Abstract
MUC1 er assosiert med mobilnettet transformasjon og tumorigenicity og er betraktes som en viktig tumorassosiert antigen (TAA) for kreftterapi. Vi har tidligere rapportert at anti-MUC1 monoklonalt antistoff C595 (MAb C595) pluss docetaxel (DTX) økt effekt av DTX alene og forårsaket dyrkede humane ovarialcancer (EOC) celler til å gjennomgå apoptose. For ytterligere å studere mekanismene for denne kombinasjonen-mediert apoptose, undersøkte vi effekten av denne kombinasjonsterapien
in vivo
i en intraperitoneal (i.p.) EOC musemodell. OVCAR-3-celler ble implantert intraperitonealt i hunn atymiske nakne mus og får vokse tumor og ascites. Mus ble deretter behandlet med enkelt Mab C595, DTX, kombinert test (Mab C595 og DTX) Kombinasjonen kontroll (negativ MAb IgG
3 og DTX) eller bærerkontroll i.p i 3 uker. Behandlede mus ble drept 4 uker etter behandling. Ascites volum, tumor vekt, CA125 nivåer fra ascites og overlevelse av dyr ble vurdert. Uttrykket av MUC1, CD31, Ki-67, TUNEL og apoptotiske proteiner i tumorxenotransplantater ble evaluert av immunhistokjemi. MAb C595 alene hemmet i.p. tumorvekst og ascites produksjon på en doseavhengig måte, men ikke åpenbart forhindre tumorutvikling. Men kombinasjonen test betydelig redusert ascites volum, tumorvekst og metastaser, CA125 nivåer i ascites og forbedret overlevelse av behandlede mus sammenlignet med monoterapi-behandlede mus kombinasjon kontroll eller kjøretøykontroll-behandlede mus (
P
0,05). Dataene var i en god avtale med det fra dyrkede celler
in vitro
. Mekanismene bak de observerte effekter kan være gjennom målretting MUC1 antigener, hemning av tumor angiogenese, og induksjon av apoptose. Våre resultater tyder på at denne kombinasjonen tilnærmingen effektivt kan redusere tumorbyrde og ascites, forlenge overlevelsen av dyr gjennom induksjon av svulst apoptose og nekrose, og kan gi en potensiell behandling ved avansert metastatisk EOC
Citation. Wang L, Chen H, Pourgholami MH, Beretov J, Hao J, Chao H, et al. (2011) Anti-MUC1 monoklonalt antistoff (C595) og Docetaxel Markert redusere tumorbyrde og Ascites, og forlenge overlevelsen i en
in vivo
Eggstokkreft Model. PLoS ONE 6 (9): e24405. doi: 10,1371 /journal.pone.0024405
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: May 23, 2011; Godkjent: 09.08.2011; Publisert: 09.09.2011
Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av en internasjonal samarbeids Grant fra Henan Health Board, Kina (LW, HMC og HTC), en Cancer Institute NSW Karriereutvikling Fellowship (YL) og St George Hospital Ovarian Cancer Research Trust Fund (YL og JK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er den mest dødelige gynekologisk kreft og den femte vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall hos kvinner i USA, noe som resulterer i anslagsvis 21,880 nye tilfeller og 13,850 dødsfall i 2009 [1 ]. Pasienter med avansert sykdom har en svarprosent på mer enn 80% etter kirurgi og adjuvant kjemoterapi med platina-taxan, med en median progresjonsfri intervall på 18 måneder [2]. Dessverre, vil kreften går igjen i de fleste av disse pasientene, og den samlede fem års overlevelse for pasienter med avansert stadium sykdommen er bare 23-30% [3]. Konvensjonell kreft kjemoterapi ofte resulterer i alvorlige bivirkninger knyttet til ikke-spesifikke virkningsmekanismer. Studier som evaluerer ulike cytostatika i tilbakevendende EOC har funnet responsrate på 10-28% med en medfølgende progressiv økning i antall resistente svulster [4]. Dermed er nye terapeutiske strategier sterkt behov for å forbedre resultatet for denne dødelige sykdommen. En lovende tilnærming som kan forbedre pasientens resultater er bruken av monoklonale antistoffer (MAbs) kombinert med tradisjonell kjemoterapi.
