Abstract
Lungekreft er blant de mest dødelige kreftformer med høy metastase og tilbakefall. Nyere studier tyder på at svulster inneholder en undergruppe av stilk-lignende kreftceller som innehar visse stamcelleegenskaper. Heri brukte vi Hoechst 33342 fargestoff effluks-analyse og flow-cytometri for å isolere og karakterisere side populasjonen (SP) celler fra human lunge-cancercellelinje NCI-H460 (H460). Vi viser at H460 SP-celler havn stilk-lignende celler som de kan lett danne forankringsuavhengig flytende sfærer, har stort potensiale proliferativ, og utviser forbedret tumorigenisitet. Viktigst, H460 SP cellene var i stand til å fornye seg selv både in vitro og in vivo. Til slutt viser vi at H460 SP celler fortrinnsvis uttrykke ABCG2 samt SMO, en kritisk formidler av the Hedgehog (HH) signal-, som synes å spille en viktig rolle i H460 lungekreftceller som sin blokkering ved hjelp Cyclopamine sterkt hemmer cellesyklus progresjon. Samlet våre resultater låne ytterligere støtte til eksistensen av lungekreft stamceller og også implisere HH signalering i å regulere stor celle lungekreft (stem) celler
Citation. Shi Y, Fu X, Hua Y, Han Y, Lu Y, Wang J (2012) The Side Befolkning i human Lung Cancer Cell linje NCI-H460 er rikt på Stem-Like kreftceller. PLoS ONE 7 (3): e33358. doi: 10,1371 /journal.pone.0033358
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 08.09.2011; Godkjent: 07.02.2012; Publisert: 13 mars 2012
Copyright: © 2012 Shi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av hovedprosjektet fond av Shanghai Science and Technology Association, Kina (Grant No.05119554). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det har lenge vært forstått at de fleste tumorer er heterogene inneholdende et spektrum av fenotypisk forskjellige celletyper. Arbeid i det siste tiåret viser at ulike menneskelige solide svulster inneholder også funksjonelt avvikende tumorceller med subpopulasjoner possesing høy karsinogent potensial og å kunne rekonstruere den fenotypiske og histologisk heterogenitet av den overordnede svulst når transplantert i immunsvikt mus. Slike undergrupper av kreftceller som har forbedret tumorigent kapasitet har blitt operativt kalt tumor-initiering celler eller kreft stamceller (CSC), som nå har blitt rapportert i de fleste solide svulster [1], [2]. De fleste cscs har blitt identifisert, beriket og renset ved hjelp av enten celleoverflaten markør (s), blant annet CD44 og CD133 er de mest populære, eller funksjonelle analyser, som inkluderer side befolkningen (SP) [3] – [6] og Aldeflour analyser [7], [8]. SP strategien ble opprinnelig utviklet for å berike hematopoetiske stamceller [3], og er basert på evnen av stamceller, som overuttrykker avgiftcelleoverflate pumper ABCG2 og MDR1 (dvs. P-glykoprotein), for å effektivt efflux celle-gjennomtrengelige fargestoff Hoechst 33342 og følgelig på dual bølgelengde FACS komplott for å presentere som en Hoechst-negativ befolknings på «side» (eller på halen). Den Aldeflour assay, på den annen side, utnyttet stamceller som overuttrykker avgiftende enzymer aldehyd- dehydrogenaser (ALDH) [7], [8] og derfor CSC-anrikede populasjon kan mer effektivt forbrenne en eksperimentell ALDH substrat for å frigjøre mer fluoroforen.
