Abstract
Contactin-1 har vist seg å fremme kreft metastasering. Men de underliggende mekanismene fortsatt uklare. Vi rapporterer her at knockdown av contactin-1 i A549 lungekreftceller reduserte A549 celleinvasjon og cellenes evne til å vokse i myk agar uten at det påvirker celleproliferasjon. Reduksjon av contactin-1 resulterte i oppregulering av E-cadherin, i samsvar med E-cadherin å være hindrende for kreftcelle invasjon. I et forsøk på å undersøke mekanismene hvorved contactin-1 reduserer E-cadherin ekspresjon, observerte vi at contactin-1 spiller en rolle i AKT aktivering, som knockdown av contactin-en svekket AKT aktivering. I tillegg, hemming av AKT-aktivering betydelig forbedret E-cadherin uttrykk, en observasjon som etterligner den situasjonen observert i contactin-1 knockdown, hvilket antyder at aktivering av AKT spiller en rolle i contactin-1-mediert nedregulering av E-cadherin. I tillegg var vi i stand til å vise at knockdown av contactin-en ikke ytterligere redusere A549 celle invasjon evne, da AKT aktivering ble hemmet av en AKT inhibitor. For ytterligere å støtte våre funn, overexpressed vi Cntn-en i to Cntn-en null brystkreft cellelinjer som uttrykker E-cadherin. Ved overekspresjon, Cntn-en redusert E-cadherin nivåer i en cellelinje og økt AKT aktivering i den andre. Videre i vår studie av 63 primære lunge kreft, observerte vi 65% av primærlungekrefttilfellene blir contactin-en positiv og i disse karsinom, 61% var E-cadherin negative. Kollektivt gir vi bevis for at contactin-1 spiller en rolle i den nedregulering av E-cadherin i lungekreft og som AKT aktivering bidrar til denne prosess. I en studie av mekanismene som er ansvarlig for contactin-en for å aktivere AKT, viste vi at knockdown av Cntn-1 i A549 cellene ikke forbedre PTEN uttrykk, men oppregulert PHLPP2, en fosfatase som dephosphorylates AKT. Disse observasjonene dermed antyder at contactin-en øker AKT aktivering delvis ved å hindre PHLPP2-mediert AKT dephosphrorylation
Citation. Yan J, Wong N, Hung C, Chen WX-Y, Tang D (2013) Contactin- 1 Reduserer E-cadherin Expression Via Aktivering AKT i lungekreft. PLoS ONE 8 (5): e65463. doi: 10,1371 /journal.pone.0065463
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 29 oktober 2012; Godkjent: 26 april 2013; Publisert: 28. mai 2013
Copyright: © 2013 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av prostatakreft Canada til D. Tang. Forfatterne ønsker også å erkjenne økonomisk støtte fra St. Josefs Healthcare i Hamilton, Ontario, Canada til Hamilton Centre for Kidney forskning (HCKR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det nevrale celle adhesjon protein contactin-en (Cntn-1) består av seks Ig-domener, fire fibronektin-lignende motiver, og en glykosylfosfatidylinositol (GPI) -moiety [1]. GPI-del forankrer Cntn-en til den ytre membranoverflaten av det sentrale og perifere neuroner [2], [3]. Cntn-1 spiller en rolle i axon forlengelse og dannelse av septate lignende overgangene mellom axoner og myelinerende gliaceller [4] – [6], I tillegg Cntn-1 virker som en ligand til den Notch-reseptoren i hjernen som resulterer i oligodendrocytt modningen [7]. I tråd med disse in vitro observasjoner, in vivo studier viser en kritisk rolle Cntn-1 i axon veiledning og synapse formasjon [8] – [10]. Knockdown av Cntn-1 i
Xenopus
embroys resulterte i villfarelse og defasciculation av trigeminal nerveaxoner [11]. Mens mus som mangler Cntn-en dør i et par uker på grunn av alvorlig ataksi [4], [8].