MUC1 er en stor molekylvekt transmembran glykoprotein som blir overuttrykt i mange karsinomer [5], [6], inkludert EOC [7] – [9], og medierer signaltransduksjonsveiene hendelser som stimulerer motiliteten, invasjon og metastase av kreftceller [10]. MUC1 er overuttrykt i 90% av EOC celleoverflater [7], [8]. De forbedrede nivåer av MUC1 uttrykk av kreftceller kan maskere ekstra-cellulære domener fra immunovervåkning, overdragelse en overlevelsesfordel på ondartede celler og spiller en viktig rolle i evnen til svulster å invadere og metastaserer [11]. Dermed er tumor-assosiert MUC1 en lovende molekylære mål for en ny behandling for EOC pasienter.
C595 er en IgG
3, hevet murine MAb mot protein kjernen av menneskelige MUC1 (urin epitelceller mucin1) [ ,,,0],12]. Epitopkartlegging har vist at C595 gjenkjenner et tetrapeptid motiv (RPAP) innenfor proteinkjernen av MUC1 mucin som inneholder et stort domene av multipla av en sterkt konservert 20-amino-syre repetisjonssekvensen (PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA) [12], [13]. MAb C595 har blitt merket med γ-utslipp radioisotop (
111In) for å teste sin kapasitet for kreft lokalisering og identifikasjon hos 19 pasienter med klinisk mistanke om ovarian kreft, og oppnådde endelige nøyaktighet på 79% og 64% sammenlignet med magnetisk resonans avbildning og ultralyd i forhold til den endelige tumorhistologi [14]. Etter merking med α-emitter (
213Bi),
213Bi-C595 α-konjugat (AC) har blitt brukt til å målrette enkelt prostata [15], bukspyttkjertel [16] og eggstokk-celler [17]
i vitro Hotell og regress bukspyttkjertelen subkutane xenografter
in vivo product: [18]. Disse resultatene støtter hypotesen om at MAb C595 er nyttig enten alene eller i kombinasjon med andre behandlinger for å forbedre behandlingen av den avanserte EOC.
Selv om paclitaxel brukes i førstelinjebehandling, dens analoge docetaxel (DTX) har fordeler, blant annet tregere mobil utstrømming og høyere oppløselighet, noe som åpner for høyere intracellulære konsentrasjoner [19]. I kliniske studier DTX resultert i tilsvarende responsrate og har vist aktivitet mot paclitaxel-ildfast karsinom [20], [21]. DTX har vist betydelig aktivitet i både prekliniske og kliniske studier for behandling av mange faste ondartede sykdommer inkludert EOC [22] – [25]. Det er sannsynlig at DTX kan bli en del av førstelinjebehandling for EOC. DTX kombinert med en platinaforbindelse (slik som karboplatin) har blitt systemisk kjemoterapi grepet av primær EOC, med høy effektivitet. Men doserelatert toksisitet og eventuell utvikling av resistens er store problemer som krever oppmerksomhet i en gynekologisk onkologi setting. Til syvende og sist de fleste av disse pasientene vil dø av metastatisk sykdom. Opprettholde lave nivået av legemidler i den systemiske sirkulasjon gjennom lokaliserte levering kan dermed redusere giftige bivirkninger, og øke lokal medikamentkonsentrasjoner i bukhinnen, hvor ovarietumorer og ascites bor. Dette kan oppnås gjennom i.p. administrasjon. The National Cancer Institute har anbefalt at i.p. kjemoterapi vurderes for behandling av avansert eggstokkreft [26]. Kombinasjonsbehandling ved anvendelse av spesifikt strategier, for eksempel et kjemoterapeutisk middel i tillegg til et antistoff gjennom i.p. Administrasjonen kan effektivt redusere dosebegrensende toksisitet og bedre behandlingseffekt
I en fersk undersøkelse, viste vi at MAb C595 alene kunne drepe EOC celler på en doseavhengig måte.; dette drapet var også avhengig av MUC1 uttrykk nivåer. Low-dose MAb C595 kombinert med DTX økt EOC følsomhet for kjemoterapi narkotika og redusert dosen som brukes [27]. I denne studien hypotese vi at denne kombinasjonen behandling effektivt kan arbeide i en
in vivo
EOC dyremodell. Vi fant ut at MAb C595 kan hemme i.p. tumorvekst og ascites produksjon i OVCAR-3 mus xenograft modell og forsterke den terapeutiske effekt av DTX på en konsentrasjonsavhengig måte, og at etter i.p. injeksjon, kan dette kombinasjonsbehandling (test) (MAb C595 og DTX) markert redusere tumorbelastning og ascites og dermed forlenge overlevelsen av behandlede dyr. Våre resultater tyder på at denne nye kombinasjonen holder løftet som en potensiell behandling for behandling av avansert metastatisk EOC.