Lungekreft er den mest dødelige maligancy verden. Arbeidet i de siste årene viser at både små-celle (SCLC) og ikke-småcellet (NSCLC) lungekreft inneholde stilk-lignende kreftceller [9] – [29]. Som i de fleste andre svulster, «lunge cscs «har blitt beriket og renset ved hjelp av celleoverflatemarkører CD44 eller CD133 eller bruker de to funksjonelle analyser som er nevnt ovenfor. Disse lunge cscs er blitt demonstrert å inneha høy klonal, klonogene, og ofte, karsinogent potensial og for å være generelt motstandsdyktig mot terapeutiske behandlinger. De lungekreft stamceller har blitt rapportert i langsiktige kulturer så vel som i xenotransplantater og primærpasient svulster. Av interesse, en fersk studie ved hjelp av genetiske musemodeller av lungekreft viser at lungesvulster med ulike genetiske bakgrunn har forskjellige CSC fenotyper [30], øke muligheten for at ulike pasientlungesvulster kan ha ulike CSC fenotyper. Selv om SP teknikken har blitt anvendt for å demonstrere cscs i flere lungecancer-cellelinjer [10], [11], [13], [25], er det ikke kjent hvorvidt alle pasienttumoravledet lungecancer cellelinjer har en SP som er anriket på stammen lignende kreftceller. Her vi videre ta opp dette spørsmålet ved hjelp av menneskelig storcelle stor carcinoma linje NCI-H460 (H460) og våre resultater viser at H460-celler har en SP som er beriket i tumor initiere celler. Diskusjon
Resultater og
dyrkede humane lungekreft cellelinje NCI-H460 har en SP
Vi først farget H460 celler med Hoechst 33342, som er aktivt ekstrudert av verapamil følsomme ABC transportører på stamceller [3]. Når vi observerte de fargede cellene under et fluorescensmikroskop, de fleste av kjerner, som forventet, viste blå; imidlertid et lite antall kjerner var negative for Hoechst farging (figur 1, A og B;. pilene peker til en Hoechst-negative celle). Vi deretter kvantifisert SP ved dobbelt bølgelengde flowcytometri [3] – [6], [10], [11], [13], [25]. Vi oppdaget, i flere uavhengige H460 kulturer, en SP på 3,80 ± 0,5% (n = 9), som vist på fig. 1C. Viktigere, SP var fullstendig eliminert i nærvær av verapamil (Fig. 1D), en kalsiumkanalblokker og en spesifikk hemmer av ABCG2 og MDR1 brukes i den kliniske behandling av lungekreft [31], noe som indikerer spesifisiteten av SP vi påvist i H460 celler.
A-B, Hoechst farging av H460 celler. Legg merke til at selv om de fleste av cellene ble farget i kjernen, noen celler (indikert ved piler) tilsynelatende manglet atom Hoechst farging. C-D, SP fenotyper i fravær (C) eller nærvær (D) av verapamil.
SP celler demonstrere høy proliferativ potensial og kan selv fornye
Inntil nå har de fleste stilk-lignende celler har vist seg å ha en evne til å danne fritt-flytende kuler i forankringsuavhengig betingelser [4] – [6], [10], [11], [13]. Videre cscs har blitt rapportert å ha en høy proliferativ potensial. For å avgjøre om de H460 SP cellene har lignende CSC-tilknyttede egenskaper, må vi først dyrket rensede SP og ikke-SP celler i serumfritt tilstand (se Methods). Vi har observert at H460 SP-cellene dannet typiske flytende kuler med en effektivitet på 4,8 ± 0,1% (fig. 2A), mens de ikke-SP-celler viste for det meste heftende vekstmønster (fig. 2B) med mye lavere sfære dannende kapasitet (0,8 ± 0,3%). CCK-8 spredning eksperiment (se metode) viste også høyere proliferativ potensial i SP-cellene sammenlignet med de ikke-SP-celler (Fig. 2C). Når de primære SP-celle-avledede sfærer ble dissosiert og passaged, de lett dannes sekundære kuler (data ikke vist). Når dissosierte primære SP sfærer ble dyrket i fullstendig medium inneholdende bovint serum (FBS) føtalt i én uke, ble nye SP-celler (6,2 ± 0,8%) detektert med de fleste cellene er ikke-SP-celler (fig. 3A). Igjen, SP fenotypen ble fullstendig blokkert, i nærvær av verapamil (Fig. 3B). Disse resultatene tyder på at SP-celler kan fornye seg selv
in vitro
.
A-B, renset SP og ikke-SP-celler ble dyrket i serumfritt medium i forankringsuavhengig betingelser. De SP-celler dannes typiske flytende kuler i løpet av 4 dager (A), mens de ikke-SP-celler i stor grad er etablert heftende vekst (B). C, SP celler vises høyere proliferativ evne enn ikke-SP celler som bestemmes av CCK-8 kit (
P
0,05 for alle tidspunkter, Student
t
-test).