Selv om tapet av Cntn-en funksjon, som et resultat av genet knockout eller spontane mutasjoner i
Cntn-en
, påvirker det sentrale og perifere nervesystem, men ikke de nevromuskulære veikryss (NMJs) i mus [8], [12], mutasjoner i
Cntn-en
genet har blitt implisert å svekke NMJs funksjon hos mennesker [13]. En mutasjon som resulterer i innføring av et for tidlig stoppkodon i den tredje Ig-domenet var assosiert med en familiær form for dødelig medfødt myopati hos mennesker [13]. Til tross for å akkumulere forskning på Cntn-en funksjon, er lite kjent om dens funksjon utenfor nervesystemet. Selv om Northern blot analyser av bukspyttkjertel, lunge, nyre og skjelettmuskel viste kun lave nivåer av Cntn-1-transkripter [14], dens funksjon i disse vevene og ekspresjon i andre vev er ennå ikke bestemt. Bare nylig har det vært rapporter fra Cntn-1 uttrykk i sykdommer utenfor nervesystemet, spesielt med sitt engasjement i kreft. Cntn-en ble oppdaget i primær lungekreft og knockdown av Cntn-en i lungekreftceller spesielt hemmet deres metastaser, men ikke dannelsen av lokale xenografttumorer hos immunsupprimerte mus [15]. Dette er delvis på grunn av den viktige rollen Cntn-en på aktin cytoskjelettet omorganisering og fokale vedheft strukturer [15]. I tillegg er Cntn-1-mediert metastase regulert av VEGF-C og Cntn-1 forbedrer GTP-bundet RhoA som kan henføres til Cntn-1-promo lungekreft invasjon og metastase [15], [16]. Lungekreftpasienter med høye nivåer av Cntn-1 har dårlig prognose [15]. I samsvar med disse rapportene, faktorer som forbedrer kreft metastasering lunge oppregulerer også Cntn-1 [17]. I tillegg har Cntn-1 er rapportert i melanoma [18] og er forbundet med metastase i magekreft, munn squamous cell carcinoma, og spiserørskreft [19] -. [22]
Til tross for oppsamling av bevis som støtter en rolle av Cntn-en i kreft metastaser, de underliggende mekanismene som er ansvarlig for denne prosessen er fortsatt uklart. For ytterligere å undersøke Cntn-1-mediert onkogenese, har vi slått ned Cntn-en i A549 lungekreftceller. Dette førte til en oppregulering av E-cadherin. Ved primær lungekreft, høye nivåer av Cntn-en co-eksistert med lave nivåer av E-cadherin. Mekanistisk, spiller Cntn-en en rolle i AKT aktivering, som igjen hemmer E-cadherin uttrykk.
Materialer og metoder
cellelinjer, plasmider og hemmere
Lungekreft cellelinjer (A549 og H1299), brystkreft cellelinjer (MCF7, BT549, BT474, MDA-MB-453, T47D og ZR751), nyrekreft cellelinjer (A498 og 786-0), en livmorhalskreft cellelinje (HeLa) , en glioblastoma cellelinje (U87) og 293T-celler (humane embryonale nyre 293 epiteliale celler) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A549, BT549, H1299, T47D, BT474, ZR751, MDA-MB-453 og 786-0 celler ble dyrket i RPMI 1640-media. MCF7, HeLa og 293T-celler ble dyrket i DMEM og A498 og U87-celler ble dyrket i MEM media. Alle medier ble supplert med 10% FBS (Sigma Aldrich, Oakville, ON) og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, Burlington, ON). Identiteten til A549 ble bekreftet av STR-analyse utført av DDC Medical (Fairfield, OH). Cntn-en shRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California) og Cntn-en isoform 3 cDNA ble kjøpt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). Den AKT inhibitor VIII ble kjøpt fra Calbiochem (EMD, Mississauga, ON). E-cadherin arrangøren drevet luciferase-konstruksjonen ble vennlig levert av Dr. Antonio García de Herreros, Universitat Pompeu Fabra, Spania [23].