Materialer og metoder
Drug
DTX ble kjøpt fra Sigma-Aldrich , Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia. Medikamentet ble først fortynnet i [hydroperoxymethyl cellulose (HPMC) fremstilt som 0,5% i PBS] og lagret ved 4 ° C til bruk.
Antistoffer
MAb C595 ble vennligst tilveiebrakt av Nottingham University ( Nottingham, UK). Mus anti-human IgG
3 isotypekontrollantistoff MAb ble kjøpt fra Zymed Laboratories Inc (South San Francisco, CA, USA). Kanin anti-human Ki-67, caspase-3 (aktiv), og PARP-1 (spaltet P85) MAbs ble gitt av Epitomics (Burlingame, CA, USA). Rotte anti-mus CD31 MAb ble kjøpt fra BD Pharmingen (Bedford, MA, USA). Svine anti-geit, -mouse, -kaninIgG /biotinylert, kanin anti-rotte IgG /biotinylert, streptavidin /pepperrotperoksidase (HRP) og mus IgG
1 negativ kontroll MAb ble kjøpt fra Dakopatts (Glostrup, Danmark).
Cell linje og dyremodell
For alle forsøkene, 6~8 uker gammel kvinne naken atymiske BALB /c nu /nu mus (animal Resources Centre, Perth, Western Australia) ble brukt. Musene ble plassert og vedlikeholdes i laminær skap under spesifikke patogen frie forhold i anlegg som er godkjent av University of New South Wales (UNSW) Animal Care og etisk komité (ACEC). Denne studien ble godkjent av ACEC, UNSW (ID: 08 /110A). Dyrene ble holdt i minst en uke før eksperimentell prosedyre.
Den primære OVCAR-3 EOC-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), og det sub-linje av OVCAR-3 ble valgt og opprettet i en ip xenograft modell ved hjelp av nakne mus i vårt laboratorium [28]. Dette valget kan øke tumorigenitet av OVCAR-3 celler
in vivo
. Kort, levedyktig ovčar-3 celler (5 × 10
6/500 mL i DPBS) ble injisert intraperitonealt anvendelse av en 1 ml sprøyte med en 26 gauge nål og tillatt å vokse. Tumorprogresjon ble dokumentert gang i uken i 10 uker med målinger av abdominal omkrets for mage økning med en myk linjal. Ved offer, ble svulster fjernet for vekting og fortsetter for histologisk testing
behandlingsprotokoller
Toksisitetsstudier hos hårløse mus uten svulster. Toksisitetsstudier ble utført for å bestemme den maksimale toleranse dose (MTD) i mus for enkelt MAb C595, mus IgG
3 negativ kontroll MAb, DTX, kombinert test (MAb C595 og DTX) og kombinasjonen kontroll (negativ MAb IgG
3 og DTX). Dosen-Toleranse forhold ble undersøkt i nakne mus (uten tumorer) for et enkelt i.p. administrasjon av MAb C595, DTX og kombinasjonsbehandling (test) sammenlignet med kombinasjonskontrollbehandling. Grupper på fem mus mottok en total injisert konsentrasjon på 1, 5, 10, 15, 20 mg /kg av MAb C595, eller 3, 5, 7, 10, 15 mg /kg av DTX samt kombinert MAb C595 (1 /3 av MTD dvs. 5 mg /kg) eller 5 mg /kg MAb-IgG
3 med 3, 5, 7, 10 mg /kg av DTX i 3 uker. De valgte doser av MAbs var basert på MTD av enkelt av MAb C595 og DTX. Musevekt ble sammenlignet med dem ved dag 0 (første dag av behandlingen administrering) for å bestemme prosent vektendring. Den dosebegrensende toksisitet ble definert som sluttpunkt: 15% tap av kroppsvekt eller distressed atferd (dvs. tap av appetitt og aktivitet, krum holdning). MTD ble definert som den høyeste dosen hvorved en tredjedel av kullet nådde dosebegrensende toksisitet endepunkter [29]. Etter 10 uker, ble friske musene avlivet. Følgende forsøk ble basert på MTD fra toksisitetsstudier
Effektstudier i OVCAR-3 EOC dyremodell. Etter utviklingen av ascites ble bukhulen vasket med 2 ml sterilt fysiologisk saltvann. De peritoneal innholdet ble blandet ved å administrere forsiktig og deretter helt aspirert [28]. Mus ble deretter tilfeldig fordelt i enten Mab C595 eller DTX alene enkelt behandlingsgruppe eller en kombinasjon test (Mab C595 og DTX) og kombinasjoner kontroll (MAb IgG
3 og DTX) gruppe (n = 10 per gruppe). Forskjellige behandlinger ble igangsatt umiddelbart etter aspirasjon av ascitesvæske.