A-B, SP re-analyse når SP sfærene ble skilt ut og dissosierte celler dyrket i normalt serum-inneholdende medium i en uke. C-D, SP re-analyse i SP-celle-avledede tumorer. E-F, SP re-analyse i ikke-SP-celle-avledede tumorer. A, C, E, uten verapamil. B, D, F, med verapamil.
De H460 SP celler demonstrere høyere tumorigenicity enn tilsvarende ikke-SP celler
Gullstandarden for å analysere CSC egenskaper er å utføre begrensende fortynning tumortransplantasjonsforsøk [1], [2] og å sammenligne tumorigenisitet, vanligvis målt ved tumor forekomst, latens (dvs. tiden mellom tumorcelle implantasjon til når tumorer kan først palperes), vekstrate (dvs. tumorvolum), og endepunktet svulst vekt. Vi renset H460 SP og ikke-SP-celler og injiseres økende antall celler i Matrigel subkutant (s.c) inn i nonobese diabetisk /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus (fig. 4A). Vi fant at SP cellene samlet viste høyere tumorigenicity enn ikke-SP celler. For eksempel, SP-cellene regenerert tumorer ved den laveste celletall (dvs. 5000) implantert, mens de ikke-SP-celler har ikke regenerere en hvilken som helst tumor i denne cellen dose (fig. 4A). De SP cellene regenereres 6/6 tumorer (dvs. 100%), mens de ikke-SP celler ga opphav til 4/6 svulster (67%;
P
= 0,039, Chi-Square tester). I tillegg SP-celler etablerte tumorer med en kortere tidsforsinkelse enn de tilsvarende ikke-SP-celler (figur 4A;.
P
= 0,007). Videre H460 SP-celle-avledede tumorer vokste hurtigere fører til mye større svulster enn ikke-SP-celle avledet tumorer (figur 4A-C;.
P
0,01). Histologisk regenerert xenograft tumorer hadde morfologiske egenskaper av de høy-småcellet lungekreft. Spesielt SP tumorene viste overflod av celler og mitotiske figurer og viste tydelig kapsel invasjon (fig. 4D, venstre). I motsetning til de ikke-SP tumorer oppviste mer nekrotiske områder (fig. 4D, til høyre).
A, Tabell presentasjon av karsinogent potensial av H460 SP og ikke-SP-celler. Tre parametre for tumorigenicity, dvs. svulst forekomst, ventetid, og volum (*
P
0,01) ble vist. Alle dyrene ble avsluttet (term.) 28 dager etter implantasjon. B, SP cellene regenereres større svulster enn tilsvarende ikke-SP celler på hver celle dose. C, Bruttokreft bilder når svulster ble høstet på dag 28 etter subkutan injeksjon av SP og ikke-SP-celler i NOD /SCID-mus. D, representant HE-farget photomicrographs av SP og ikke-SP svulster.
Det var overraskende og potensielt interessant at de ikke-SP celler, på 50 000 og 100 000, også regenerert svulster selv om svulstene var mindre (fig. 4B-C). Siden de ikke-SP-celler ikke dannet tumorer ved 5000 celler (fig. 4A), vil den enkleste forklaringen være at den ikke-SP-cellepopulasjonen kan være forurenset med et lite antall av SP-celler, noe som ville gi opphav til svulster når store antall av ikke-SP-celler ble implantert. Alternativt kan ikke-SP-celler være i stand til å «de-differentiate «tilbake til SP-celler ved en lav hastighet slik at in vivo noen ikke-SP-celler ble omdannet til SP-celler, som deretter ga opphav til svulster. Denne siste tilfellet ble nylig demonstrert ved andre i en rekke dyrkede tumorcelle systemer [32]. For å begynne å utforske de ulike mulighetene, analyserte vi SP sammensetning i både SP og ikke-SP celle avledet H460 svulster. Vi har observert at SP tumorer inneholdt 8,4 ± 0,6% SP-celler (fig. 3C-D), mens de ikke-SP tumorer inneholdt 1,4 ± 0,2% SP-celler (Fig. 3E-F). Selv om disse resultatene ikke kan definitivt skille forurensning fra konvertering, gjorde de gir en forklaring på hvorfor de ikke-SP celler fortsatt ga opphav til svulster – det var fordi de ikke-SP svulster inneholdt SP celler
Den stamcelle. markører ABCG2 og SMO er høyt uttrykt i SP celler
SP fenotype blodkreft stamceller medieres primært av ABCG2 med noen involvering av MDR1 eller multi-drug resistance protein 1 [31]. Mange CSC-beriket SP overuttrykker ABCG2 [4], [6]. Vi analyserte derfor ABCG2 mRNA-nivåer og observert at, sammenlignet med vanlige FBS-dyrkede monolag H460-celler (Fig. 5A, spor 1), begge kuler (fig. 5A, felt 2) og renset SP-celler (Fig. 5A, spor 3) uttrykt betydelig økt ABCG2 mRNA nivåer, mens renset ikke-SP H460 celler nesten manglet ABCG2 uttrykk (fig. 5A, spor 4). Likeledes SP tumorer (Fig. 5A, spor 7) også uttrykkes høyere nivåer av ABCG2 enn tilsvarende ikke-SP tumorer (fig. 5A, spor 8). En kvantitativ presentasjon er vist i fig. 5B.
