epitel. En potensiell biomarkør for magekreft er protein annexin A4 (ANXA4), en intracellulær Ca
2 + sensor. ANXA4 finnes først og fremst i epitel-celler, og er kjent for å være involvert i forskjellige biologiske prosesser, herunder apoptose, celle sykling og antikoagulasjon. I forhold til kreft, har ANXA4-overekspresjon blitt observert i kreft i ulike opprinnelse, inkludert mage svulster assosiert med
Helicobacter pylori
infeksjon.
H. pylori
induserer ANXA4 uttrykk og intracellulært [Ca
2 +]
i høyden, og er en viktig risikofaktor for kreftutvikling som fører til magekreft. Til tross for denne korrelasjonen, rollen ANXA4 i utviklingen av mage svulster er fortsatt uklart. I denne studien har vi undersøkt om ANXA4 kan megle frekvensen av cellevekst og om ANXA4 nedstrøms signaler er involvert i tumordannelse. Etter å observere frekvensen av cellevekst i sanntid, fant vi ut at ANXA4 fremmer celledeling. Transkripsjonen genet profil ANXA4-overuttrykkende celler ble målt og analysert ved hjelp av humane ekson matriser. Fra disse transkripsjonelle gen data, viser vi at overekspresjon av ANXA4 regulerer gener som er kjent for å være relatert til kreft, for eksempel aktivering av hyaluronan mediert motilitet reseptor (RHAMM), AKT, og cyklin-avhengig kinase 1 (CDK1) samt undertrykkelse av p21. Reguleringen av disse genene induserer cancer celleproliferasjon ytterligere. Vi har også funnet Ca
2+ kunne regulere overføringen av nedstrøms signaler ved ANXA4. Vi foreslår at ANXA4 utløser en signalkaskade, som fører til økt epitelcelleproliferasjon, slutt å fremme kreftutvikling. Disse resultatene kan derfor gi en ny innsikt for magekreft terapi, spesielt gjennom endring av ANXA4 aktivitet
Citation. Lin LL, Huang HC, Juan HF (2012) Avslører den molekylære mekanismen av magekreft Marker Annexin A4 i Cancer Cell Proliferation Bruke exon Arrays. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10,1371 /journal.pone.0044615
Redaktør: Eric Y. Chuang, National Taiwan University, Taiwan
mottatt: 6 juni 2012; Godkjent: 06.08.2012; Publisert: 07.09.2012
Copyright: © Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council of Taiwan (NSC 99-2621-B-002-005-My3, NSC 99-2621-B-010-001-My3), National Taiwan University Cutting-Edge Steering Research Project (10R70602C3) og National Health Research Institute, Taiwan (NHRIEX100-9819PI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis, og viser høy forekomst i asiatiske populasjoner. Selv om forekomsten av magekreft er synkende, er fortsatt lav den samlede fem års overlevelse [1]. Bestemme de mest effektive magekreftbehandlingen og å utvikle tidlig stadium diagnostiske verktøy er viktige strategier i å påvirke kliniske utfall. Den omfattende undersøkelse av de molekylære mekanismene som ligger bak magekreftutvikling kan gi bistand i å utvikle nyttige terapeutiske strategier for denne sykdommen.
Helicobacter pylori
er en gastric patogen og er den dominerende årsaksfaktoren for magekreft . Omtrent halvparten av verdens befolkning er smittet med
H. pylori
, og mer enn 60% av magekreftpasienter har en historie med
H. pylori
-positivity [2], [3], [4]. Nyere studier har vist at
H. pylori
kan indusere både spredning av magecancerceller og mukosale inflammatoriske responser [5], [6]. Derfor, for å kunne undersøke de molekylære mekanismene bak magekreftutvikling, er det nødvendig å undersøke rollen og mekanismer av
H. pylori
i magekreftutvikling.
Annexins er allestedsnærværende uttrykt i de fleste organismer, inkludert dyr, planter, sopp og protister. Det er forbundet med en rekke fysiologiske funksjoner [7]. Basert på strukturen av deres konservert kjernedomene, som annexins anses å være intracellulær Ca
2+ sensorer og fosfolipid-bindingsproteiner. De har blitt observert å stimulere membran trafficking og vesikkel aggregering i respons til økt intracellulært [Ca
2 +]
i [8], [9]. Hos mennesker har annexins blitt observert å ha en rekke cellulære funksjoner som er underforstått i cytoskeletal organisasjon, eksocytose, endocytose, ionekanal regulering, betennelser, apoptose, fibrinolyse og koagulasjon [8]. Annexins regnes også for å være involvert i kreft, diabetes og betennelse [10]. Nylig har flere og flere studier fremkom at implisere involvering av annexins i kreftutvikling, samt fremme spredning [11], [12], invasjonen [13] og metastasering [14], [15]. Imidlertid har forholdet mellom alle medlemmer av annexins familie med kreft ikke blitt karakterisert.