a). For enkelt Mab C595 behandling, lav dose (LD) (5 mg /kg) eller høy dose (HD) (15 mg /kg) MAb suspendert i 1 ml saltvann, og det samme volum av saltløsning med 15 mg /kg mus MAb IgG
3 (kontroll) ble administrert en gang /uke i 3 uker.
b). For enkelt DTX behandling, LD (5 mg /kg) eller HD (10 mg /kg) DTX suspendert i 1 ml av HPMC (fremstilt som 0,5% i PBS) som et kjøretøy og det samme volum av HPMC som en kontroll.
c). For kombinasjonen test (Mab C595 og DTX) og kombinasjoner kontroll (MAb IgG
3 og DTX) gruppene, ble det følgende brukt. Kombinasjonen test inkluderte en enkelt dose av Mab C595 (1/3 dose av MTD, dvs. 5 mg /kg suspendert i 0,5 ml saltoppløsning) i kombinasjon med en enkelt dose av DTX (10 mg /kg DTX suspendert i 0,5 ml av HPMC). Kombinasjonen kontroll tatt med en enkelt dose av MAb IgG
3 (5 mg /kg suspendert i 0,5 ml saltoppløsning) i kombinasjon med en enkelt dose av DTX (10 mg /kg DTX suspendert i 0,5 ml av HPMC). Den kombinasjonsbehandling (test og kontroll) ble administrert sekvensielt fra MAb C595 eller MAb IgG
3 til DTX.
Alle behandlinger ble utført i.p. og beregnet varighet av behandlingen var 4 uker basert på våre tidligere studier. Etter behandling, hvis et dyrs abdominalomfang nådde 9,5 cm, eller hvis de var forventet å bli døende i løpet av kort tid ble dyrene avlivet. Overlevelsestid på hvert dyr ble beregnet som antall dager mellom initiering av behandling og eutanasi. På slutten av forsøkene, ble musene avlivet ved halshugging, mens under urethrane anestesi.
Prøvetaking
Før dødshjelp, en blodprøve ble samlet inn gjennom hjerte punktering under narkose. På slutten av forsøkene ble 2 ml fysiologisk saltvann injisert i.p. og bukhulen var helt vasket og aspirert for CA125 deteksjon. Ascites volum i bukhulen ble registrert. Ascites fluid vaske, tumorer dissekert fra bukhulen, og plasma ble alle oppbevart ved -80 ° C for etterfølgende analyse. Kumulativ faktiske volum av ascites samlet inn etter hvert aspirasjon ble beregnet ved å subtrahere 2 ml av det totale volum oppsamlet.
CA125 nivåer i ascitesvæske
Tumor markør nivåer (CA125 Ku /L) i cellen -Gratis ascitesvæske fra én MAb C595, DTX og kombinasjonsbehandlinger (test og kontroll) ble bestemt ved en ELISA-analyse å følge instruksjonene på St George Hospital Biokjemi Laboratories. Konsentrasjonen av CA125 i ascites ble normalisert til selve volumet av ascites samlet inn.
Mus vev og histologi
De tumorvev fra enkelt MAb, DTX, kombinasjon eller kjøretøykontroll-behandlede dyrene var enten umiddelbart snap frosset for frysesnitt eller fiksert i 10% formalin i 24 timer, i parafin blokk for H E farging og immunhistokjemi. Fem mikrometer frosne snitt av friske tumor-prøver ble brukt for CD31 immunofarging. For toksisitetsstudier, ble relevante muse organer som nyrer, lever, hjerte og beinmarg samlet, formalinfiksert og sendt til patologisk undersøkelse (IDEXX Laboratories, Sydney, Australia).