knockdown av Cntn-en
hårnål shRNAs (kontroll /Ctrl og Cntn-1) ble uttrykt av en retroviral-basert shRNA vektor (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Knockdown av Cntn-1 ble utført i henhold til våre publiserte forhold [24] – [26]. Kort fortalt, en gag-pol uttrykke vektor, en rev uttrykke vektor og en konvolutt uttrykke vektor (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ON) ble midlertidig kotransfektert med designet retroviral plasmid inn 293T celler. Det virusinneholdende medium ble høstet 48 timer senere, filtrert gjennom et 0,45 um filter, og sentrifugert ved 20.000 g i 120 minutter for å konsentrere den retrovirus. Polybren (10 ug /ml, Sigma-Aldrich, Oakville, ON) ble tilsatt før infeksjon og cellene ble selektert for stabil integrering med puromycin (1 pg /ml, Sigma Aldrich, Oakville, ON).
Retroviral overekspresjon av Cntn-en
Menneske Cntn-en isoform 3 cDNA ble kjøpt (Åpne Biosystems, Huntsville, AL) og ytterligere modifisert for å generere hele lengden isoform en av Cntn-en. PCR-primere ble syntetisert som flankerer den C-terminale fragment til stede i en isoform, men mangler i isoform 3. RNA ble isolert fra A549 celler med TRIZOL (Life Technologies, Burlington, ON) og anvendt som templat for RT-PCR. Den resulterende C-terminale PCR-fragment ble ligert i pBluescript KS + og deretter kuttet ut ved restriksjonssetet for MfeI; et unikt område stede i isoform en og isoform tre, noen få basepar oppstrøms før de to sekvenser forskjellig. Den C-terminale fragment ble deretter ligert med det kommersielt innkjøpt isoformen 3. Den fulle lengde isoformen en cDNA for Cntn-en ble deretter klonet inn i en retroviral vektor, pBabe. Bekreftelse av positive kloner ble bestemt ved DNA-sekvensering. Overekspresjon av Cntn-1 ble utført under anvendelse av et gag-pol-uttrykkende vektor og en konvolutt uttrykkende vektor (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ON). Alle trinn ble gjennomført på samme måte som beskrevet ovenfor for knockdown av Cntn-1. Den pBabe vektor uten Cntn-1 ble anvendt som en tom vektorkontroll.
celleproliferasjonsanalyse
I alt 1000 celler av A549 shCTRL og shCNTN-1-celler ble utsådd i en 96-brønners plate og inkubert ved 37 ° C i 5 dager. Proliferasjon ble målt ved bruk av WST-1 celleproliferasjon analysesett (Millipore, Mississauga, ON) i henhold til produsentens instruksjoner. Avlesninger ble målt med en plateavleser ved 420mn.
Invasion analysen
Modifisert Boyden kamrene ble kommersielt kjøpt består av innstikk med en 8 mikrometer pore membran belagt med Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ON ) plassert i en 24-brønns plate. Invasjons analyser ble utført i henhold til produsentens prosedyre. Kort sagt ble Matrigel innsatser gitt 2 timer for å rehydrere ved 37 ° C før bruk i nærvær av 0,5 ml medium. Fullstendig medium (0,5 ml) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS) ble plassert i det nedre kammer. En total av 5 x 10
4 celler ble sådd inn i det øvre kammer av innsatsen i 0,5 ml serumfritt medium i 22 timer. Celler som passerte gjennom membranene ble fiksert og farget med krystallfiolett (0,5%, Sigma Aldrich, Oakville, ON). Prosentandel av fremmede celler, ble beregnet ved å dividere antall celler som passerer gjennom 8 um porestørrelse matrigel membran med antall celler som migrerer gjennom styremembranen og multiplisere med 100.
forankrings-uavhengig vekst Assay
A549 shCTRL og A549 shCNTN celler ble sådd inn i individuelle brønner i seks-brønns plater ved en tetthet på 10
4 celler /brønn i 2 ml av 2X media inneholdende 0,25% agarose. Etter 3 uker, ble 5 tilfeldige felt per brønn undersøkt for kolonier og telles under et fasekontrastmikroskop. Mean koloni området ble bestemt ved hjelp av Image Pro 5.0 software. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller, og gjentatt tre ganger.