A, Representant RT-PCR gel bilder. M, men da; spor 1, NCI-H460-celler vanligvis dyrket i serumholdig medium; lane 2, H460 sfærer; kjørefelt 3, renset SP celler; kjørefelt 4, renset ikke-SP celler; felt 5, den Tomatidine kontrollgruppen; felt 6, den Cyclopamine eksperimentelle gruppe; lane 7, SP svulster; lane 8, ikke-SP tumorer. B, Kvantitativ presentasjon av ABCG2 og SMO mRNA nivåer som bestemmes av densitometry (
P
0,001, bortsett ABCG2 mRNA kjørefelt 6 vs. kjørefelt 8 og SMO mRNA kjørefelt 1 vs spor 5 og felt 4 vs. lane 6).
Svulstfremkalllungekreftceller inkludert SP-celler har blitt vist å preferensielt å uttrykke selvfornyelse molekyler slik som Oct-4, Nanog, BMI-1 og c-kit [14], [ ,,,0],16], [17], [22], [29], Notch signalkomponentene [18], [28], og Wnt /β-catenin [23]. Emerging bevis tyder på at the Hedgehog (HH) signalveien kan også være nært involvert i lungekreft utvikling og progresjon [33], [34]. Aktivering av HH signale krever trans protein glattes (SMO) som en kritisk formidler av HH signale [35] og ABCG2 kan opptre i oppstrøms regulering av Hh signalveien for å beskytte stemness av SP rommet [36]. Vi har fastslått derfor mRNA-nivåene av SMO i det samme settet av prøver som ble anvendt for ABCG2 analyse. Påfallende, veldig mye som ABCG2, de SMO mRNA nivåer ble signifikant forhøyet i H460 kuler, SP celler og SP celle-stammer tumorer (Fig. 5A-B). Så vidt vi vet, kan dette funnet representerer den aller første til å lenke SMO overekspresjon til CSC-beriket lungekreftceller.
Den SMO inhibitor Cyclopamine hemmer H460 celleproliferasjon
HH signalveien har vært innblandet i opprettholdelse av stilk eller progenitorceller i mange voksne vev. Denne veien regulerer celleproliferering, vev polaritet, og celledifferensiering under normal utvikling. Viktigere, unormal HH sti-aktivering, slik som høye nivåer av ekspresjon SMO, kan spille en rolle i opprettholdelsen av kapasiteten av tumor stamceller, favoriserer selvfornyelse, og spredning av deres avkom [36], [37]. For å avgjøre om HH signalering spiller en rolle i H460 celler, ansatt vi Cyclopamine, en steroid alkaloid som hemmer SMO aktivitet. Som en kontroll for Cyclopamine, brukte vi et strukturelt relatert alkaloid, Tomatidine, som ikke påvirker SMO aktivitet og HH signalering. Sammenlignet med Tomatidine, Cyclopamine ut til å redusere den lave endogene nivåer av SMO-mRNA (fig. 5A, kolonnene 5 og 6). Sammenlignet med bæremiddelkontroll og Tomatidine gruppe, Cyclopamine dose- og tidsavhengig hemmet veksten av H460-celler når de anvendes ved 2-40 umol /L (fig. 6A-E). Cellesyklus-analyse viste at Cyclopamine, ved 20 umol /L, tidsavhengig forårsaket H460-celler for å arrestere i G1 /S-fasen av cellesyklusen (fig. 6F). Nærmere bestemt, Cyclopamine behandling økte G1 cellene fra ~71% ved 24 timer til ~93% etter 96 timer, mens minsket S-faseceller fra 18% ved 24 timer til 2% ved 96 timer (fig. 6F). Ved 96 h, noe økt apoptose (dvs. ca. 2%) ble også observert (fig. 6F). Det bør bemerkes at både kjøretøy og Tomatidine kontrollgrupper viste også tidsavhengige økninger i G1-faseceller og tidsrelaterte fall i S-fase-celler (fig. 6F), sannsynlig på grunn av det faktum at alle cellene ble dyrket i opptil 96 h uten påfyll av media. Derfor konsumpsjon av vekstfaktorer og næringsstoffer forårsaket delvis cellesyklus-stans i kontrollgruppene. Sammen utgjør disse resultater viser at den TT-signalering er avgjørende i H460-celler og blokkering av signalisering HH dramatisk forårsaker cellesyklus-stans. Siden SMO fortrinnsvis uttrykt i CSC-beriket SP og kuler (Fig. 5), anta vi at HH signale pålegger dens virkninger sannsynlig på lunge cscs.