Hematologisk toksisitet og nyrefunksjonen undersøkelse
for å bestemme hematologisk toksisitet, 200 mL av blod i hver mus ble samlet inn K3 EDTA og Z serum gel minicollect rør (Greiner Bio-en, Tyskland) via saphenous venen og Microvette (SARSTEDT, Tyskland) før behandling og 2 og 3 uker etter enkel eller kombinasjon injeksjon. Hematologiske analyser av hvite blodceller (WBC), lymfocytter, røde blodceller (RBC) og trombocytter ble utført. Blod ble oppnådd ved slutten av forsøkene for biokjemisk analyse av serum for renale funksjoner.
Immunhistokjemi
Standard immunoperoxidase prosedyrer ble anvendt for å visualisere MUC1, Ki-67, caspase-3 (aktiv) og PARP-1 (spaltet P85). Kort sagt ble parafinsnitt deparaffinised i xylen, etterfulgt av en gradert serie av alkoholer (100%, 95% og 75%) og re-hydratisert i vann etterfulgt av Tris-bufret.
saltvann (TBS) ( pH 7,5). Objektglass ble deretter neddykket i kokende 0,01 M sitratbuffer (pH 6,0) i 15 minutter for å forbedre antigenet gjenfinning, behandlet med 3% hydrogenperoksyd og deretter inkubert med primære MAb: MUC1 (1:500 fortynning), Ki-67 (01:50 fortynning), caspase-3 (aktiv) (1:100 fortynning) og PARP-1 (spaltet P85) (1:100 fortynning), henholdsvis over natten (o /n) ved 4 ° C. Etter vasking med TBS, ble objektglass inkubert med svin anti-geit, mus, kanin IgG biotinylert sekundært antistoff (1:150 fortynning) i 45 minutter ved romtemperatur (RT), og deretter med avidin /pepperrot peroksidase (HRP) oppløsning (1 :300 fortynning) i 30 minutter ved RT. Seksjonene ble endelig utviklet med 3,3 «diaminobenzidine (DAB) substrat løsning (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia), deretter kontra med hematoksylin; positive celler dukket brun. Slides ble behandlet på en identisk måte, og farget med isotype MAb eller utelatelse av det primære antistoff som en negativ kontroll. Positive kontroller ble valgt avhengig av ulike MAbs, tykktarmskreft vev for MUC1, tunge vev for Ki-67 og DTX-behandlet OVCAR-tre cellelinje for caspase-3 (aktiv) og PARP-1 (spaltet P85).
CD31-farging ble de frosne snitt tint, lufttørket og fiksert i kald aceton i 10 minutter ved RT. Etter en rask lufttørke og vasking med TBS, ble seksjonene inkubert med rotte-anti-mus CD31 MAb (1:100 fortynning) o /n ved 4 ° C. Etter skylling med TBS ble snittene inkubert med kanin anti-rotte-IgG-biotinylert (1:200 fortynning) i 45 minutter, og deretter med konjugert streptavidin /HRP (1:200 fortynning) i ytterligere 30 minutter. Snittene ble utviklet ved hjelp av DAB-løsning (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia), og kontra med hematoksylin. Slides ble behandlet på samme måte, og farget med isotype MAb eller utelatelse av den primære antistoff som negativ kontroll.
TUNEL analyse for apoptotiske celler
in vivo
Apoptose ble vurdert på tumor xenograft vev ved hjelp tunel metoden med TdT-fragEL in situ apoptotisk deteksjon kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Spesifisiteten til TUNEL reaktivitet ble bekreftet med egnet negativ (TdT utelatt fra merking mix) og positive (behandlet HL-60 sklier som tilbys av selskapet) kontrollene. Lysbilder ble undersøkt ved hjelp av en Leica lysmikroskop (Nussloch, Tyskland).
Vurdering av farging
Farging intensitet (0-3) ble vurdert ved hjelp av lysmikroskopi (Leica mikroskop, Tyskland) ved en × 40 mål som – (negativ), + (svak), ++ (moderat), og +++ (sterk). Evaluering av vev farging ble gjort, uavhengig av hverandre, av to erfarne observatører (LW og HMC). Alle prøvene ble scoret blind og et gjennomsnitt på karakterer ble tatt. Hvis uharmoniske resultater ble oppnådd, ble forskjeller løst ved felles gjennomgang og konsultasjon med en tredje observatør, opplevde i immunhistokjemiske patologi.