Western blot-analyse
Cellelysater ble fremstilt i en buffer inneholdende 20 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 25 mM natriumpyrofosfat, 1 mM NaF, 1 mM β-glycerofosfat, 0,1 mM natriumortovanadat, 1 mM PMSF, 2 ug /ml leupeptin og 10 pg /ml aprotinin (Sigma Aldrich, Oakville, ON). Totalt 50 pg av cellelysat, med mindre annet er spesifisert ble separert på SDS-PAGE-gel og overført til Hybond Amersham ECL-nitrocellulosemembraner (Amersham, Baie d’Urfe, QC). Membranene ble blokkert med 5% skummet melk og deretter inkubert med de angitte antistoffer ved 4 ° C over natten. Passende HRP-konjugerte sekundære antistoffer ble inkubert i en time ved romtemperatur. Signaler ble oppdaget ved hjelp av en ECL Western blotting Kit (Amersham, Baie d’Urfe, QC). De primære og sekundære antistoffer og konsentrasjonene som ble brukt var: anti-Cntn-1 (1:200, R anti-AKT (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-AKT Ser473 fosforylering (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA), anti-GSK3p Ser9 fosforylering (1; 1000, Cell Signaling, Danvers , MA), anti-GSK3p (1:1000, Upstate bioteknologi, Billerica, MA), anti-E-cadherin (1:2500, BD Biosciences, Mississauga, ON), anti-Snail (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-PHLPP2 (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas), anti-GAPDH (1:5000, Cell Signaling, Danvers, MA), anti-aktin (1:1000, Santa Cruz), anti-geit (1:3000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-mus (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ON) og anti-kanin (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ON)
immunfluorescens farging
Celler ble behandlet som definert i figuren legender. Immunfluorescens farging ble utført av feste celler med 4% paraformaldehyde i 20 minutter og permeabilized med 0,05% saponin (Sigma Aldrich, Oakville, ON) i 15 minutter. Anti-Cntn-1 (1:20, R D Systems, Minneapolis, NM) og E-cadherin (1:400, BD Biosciences, Mississauga, ON) ble inkubert med seksjonene natten ved 4 ° C. Negative kontroller ble inkubert med en uspesifikk mus, geit eller kanin IgG. Biotinylated sekundære IgG og Vector ABC reagens (Vector Laboratories, Burlingam, CA) ble deretter lagt i henhold til produsentens instruksjoner. Vaskinger ble utført med PBS. Kromogen reaksjonen ble utført med diaminobenzidin (Vector Laboratories, Burlingam, CA), og kontra med hematoxylin (Sigma Aldrich, Oakville, ON). TMA lysbilder ble skannet med en ScanScope og analysert ved hjelp av ImageScope programvare (Aperio, Vista, CA). Alle flekker (flekker kjerner) ble også manuelt undersøkt. . Resultater oppnådd ved anvendelse av den Imagescope programvare ble omdannet til en HScore ved anvendelse av formelen [(HScore =% positive X (intensitet + 1)] [27], [28] scorene ble tilordnet til en skala fra 0 til 3 (0 – negativ eller bakgrunnsfarging, 1 – svak farging, 2 – moderat farging, 3 -. sterk farging)