Annexin A4 (ANXA4) er et medlem av annexins familien forbundet med fordøyelsessystemet. Det er tydelig uttrykt i epitelceller [16]. Nyere studier har vist at ANXA4 er ansett for å være en potensiell gastrisk biomarkør basert på forbindelsens identifikasjon i vev i mage kreftpasienter i proteomic studier. Oppregulering av ANXA4 er spesielt funnet i
H. pylori
-infected tumorvev [17], [18]. I tillegg har mange studier har rapportert en sammenheng mellom ANXA4 uttrykk og kreft. Dette forholdet har blitt rapportert i bukspyttkjertelen adenokarsinom [19], klarcellet karsinom i eggstokken [20], [21], nyrekreft [22], tykktarmskreft [23] og prostata kreft [24]. I nyrecellekarsinom, oppregulering av ANXA4 er involvert i spredning av kreftceller, fremme celle migrasjon [22]. I pasienter med kolorektal kreft, ble høyt uttrykk for ANXA4 forbundet med en lav overlevelse og ble rapportert som en potensiell biomarkør for svulst diagnose [23]. I den grad cellular funksjon, kan ANXA4 indusere kalsiumsignalering, antikoagulasjon og motstand mot apoptose [25], [26]. Disse hendelsene viser at ANXA4 har tumorigent funksjon ved å regulere cellevekst.
I denne studien har vi til hensikt å belyse den molekylære mekanismen som ANXA4 induserer kreftutvikling. For å oppnå dette, overvåket vi veksten av mage kreftceller med ulike uttrykk nivåer av ANXA4. Vi har også undersøkt transkripsjons uttrykk profilen til ANXA4-overekspresjon celler og brukes ekson arrays for å analysere nedstrøms signalisering av ANXA4. Fra disse studiene har vi identifisert 9 kreftrelaterte gener fra ANXA4 nedstrøms signaler ved hjelp av databasen Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA). Videre viste vi at ANXA4 regulerer aktivering av RHAMM, AKT, CDK1 og undertrykkelse av p21, og derfor foreslått en ANXA4 regulert celleproliferasjon sti.
Resultater
Den Aktivering av ANXA4 Fremmer Cell Proliferation
Vi har tidligere rapportert at ANXA4 er overuttrykt i
H. pylori
infisert gastrisk kreftvev [17]. For ytterligere å undersøke forholdet mellom ANXA4 og kreftutvikling, rettet vi oss for å finne ut om ANXA4 fremmer celledeling. Cellene ble transfektert med enten full-lengde
ANXA4
cDNA å øke ANXA4 uttrykk eller spesifikke siRNA ment å dempe ANXA4 uttrykk. Etter transfeksjon, overvåket vi veksten i AGS magekreftceller ved hjelp av en real-time celle analyse (RTCA) system. Celle tall ble registrert som en celle indeks (CI) verdi. Vekst kurver av AGS-celler ble modifisert etter transfeksjon. Overekspresjon av ANXA4 økt cellevekst i AGS celler betydelig sammenlignet med kontrollceller (
P
0,001; figur 1A), mens ANXA4 knockdown betydelig redusert vekstrate (
P
0,05). Mellom ANXA4-overekspresjon celler og kontrollceller
ANXA4 er en plasmamembran bindende protein, så vi foreslå at andre plasma membran proteiner kan bli regulert av ANXA4 og arbeide sammen for å omsette sin nedstrøms signalering. For å utforske signaloverføring regulert av ANXA4 undersøkte vi plasmamembranproteiner fra ekson rekke analyse. Førti-syv plasma membran proteiner ble observert å ha en ≥1.5 ganger endring i ANXA4-overekspresjon celler (tabell S1). Blant disse hyaluronan-mediert motilitet reseptor (
HMMR
) viste den største økningen i uttrykket (2,4 ganger; Tabell S1). Videre vår tidligere studie viste at celleoverflaten uttrykk for lysosomal-assosiert membran protein 2 (
LAMP2
), en lysosomal markør, er oppregulert ved ANXA4 og er involvert i eksocytose (figur S2 og File S1) . Her transkripsjonen uttrykk for
LAMP2
viste også en økning i uttrykk (1,8 ganger; Tabell S1) målt ved ekson rekke analyse. I denne studien ble ANXA4 overuttrykt eller dempet (figur 2A) og deretter analysert ved immunblotting for å undersøke protein ekspresjon av RHAMM og LAMP2. ANXA4 overekspresjon økt ekspresjon av RHAMM (figur 2B) og LAMP2 (figur 2C) og, i samsvar med dette, knockdown av ANXA4 uttrykk redusert sine nivåer av uttrykk (figur 2B og 2C).