Statistisk analyse
Alle numeriske data ble uttrykt som gjennomsnittet av verdiene oppnådd , og standardavviket (SD) ble beregnet. Dataene fra behandlede og kontrollgruppene ble sammenlignet ved bruk av to-hale students t-test. Alle
P
verdiene var to-sidig. En måte ANOVA, fulgt av Dunnetfs post hoc test ble utført for å bestemme signifikante forskjeller i gjennomsnittlig muse vektendringer i toksikologiske studier. Overlevelse ble beregnet som antall dager som er gått mellom initiering av behandling og eutanasi, og% overlevende mus var antallet dyr som er igjen i hver gruppe (x 10) ved slutten av hver uke etter initiering av behandling.
P
0,05 ble betraktet som signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 4.00 pakke (GraphPad, San Diego, CA, USA).
Resultater
toksikologisk vurdering av enkelt MAb C595, DTX og kombinasjonsbehandlinger
Single-dose administrasjon av MAb C595 på 1, 5, 10, 15 mg /kg og DTX 3, 5, 7, 10 mg /kg for de første 3 ukene ikke nådde toksisitet endepunkter 70 dager etter behandling (fig. 1A og B). En enkel administrering av kontroll MAb IgG
3 ved 15 og 20 mg /kg for de første 3 ukene nådde ikke toksisitet endepunkter 70 dager etter behandlingen (data ikke vist). Mus behandlet med 20 mg /kg MAb C595 /uke eller 15 mg /kg DTX /uke begynte å gå ned i vekt, og ble avlivet 4 uker etter behandling på grunn av tegn på stress; histopatologisk undersøkelse indikerte mild nefropati i disse gruppene. Resultatene tyder på at MTD for enkeltdose MAb C595 ligger mellom 15 og 20 mg /kg, mens MTD for en enkelt administrasjon av DTX ligger mellom 10 og 15 mg /kg.
Gjennomsnittlig prosent vekt endringer sammenlignet med dagen 0 (dvs. dag singel eller kombinasjon administrasjon). A. Dose-toleranse forhold hos mus ved enkelt MAb C595. ▪: MAb C595 (1 mg /kg); ▴: MAb C595 (5 mg /kg); ▾: Mab C595 (10 mg /kg); ♦: MAb C595 (15 mg /kg); •: MAb C595 (20 mg /kg). Den signifikant forskjell ble funnet mellom 20 mg /kg av MAb C595-behandlede gruppen og andre MAb C595-behandlede grupper (5-15 mg /kg) (
P
0,05). B. Dose-toleranse forhold i mus ved enkelt DTX. ▪: DTX (3 mg /kg); ▴: DTX (5 mg /kg); ▾: DTX (7 mg /kg); ♦: DTX (10 mg /kg); •: DTX (15 mg /kg). Den signifikant forskjell ble funnet mellom 15 mg /kg av DTX-behandlede gruppen og andre DTX-behandlede grupper (5-15 mg /kg) (
P
0,05). C. Dose-toleranse forhold i mus ved kombinasjon test [MAb C595 (5 mg /kg) + DTX (3-10 mg /kg)]. ▪: MAb C595 + DTX (3 mg /kg); ▴: MAb C595 + DTX (5 mg /kg); ▾: MAb C595 + DTX (7 mg /kg); ♦: MAb C595 + DTX (10 mg /kg). D. Dose-toleranse forhold i mus ved kombinasjon kontroll [MAb IgG
3 kontrollen (5 mg /kg) + DTX (3-10 mg /kg)]. ▪: MAb IgG
3 + DTX (3 mg /kg); ▴: MAb IgG
3 + DTX (5 mg /kg); ▾: MAb IgG
3 + DTX (7 mg /kg); ♦: MAb IgG
3 + DTX (10 mg /kg). Poeng, mener (n = 5 i hver gruppe); bar, SD.
For kombinasjonsbehandlingene, har vi brukt 1/3 MTD Mab C595 (dvs. 5 mg /kg) som en test og 5 mg /kg av negativ MAb IgG3 som en kontroll kombinert med en rekke DTX (1~10 mg /kg) for ytterligere å vurdere toksisiteten til kombinasjonsbehandlinger. Ingen toksisitet ble funnet i kombinasjonsbehandlingene (fig. 1C og D). Det var ingen makroskopiske tegn på kronisk toksisitet til viktige organer for noen mus. Leukocyttverdiene var deprimert i perifert blod hos behandlede mus på 2 uker etter injeksjon, med utvinning oppstår etter 4 uker og normal hematologi ble sett på 70 dager. Disse resultatene tyder på at kombinasjonsbehandling med MAb C595 og DTX eller med kontroll MAb IgG
3 og DTX kan trygt brukes i dyremodeller for å studere effekten.