A-C, Representasjons photomicrographs av H460 celler 72 timer etter behandling med bærerkontroll (A), Tomatidine (B), eller Cyclopamine (C). Originale maginifications: × 200. D, Cyclopamine doseavhengig hemmet H460 celleproliferasjon (
P
0,05; enveis ANOVA). E, Tid løpet av Cyclopamine hemming av H460-celler (
P
0,05, enveis ANOVA). Cyclopamine ble anvendt ved 20 umol /l. F, Effekter av Cyclopamine på cellesyklus av H460-celler.
I sammendraget, i denne studien presenterer vi bevis på at H460 human stor-celle lunge karsinom cellelinje inneholder en påvisbar SP. Videre viser vi at H460 SP-celler havn stilk-lignende celler som de kan lett danne forankringsuavhengig flytende sfærer, har stort potensiale proliferativ, og utviser forbedret tumor-regenererende kapasitet. Viktigere, H460 SP-celler synes å være i stand til å fornye seg selv in vitro (dokumentert ved replating sfæriske celler i vanlig dyrkningsmedium, Fig. 3A) og in vivo (dokumentert av SP tumorer inneholdende en liten prosentandel av SP-celler med fleste være ikke-SP celler, fig. 3C). Til slutt viser vi at H460 SP-cellene uttrykker fortrinnsvis ABCG2 samt SMO, en kritisk formidler av den HH signalering, noe som synes å spille en viktig rolle i H460-lungekreftceller som dens blokkering ved hjelp av Cyclopamine sterkt inhiberer cellesyklus-progresjon. Kollektivt, våre resultater gir ytterligere støtte til nærværet av stammen lignende kreftceller dyrket i lungecancercellelinjer og også implisere HH signalering ved regulering av stor-celle lungekreft (stilk) celler.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
Alle forsøkene ble utført i henhold til de institusjonelle etiske retningslinjene. Alle dyrerelaterte studier ble godkjent av Tongji University Institutional IACUC komiteen. NOD /SCID mus (tillatelsen Nummer: SYXK20070005) på SPF nivå ble brukt for tumorcelle implantasjon eksperimenter i denne studien. Alle andre studier som presenteres her ble etterforsker initiert og ikke krever godkjenning fra andre kontrollorganer.