(A) AGS celler ble transfektert med enten en tom vektor (pcDNA3.1), full-lengde
ANXA4 plakater (pcDNA3.1 /
ANXA4
), kontroll siRNA (siControl), eller
ANXA4
siRNA (si
ANXA4
). (B-C) RHAMM og LAMP2 uttrykk ble målt i ANXA4-overekspresjon celler eller celler som inneholder
ANXA4
-spesifikke siRNA av immunblotanalyse. (B) Uttrykket av RHAMM var signifikant oppregulert (
P
0,05) etter overekspresjon ANXA4 og betydelig nedregulert (
P
0,01) etter å kneble ANXA4 uttrykk. (C) Uttrykket av LAMP2 ble oppregulert etter overekspresjon ANXA4 og betydelig nedregulert (
P
0,05) etter å kneble ANXA4 uttrykk. Data er representert som gjennomsnitt ± SD, n = 3. *
P
. 0,05 vs. kontroll behandlings verdier
ANXA4 Overuttrykte Regulerer Kreft-relatert Gene Expression
Vi brukte databasen Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) for å utføre en gen-funksjon analyse av ekson array-data, og funnet ut at 25 av de 42 genene var kvalifisert for nettverksfunksjonsanalyse (≥2-fold differensial uttrykk,
t
test,
P
0,05) (tabell 1). Tre funksjonelle nettverk ble signifikant assosiert med ANXA4-regulert gener. Den mest sterkt knyttet nettverk var
kreft, cellesyklus, og reproduktive system sykdom product: (
P
0,05, figur 3A) og topprangerte av sykdommer eller lidelser ble
kreft product: (
P
0,05, figur 3B). Det var 9 gener som er klassifisert som kreftrelaterte gener i ANXA4-overekspresjon celler inkludert 7 gener som ble oppregulert i våre eksperimenter. Disse genene er eukaryote oversettelse initiering faktor 4E (
EIF4E
), succinatdehydrogenase komplekse, underenhet C, integrert membran protein, 15 kDa (
SDHC
), cyclin-avhengig kinase 1 (
CDK1
), slettes lymfatisk leukemi 2 (
DLEU2
), kromatin modifisere protein 5 (
CHMP5
), tidløs samspill protein (
TIPIN
), PDZ- bindende kinase (
PBK
). Chorionic somatomammotropin hormon 1 (placenta lactogen) (
CSH1
) og interferon alfa 2 (
IFNa2
) ble nedregulert av ANXA4. På grunnlag av våre resultater, foreslår at ANXA4 har en funksjon i å indusere celleproliferasjon. Videre
CDK1 Hotell og
PBK plakater (figur 3B og Tabell 1) ble ansett for å være involvert i ANXA4 spredning induserende modell. Siden CDK1 aktivering er forbundet med celleproliferasjon i utviklingen av gastrisk MALT lymfom [28]. Den gjensidige aktivering av CDK1 og PBK har tidligere blitt rapportert [29]. I denne studien, oppregulering av
CDK1 Hotell og
PBK
observert i ANXA4-overekspresjon celler ble validert av kvantitativ real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR) analyse (Figur S3) .
(A) 25 av de 42 kandidatgener viste en signifikant forskjell i uttrykk (en dobling av ≥2 eller en fold nedgang på ≤0.5,
P
0,05 ), og ble kategorisert blant de tre topprangerte nettverk. (B) Gener ble klassifisert i henhold til deres dokumenterte /etablerte roller i ulike sykdomstilstander og lidelser.