Effekt av enkelt MAb C595 og DTX på tumorvekstinhibitering og ascites produksjon
Vi først sammenlignet antitumor aktivitet av enkelt MAb C595, MAb IgG
3 kontroll, single DTX og kjøretøy kontroll (HPMC) følgende utvikling av ascites og innledende aspirasjon i 3 uker. Kumulative volum av ascites fluid som produseres per dyr er vist i fig. 2A. mus vehikkelbehandlede fortsatte å produsere ascites ved en hyppigere hastighet og måtte bli aspirert gjentatte ganger i løpet av behandlingen (28 dager), mens Mab C595-behandlede mus produserte mindre ascites relatert til dose av MAb C595 (4 ± 1 mL HD og 5 ± 1 ml for LD, henholdsvis) sammenlignet med MAb IgG3 kontrollmusene (7 ± 2 ml) (fig. 2A). DTX-behandlede mus utviklet ascites langsomt sammenlignet med HPMC kontroll (6 ± 1 ml), og produksjon av ascites var relatert med dosen av DTX (2 ± 1 ml for HD og 4 ± 1 ml for LD, henholdsvis) (Fig. 2A ). Den HD av DTX (10 mg /kg) betydelig redusert utvikling av ascites (P . 0.05, figur 2A). I tillegg til ascites produksjon, evaluerte vi også den totale tumorvektendring i hver gruppe ved slutten av forsøket (4 uker etter behandling). tumorvektforandringer den er i samsvar med endringen av ascites produksjon (fig. 2B). Enkelt MAb C595 bare delvis hemmet veksten av ovčar-3 svulster, som gjenspeiles av tumorvekt på 380 ± 80 mg i LD (5 mg /kg) og 260 ± 76 mg i HD (150 mg /kg) versus 560 ± 77 mg hos mus som fikk negativ MAb IgG3 kontroll (15 mg /kg) (P 0,05), henholdsvis mens enkelt DTX åpenbart hemmet veksten av OVCAR-3 svulster, som gjenspeiles av tumorvekt på 230 ± 66 mg i LD (5 mg /kg ) og 75 ± 14 mg i HD-10 (mg /kg) versus 540 ± 96 mg i mus som mottok det samme volum av HPMC (P 0,05), henholdsvis (figur 2B).. Disse resultatene tyder på at både Mab C595 og DTX kan indusere regresjon av OVCAR-3-tumorvekst i en doseavhengig måte, og at anti-tumor aktiviteten til DTX er mer effektiv enn den av MAb C595.
Etter eutanasi bukhulen til hver mus ble vasket med 2 ml normal saltløsning, og etter aspirasjon, ble volumet av ascites liggende registrert. A. Kumulative volumer av ascites samlet opp fra hvert dyr fra behandlingsstart [Mab C595 (H og L), MAb IgG
3, DTX (H og L) er vist. Den åpenbare forskjellen ble sett mellom DTX (H) -behandlet gruppe og andre gruppen behandlet (
P
0,05). B. Tumorvekter (mg) ved slutten av forsøkene etter enkelt MAb C595, MAb IgG
3, DTX eller kjøretøyets behandlinger med forskjellige doser. Svulsten veie var åpenbart lavere i MAb-behandlede og DTX-behandlede grupper sammenlignet med MAbIgG
3-behandlet og HPMC behandlede kontrollgruppene (
P
0,05). C. Effekt av enkelt MAb C595, MAb IgG
3, DTX eller kjøretøy på undertrykke økningen i tumor markør CA125 (CA125 Ku /L) i ascitesvæsken (peritoneal vask) ved slutten av forsøkene. Nivået på ca125 var åpenbart lavere i MAb C595 (H) behandlede og DTX-behandlede grupper sammenlignet med MAbIgG
3-behandlet og HPMC behandlede kontrollgruppene (
P
0,05). H: høy dose; L: lav dose. Representative kurver er vist.