Cellelinjer og dyr
Menneske stor celle lungekreft cellelinje NCI-H460 ble kjøpt fra Shanghai Institute for Biological Sciences, CAS (Shanghai, Kina) og opprettholdt i medium anbefalt av ATCC. Alle medier ble supplert med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen-Life Technologies). Celler ble inkubert i en fuktet inkubator ved 37 ° C som følger med 5% CO2. Celler ble rutinemessig opprettholdt i 75-cm
2 vevskulturflasker (Corning Incorporated, USA) og høstes ved hjelp av 0,25% trypsin da de var i logaritmisk vekstfase for SP-analyse. Den nonobese diabetiker /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus ble kjøpt fra Shanghai SLAC Forsøksdyr Co Ltd
SP analyse
Den grunnleggende protokollen ble basert på Goodell et al [3 ]. Kort fortalt ble NCI-H460-celler resuspendert ved 1 x 10
6 /ml i forvarmet DMEM (Invitrogen-Life Technologies). Hoechst 33342 fargestoff ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml i nærvær eller fravær av verepamil (50 umol /l; Sigma) og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 90 minutter med periodevis rysting. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene vasket med iskald HBSS (Invitrogen-Life Technologies), sentrifugert ned ved 4 ° C og resuspendert i iskald HBSS. Propidiumjodid (Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 2 ug /ml ble tilsatt til cellene til portlevedyktige celler. Celle Preparatene ble filtrert gjennom en 40-mikrometer celle sil for å oppnå enkel cellesuspensjon. Flowcytometrisk analyse og sortering ble utført på en Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS, Beckman Coulter Epics Altra).
tumorcelle implantasjon eksperimenter
FACS-rensede SP og ikke-SP H460 celler ble mixted med Matrigel (Becton Dickinson), og deretter subkutant (sc) injisert inn i NOD /SCID-mus. Grupper av mus ble inokulert med SP celler eller ikke-SP celler på 5 × 10
3, 5 × 10
4 og 1 x 10
5, henholdsvis. Tumorveksten ble undersøkt på en daglig basis og individuelle tumorvolum ble målt ved hjelp av et digitalt skyvelære og tilnærmet i henhold til formelen V = 1 /2ab
2 (a er den lengste diameter og b den korte diameter av tumoren). På slutten av forsøkene ble mus avlivet etter 4 uker og tumorer høstet, måles, og fotografert. De indre organer som lunge og lever ble nøye observert for metastase knuter og tumorsnitt ble gransket under mikroskopet. Til slutt, svulster ble også fordøyd å lage encellet suspensjon SP re-analyse.
Sphere formasjons analyser i serum-frie kulturer
SP og ikke-SP celler ble dyrket i serum- fritt DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies), supplert med 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF), 10 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), 5 ug /ml insulin (alt fra Sigma). -Celler (1000 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners kulturskåler i 200 ul vekstmedium og 20 ul av medium per brønn ble tilsatt hver 2 dager. Det antall sfærer (Φ 150 um) for hver brønn ble bestemt etter 5 dagers dyrking
RT-PCR-analyse
Cellene ble høstet og total RNA ble ekstrahert og forberedt for RT. PCR ved hjelp av en PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara, Kyoto, Japan). Syklusparametrene for ABCG2, SMO, og GAPDH cDNA var 30 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 58 ° C (for ABCG2 og GAPDH) eller 55 ° C (for SMO), og 45 sek ved 72 ° C i 35 sykluser, henholdsvis. De primere for RT-PCR var som følger: ABCG2 (F) 5′-CACCTTATTGGCCTCAGGAA-3 «, ABCG2 (R) 5′-CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3′, SMO (F) 5»-TTACCTTCAGCTGCCACTTCTACG-3 «, SMO (R) 5»-GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC-3 «, GAPDH (F) 5′-ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3′, og GAPDH (R) 5»-GGTCTACATGGCAACTGTGA-3 «.
celleproliferasjonsanalyse
Celleproliferasjon analysene ble utført ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan). Celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved 5 x 10
4 celler per brønn og dyrket i vekstmediet. Cyclopamine og Tomatidine (alle fra Sigma) ble tilsatt henholdsvis i en konsentrasjon på 20 umol /L og passende vekstmedium ble tilsatt i kontrollprøvene. CCK-8 ble tilsatt i hver brønn ved 24, 48, 72 og 96 h, og etter en ytterligere 4-timers kultur, absorbansen av hver brønn ble bestemt og vekstkurve ble plottet. De celle-syklus profiler ble analysert ved flowcytometri.
Statistisk analyse
Data ble vanligvis presentert som gjennomsnitt ± SD og statistiske forskjeller mellom forsøksgruppene ble analysert ved Student
t-
test, enveis ANOVA, eller lineær regresjon ved hjelp av statistisk programvare SPSS11.5 og i henhold til innholdet i dataanalysen. En
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant i alle tilfeller
Takk
Vi er takknemlige til Dr. Guoping Zhang (fra Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai, Kina) for å få hjelp med flowcytometri målinger.