ANXA4 Regulerer Aktivering av AKT, CDK1 og bekjempelse av p21
CDK1 aktivering , som reguleres av p21, hemmer G2 /M fase arrest, og dermed fremme mitose og celledeling [30]. Det har også blitt rapportert at AKT blokkerer aktivering av p21, forårsaker at en akkumulering i cytoplasma og følgelig fremme celleproliferasjon [31]. Ved hjelp av immunoblot-analyse, observerte vi at overekspresjon av ANXA4 økt fosforylering av serin 473 på AKT og treonin 161 på CDK1 og redusert ekspresjon av p21 (figur 4A). I tillegg til dette, knockdown av ANXA4 ekspresjon ble redusert fosfo-AKT og fosfo-CDK1 og økt ekspresjon av p21 (figur 4B). Disse dataene antyder at fosfor-AKT, fosfor-CDK1 og p21 er regulert av ANXA4 og er nedstrøms signaler om ANXA4
(A
–
B). Protein nivåer av p21, fosfor-AKT ( Ser473) og fosfo-CDK1 (Thr161) i AGS-celler, som bestemt ved immunblotanalyse. (A) Cellene ble transfektert med tom vektor eller full-lengde
ANXA4
. (B) Cellene ble transfektert med siControl eller si
ANXA4
. Representative data fra tre uavhengige eksperimenter er presentert som gjennomsnitt ± SD. α-tubulin ble anvendt som en intern kontroll. *
P
0,05, **
P
. 0,01 vs. kontroll behandlings verdier
Ca
2+ som megler ANXA4 Nedstrøms Signa Transduksjon
i carcinogenesis, Ca
2+ er involvert i å forårsake signaltransduksjon til å mediere en rekke biologiske prosesser, inkludert invasjon, proliferasjon, angiogenese og metastase [32]. Det har blitt rapportert at annexins kan formidle noen fysiologiske mekanismer i en Ca
2 + -avhengig måte [9]. I tidligere studier, intracellulær [Ca
2 +]
i høyde ble indusert av
H. pylori
infeksjon, som i sin tur opp-regulerer ANXA4 uttrykk [17], [33]. For å avgjøre om en økning i intracellulært [Ca
2 +]
i medierer overføring av nedstrøms signaler fra ANXA4 ble AGS celler behandlet med ionomycin. Ionomycin er en Ca
2+ ionofor og ble tilsatt til kulturmediet i vårt AGS cellemodell for å indusere en vedvarende økning av intracellulært [Ca
2 +]
i [34]. Protein uttrykk for ANXA4, LAMP2, RHAMM, p21, fosfo-AKT og fosfo-CDK1 ble målt ved immunoblotanalyse (figur 5A). I likhet med våre observasjoner med ANXA4 overekspresjon, økt [Ca
2 +]
I nivåer betydelig oppregulert uttrykk for RHAMM (
P
0,01) og fosfor-AKT (Ser 473) (
P
0,05) og signifikant nedregulert uttrykket av p21 (
P
0,01) (figur 5B). CDK1 aktivering ble noe økt etter [Ca
2 +]
i høyden. Men forhøyet [Ca
2 +]
I nivåene hadde ingen effekt på uttrykk for ANXA4 og LAMP2. I vår forrige undersøkelse, kan ANXA4 og LAMP2 lokalisere til plasmamembranen etter
H. pylori
infeksjon med intracellulær [Ca
2 +]
i heving (figur S4 og File S1). Disse resultatene tyder på at Ca
2+ bare forandrer intracellulære plassering av ANXA4 og LAMP2, men ikke regulerer deres ekspresjon.