Effekt av kombinasjonen av MAb C595 og DTX på tumorvekst, ascites produksjon og overlevelse
Vi deretter sammenlignet antitumoraktivitet av kombinasjonen av 1/3 MTD Mab C595 (5 mg /kg) eller kontroll MAb IgG
3 (5 mg /kg) med en dose DTX (10 mg /kg) etter utvikling av ascites og innledende aspirasjon i 3 uker. Kombinasjonen test (5 mg /kg MAb C595 og 10 mg /kg DTX) kunne hemme utvikling av ascites sammenlignet med kombinasjonen kontroll (5 mg /kg MAb IgG3 og 10 mg /kg DTX) og bærerkontrollen (fig. 3A) . Mønsteret for ascites produksjon i kombinasjonen kontrollgruppen er lik den som ses for en enkelt 10 mg /kg DTX-behandling som beskrevet ovenfor. Kumulative volum av ascites fluid produsert pr dyr er presentert for kombinasjon prøve (0,4 ± 0,2 ml), kombinert kontroll (2 ± 1 ml) og bærerkontrollen (7 ± 2 ml) i fig. 3B (P 0,05). Fire uker etter behandling, Bad prøvebehandling i betydelig grad hemmet veksten av OVCAR-3 svulster, som gjenspeiles av tumorvekt på 15 ± 11 mg versus 65 ± 16 mg i kombinasjon kontrollgruppen og 560 ± 100 mg i bærerkontrollgruppen (P 0,05). (Fig. 4C)
A. På slutten av forsøkene, er ingen åpenbare tegn på ascites dannelse sett i kombinasjon test (5 mg /kg Mab C595 + 10 mg /kg DTX) -behandlet mus (a); tegn på ascites dannelse ble funnet i kombinasjon kontroll (5 mg /kg Mab C595 + 10 mg /kg DTX) -behandlet mus (b); åpenbare tegn på ascites dannelse ble funnet i kjøretøy (1/2 saltoppløsning + 1/2 HPMC) -behandlet mus (c). B. De kumulative ascites volumer fra kombinasjonen test, kombinert kontroll eller kjøretøy-behandlede mus er vist (
P
0,05). C. Effekt av kombinasjonen test, kontroll eller kombinasjoner kjøretøy på undertrykke økning i tumor markør nivå (CA 125 Ku /L) i ascitesvæsken (peritoneal vask) ved slutten av forsøkene (
P
0,05 ). Representant bilde og grafer vises.
A. Tumorvekt endres ved slutten av forsøkene etter kombinasjon testen, kombinert kontroll kjøretøy eller behandlinger med forskjellige doser (
P
0,05). B. tumorvolum i kombinasjon test-behandlede mus var signifikant lavere enn i kjøretøykontroll-behandlede mus (
P
0,01). C. For alle dyrene, den ønskede varigheten av behandlingen var 4 uker. Mus (10 per gruppe) ble avlivet om grunn av dårlig helse, de var ventet å bli døende i løpet av kort tid. Overlevelse ble beregnet som antall dager som er gått mellom initiering av behandling og eutanasi, og% overlevende mus var antallet dyr som er igjen i hver gruppe (x 10) ved slutten av hver uke etter initiering av behandling. Overlevelse av dyrene i kombinasjon testgruppen var mye bedre enn det i kombinasjonen kontrollgruppen eller bærer gruppen (
P
0,05). Representative bilder og graf vises.
Enkelt eller kombinasjonsbehandling påvirker svulst markør CA125 nivåer
På slutten av eksperimenter, endring i gjennomsnittlig CA125 nivåer for enkelt MAb C595 i LD var ikke signifikant forskjellig i forhold til MAb IgG
3 kontroll, mens endringen i gjennomsnittlig CA125 nivåer for enkelt CA125 i HD eller enkelt DTX var tydeligvis annerledes i forhold til MAb IgG
3 eller HPMC kontroll, henholdsvis (
P
. 0,05) (figur 2C). Det er tydelig at kombinasjonen testgruppen var signifikant inhiberte CA125-nivåer sammenlignet med kombinasjonen kontrollgruppen (
P
0,05) eller bærer kontrollgruppe (
P
0,01) (fig. 3C). Ved eutanasi, de CA125 kjøretøy verdiene var 68 000 ± 12 000 Ku /L, i forhold til kombinasjonen test og kontroll kombinasjon av 14 030 ± 5022 Ku /l og 28 306 ± 11 403 Ku /L, henholdsvis. Reduksjonen i cellefrie ascitesvæske CA125 nivåer er i overensstemmelse med reduksjonen i ascites volum og tumorvekten.
Histologiske forandringer i tumorxenografter etter kombinasjonsbehandling
Å sammenligne histologi i hver gruppe, vi høstet svulster fra kombinasjonsbehandlede, MAb C595 kontrollbehandlede og kjøretøykontroll-behandlede mus ved slutten av forsøkene og farget parafinsnitt med H E.