(A) Celler ble behandlet med ionomycin for å øke intracellulære Ca
2 + nivåer og uttrykket nivåer av ANXA4, LAMP2, RHAMM, fosfor-AKT (Ser473), p21, og fosfor-CDK1 (Thr161) var viste ved immunoblotting. (B) Histogrammet viser relaterte nivåer (A). De relative uttrykk for RHAMM (
P
0,01), fosfor-AKT (Ser473) (
P
0,05) og p21 (
P
0,01) var signifikant forskjellig. Data er tatt fra tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SD). *
P
0,05, **
P
. 0,01 vs. kontroll behandlings verdier
Diskusjoner
I kreftforskning, identifisering av biomarkører og den etterfølgende klargjøring av deres mekanistiske forhold til tumorgenese kan bidra til utvikling av nyttige diagnostiske verktøy og resulterer i optimale terapeutiske strategier. Nylig har flere og flere studier har vist at biomarkør kandidat proteiner i annexins familien er potensielt medvirkende i utviklingen av ulike kreftformer; f.eks ANXA1 for klarcellet nyrekreft, ANXA2 for magekreft og endetarmskreft, ANXA4 for tykktarmskreft, ANXA8 for brystkreft, ANXA10 for leverkreft, ANXA11 for eggstokkreft og tykktarmskreft [35]. ANXA4, et medlem av annexins familie, har blitt observert å være overuttrykt i mage tumorvev og er også forbundet med magekreft relaterte
H. pylori
infeksjon [17]. I tillegg har en annen annexins familiemedlem, ANXA2, også blitt observert å være overuttrykt i magekreft og er relatert til dårlig klinisk utfall, noe som gjør det en potensiell prognostisk faktor [36]. Samlet utgjør disse funnene tyder på involvering av ANXA4 i tumorigenesis; men dens nøyaktige mekanisme i prosessen er fortsatt uklar. For ytterligere å evaluere den cellulære funksjon ANXA4 i utviklingen av magekreft, utforsket vi koblingen mellom de to, og senere viste at ANXA4 kan regulere kreftrelaterte gener og forplante banen til celleproliferasjon.
I denne studien fant vi at karsinogenisitetsstudier-assosierte proteiner som RHAMM, AKT, p21, PBK, og CDK1 er regulert av overekspresjon av ANXA4. En skjematisk fremstilling av ANXA4-induserte nedstrøms signaler relatert til celleformering er vist i figur 6.
HMMR plakater (RHAMM) er et onkogen som er overuttrykt i mange kreftformer, inkludert magekreft, og har vært implisert i mange cellulære prosesser, for eksempel cellesignalisering, celleproliferasjon, og tumorigenesis [37], [38].
ANXA4 binder til plasmamembranen i en Ca
2 + -avhengig måte og induserer nedstrøms signale transduksjon. ANXA4 up-regulerer LAMP2, en lysosomal markør involvert i eksocytose, og RHAMM. Tidligere rapporter har vist at RHAMM aktiverer RAS og PI3K, som senere fører til induksjon av AKT. ANXA4 opp-regulerer AKT og CDK1 aktivering, PBK genekspresjon og ned-regulerer P21. Ca
2+ også opp-regulerer RHAMM og fosfor-AKT, og nedregulerer p21. Denne signalkaskade kan til slutt føre til cellehyper. Heltrukne linjer med piler og blå sirklene indikerer bekreftet regel; stiplede linjer med piler og lilla sirkler angir referanser eller ubekreftede interaksjoner.
Det har blitt rapportert at RHAMM induserer RAS signalkaskade og aktiverer AKT [39]. RAS signalkaskade transduces nedstrøms signaler ved å aktivere fosfor-AKT gjennom phosphoinositide 3-kinaser. Denne aktivering av AKT har også blitt rapportert som en markør for magekreft progresjon [40]. Vi har tidligere rapportert at
H. pylori
infeksjon er assosiert med ANXA4 overekspresjon [17].
H. pylori
kan levere cytotoksinet forbundet gen A (CagA) inn i vertsceller, noe som resulterer i AKT aktivering, og dermed fremme celleproliferasjon [41]. I form av celleoverlevelse, undertrykker AKT apoptose ved å stimulere NF-kB [42]. Nyere studier har også vist at ANXA4 samvirker med p105 (NF-kB p50 forløper protein) og undertrykker transkripsjonen aktivitet av NF-kB å indusere en anti-apoptotiske virkning [25]. Samlet utgjør disse observasjoner tyder på at ANXA4 spiller en viktig rolle i celleoverlevelse og cellevekst.
CDK1-cyclin B1 komplekser regulere cellesyklus G2 /M fase, og har også vært implisert i å fremme tumorigenesis [43]. En fersk studie viste at økt uttrykk av CDK1 er knyttet til progresjon fra
H. pylori gastritt
-associated til mukosa-assosiert lymfoid vev lymfom [28]. I denne studien CDK1 aktivisering var oppregulert ved ANXA4. Disse hendelsene viser at ANXA4 kunne mekle nedstrøms signalveien, som fører til tumorigenesis i magekreftpasienter med en
H. pylori
infeksjon.
I tillegg til sitt engasjement i utviklingen av kreft, har ANXA4 også vært knyttet til ervervet chemoresistance til kreft narkotika [44], [45], [46]. I en paclitaxel-resistent cellelinje (H460 /T800), blir ANXA4 ekspresjon økes og lokalisert i kjernen [44]. I klart cell carcinoma av eggstokken og mesothelioma celler, er ANXA4 uttrykk forhøyet og forbundet med resistens mot behandling med karboplatin, og regnes for å være en biomarkør for mottakelighet for cisplatin [45], [46]. Videre er ANXA4 en intracellulær Ca
2+ sensor, og Ca
2+ spiller en viktig rolle i neurotoksisitet og hjertesvikt [47], [48]. Nyere studier har vist at den økte mengden av ANXA4 er ikke bare forbundet med kreft, men også Alzheimers sykdom, hjertefeil og celle lesjon forårsaket av etanol [49], [50], [51].
Ca
2 + messenger system er også nødvendig for celleproliferasjon prosess og kan regulere cellesyklus [52], [53]. Det har blitt rapportert at Ca
2+ kan aktivere AKT veien for å fremme celle overlevelse [54]. I denne studien fant vi at uttrykket av RHAMM, fosfo-AKT og undertrykkelse av p21 ble betydelig økt etter [Ca
2 +]
i høyde (figur 5).
H. pylori
infeksjon er assosiert med ANXA4 overekspresjon og intracellulært [Ca
2 +]
i heving (figur S4 og File S1) [17], [33]. Disse resultatene indikerer at
H. pylori
infeksjon kan forårsake noen nedstrøms signal av ANXA4 ved å stimulere intracellulær [Ca
2 +]
i høyden. Likevel detalj mekanismen i prosessen kan være komplisert og er fortsatt uklar. Disse kan gi klarlegging av mage tumorigenesis prosessen underliggende
H. pylori
stimulering. Til sammen tyder dette bevis på at Ca
2+ kan hjelpe ANXA4 å omsette alarm og fremme tumordannelse i mage pasienter med
H. pylori
infeksjon.
I konklusjonen, våre resultater viser at ved å stanse all ANXA4 synker epitelcelleproliferasjon, mens overekspresjon øker spredning. Videre induserer ANXA4 nedstrøms signaler som fremmer cellevekst. Vi hypotese at disse nedstrøms signaler og aktivering av verts celledeling kan være sykdomsfremkallende hendelser i
H. pylori
indusert kreftutvikling. I klinisk terapi, har AKT, p21 og CDK1 blitt brukt som et anticancer-medikament mål. AKT-inhibitor, Perifosine, er et oralt middel mot kreft og har anti-spredning aktivitet i flere tumormodeller [55], [56], [57]. Paclitaxel (Taxol) og vinkristin kan indusere og øke p21 uttrykk for å redusere G2 /M arrest og blokkere celledeling [58], [59], [60], [61]. Flavopiridol er en inhibitor av flere CDK inkludert CDK1 å indusere apoptose og anti-angiogenese [62]. Disse studiene tyder på at høyden av ANXA4 hos pasienter som kan anses som et medikament mål for magekreft terapi. Bruk av flere medikamenter i kombinasjon kan gi mer effektiv behandling for blokkering av signaler i reaksjonsveien. Til sammen kan dette studiet gi ny innsikt i utvikling av terapeutiske strategier for magekreft.
Materialer og metoder
cellelinjer og kultur betingelser
Menneskelig magen adenokarsinom AGS celler (CRL-1739, ATCC) ble dyrket i 90% RPMI 1640-medium (Biological Industries, Bet-HaEmek, Israel) som ble supplert med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (Biological Industries, Bet-HaEmek, Israel) . Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en kontrollert fuktig atmosfære i en inkubator med 5% CO
2.
plasmider og transfections
Full-lengde
ANXA4
var amplifisert ved PCR ved anvendelse av primer-par
ANXA4
-F (5 «atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3») og
ANXA4
-R (5 «gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3»), og forsterkningen produkt ble satt inn i Hindlll /EcoRI setene av pcDNA 3,1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, California).
ANXA4
-spesifikke siRNA og negativ kontroll Stealth siRNA (Stealth RNAi ™) ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Celler ble dyrket i seks-brønns plater eller på belagte dekkglass i 24 timer. Cellene ble deretter transient transfektert med pcDNA 3.1 (+) /
ANXA4 plakater (8 ug for en seks-brønns plate, 0,4 ug /ml for en 96-brønners E-plate) eller
ANXA4
siRNA (100 pmol for en seks-brønns plate, 10 pmol for en 96-brønners E-plate) under anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Effektiviteten av ekspresjonsvektor og siRNA transfeksjon ble analysert ved immunblot. Etter transfeksjon i 48 timer ble den differensielle ekspresjonen av proteiner og gener påvist
Antistoffer
muse monoklonale antistoffer brukt i denne studien var som følger:. CDK1 p34 (SC-51578) fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA); LAMP2 (ab25631) og RHAMM (ab67003) fra Abcam (Cambridge, UK); og α-tubulin (T5168) fra Sigma (Dorset, UK). Kanin polyklonale antistoffer var som følger: ANXA4 (SC-28827), p21 (sc-397), og pCDK1 p34 (Thr 161; sc-101 654) fra Santa Cruz Biotechnology; og AKT (9272) og Pakt (Ser473, 9271S). fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)
Immunoblotting
Cellelysater ble preparert fra AGS celler som ble transient transfektert med ekspresjonsvektorer pcDNA 3,1 (+) /
ANXA4 plakater (8 mikrogram) eller
ANXA4
siRNA (100 pmol). For å bestemme forskjellene i proteinekspresjon under betingelser med høy intracellulært [Ca
2 +]
i, ionomycin (5 uM) ble tilsatt til cellene i 1 time. For å studere effekten av inhibering av Akt fosforylering ble cellene sultet i 1,5 time etter en 48-timers transfeksjon og ble behandlet med 5 uM av AKT-inhibitor VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) i 1 time. Prøver ble separert ved 10% SDS-PAGE og deretter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Etter blokkering i 5% fettfri melk og tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) i 1 time ved romtemperatur med forsiktig vugging, de følgende primære antistoffer ble brukt: anti-ANXA4 ( 1:1000), anti-p21 (1:500), anti-AKT (1:500), anti-Pakt (Ser473, 1:500), anti-CDK1 (1:1000), anti-pCDK1 (Thr 161; 1:500), og anti-RHAMM antistoff (1:400). Membraner ble inkubert med sekundært geite-anti-muse-antistoffer konjugert IgG (Sigma) eller geite-anti-kanin-IgG konjugert (Rockland, Gilbertsville, PA), henholdsvis. a-tubulin-antistoff (1:4000) ble anvendt som en intern kontroll. Immunoblotter ble utviklet ved hjelp av forbedret chemiluminiscence (ECL) deteksjon kit (Millipore) og visualisert på X-ray filmer. Intensiteten av de observerte bånd var normalisert til intensiteten av den α-tubulin band. Densitometrisk analyse ble utført ved hjelp av Kodak 1-D bildeanalyse programvare versjon 3.6 (Eastman Kodak, London, UK).
Exon Array Hybridisering og analyse
For å studere nedstrøms gener ANXA4, sammenlignet vi de genekspresjonsprofiler mellom cellene transfektert med pcDNA3.1 (+) /
ANXA4
og kontroll-celler transfektert med tom vektor ved hjelp av en exon matrise. Totalt cellulært RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol® reagens (Invitrogen), og RNA renhet ble bekreftet ved hjelp av spektrofotometri (A260 /A280-forhold), så vel som ved kapillær elektroforese (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). RNA prosessering og hybridisering ble utført ved hjelp av Affymetrix Menneskelig Exon 1,0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Hvert utvalg har 28,869 godt kommenterte gener med 764,885 forskjellige sonder. Matrisen inneholder ca 26 prober for hvert gen. Affymetrix probe setter informasjon vises på NetAffx nettsted (https://www.affymetrix.com) [63]. Microarray analyse (n = 2 per gruppe) ble utført ved hjelp av Partek Genomics Suite versjon 6.5 (Partek Inc., St Louis, MO, USA). Rådata (CEL filer) ble normalisert ved hjelp av robust multichip gjennomsnitt (RMA) algoritme og analysert ved hjelp av
t
tester. Analyse av funksjon og biologisk mekanisme av de differensielt uttrykte gener ble utført ved anvendelse oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) software versjon 7.5; en score på 3 eller høyere ble betraktet som statistisk signifikant (
P
0,01) for å kommentere opplysningene. Vi har sendt inn tabelldata til GEO database, og serien rekordmange er GSE33620.
Kvantitativ Real-time PCR (QRT-PCR)
De exon rekke data innhentet ved hjelp Partek programvare og IPA-databasen ble bekreftet ved QRT-PCR.