real time PCR-analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp TRIZOL (Life Technologies, Burlington, ON). revers transkripsjon ble utført ved å bruke hevet III (Life Technologies, Burlington, ON) i henhold til produsentens instruksjoner. i korthet ble 2 ug av RNA omdannet til cDNA ved 65 ° C i 6 minutter etterfulgt av 2 minutters inkubasjon på is, 25 ° C i 11 minutter, 50 ° C i 60 minutter og 70 ° C i 15 minutter. real time PCR primere som brukes for aktin, er PHLPP2, SIP1, Slug, Twist, E47 og E-cadherin oppført i tabell 1. PCR effektivitet for hvert primersett er som følger: aktin 93%, SIP1 86%, Slug 97%, E47 96%, Twist 92%, PHLPP2 92% og E-cadherin 85% Sanntids tids~~POS=HEADCOMP-PCR ble utført ved anvendelse av ABI 7500 Fast Real-. Time PCR System (Applied Biosystems, Burlington, ON) i nærvær av SYBR-grønne i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems, Burlington, ON). Kort, hver reaksjon besto av en ul cDNA, 0,25 mL fremover primer (10 mm), 0,25 mL revers primer (10 mm), 4,75 mL H
2o og 6,25 mL av SYBR grønn mester mix. PCR-reaksjonen ble utført i en 96-brønners plate ved 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. Alle prøver ble kjørt i tre eksemplarer og gjentatt tre ganger
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av student t-test og p .. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Cntn-en reduserer E-cadherin uttrykk
Cntn-en spiller en avgjørende rolle i metastasering av A549 lungekreftceller [15]. For ytterligere å undersøke Cntn-1-mediert lungekreft metastase, har vi slått ned Cntn-en i A549 celler. Mens knockdown av Cntn-1 ikke påvirker celleproliferasjon (figur 1A), ble cellenes evne til å vokse i myk agar og for å invadere matrigel betydelig redusert (figur 1 B, C). Disse resultatene er i tråd med rapporten at knockdown av Cntn-en ikke påvirker dannelsen av xenografttumorer men redusert cellens metastase evne [15].
(A) A549 celler ble stabilt transfektert med kontroll (CTRL) eller Cntn-en shRNA. Knockdown av Cntn-en ble bekreftet ved western blot (innfelt). 1000-celler ble sådd på 96-celleplater. Celleproliferasjon ble målt daglig ved bruk av WST-1 celle-proliferasjon analysesett i fem dager. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Typiske resultater fra en enkelt gjenta er vist. (B) For å undersøke cellenes evne til å vokse i myk agar ble 10
4 celler sådd ut på agar inneholdende medium i 3 uker. Forsøk ble utført i triplikater og gjentatt tre ganger. Typiske bilder fra ett eksperiment er vist (venstre panel). Størrelsene på myke agar kolonier ble beregnet ved hjelp ImagePro 5,0 program og presentert som betyr ± SD. *:
p
0,05 i forhold til A549 shCNTN-1 celler (2 tailed student t-test). (C) A549 shCTRL og shCNTN ble undersøkt for deres evne til å passere gjennom en regulerings og matrigel membran. Forsøkene ble utført tre ganger. Typiske bilder fra ett eksperiment er vist (venstre panel). Invasion ble kvantifisert (høyre panel).
Invasjonen evne epiteliale celle-opprinnelse kreft skyldes tap av epiteliale celle adhesjon protein, E-cadherin [29], [30]. For å undersøke om E-cadherin bidrar til Cntn-en-medaited celle invasjon, var vi i stand til å vise at knockdown av Cntn-en betydelig økt E-cadherin uttrykk (Figur 2A). Dette oppregulering var delvis på grunn av høyden i E-cadherin transkripsjon, dokumentert av økningen i E-cadherin mRNA (figur 2B) og E-cadherin promoter aktivitet (figur 2C). Videre, i samsvar med Cntn-1 er forankret på celleoverflaten [3] og området av funksjon for E-cadherin også være på celleoverflaten, knockdown av Cntn-1 ikke bare vesentlig redusert celleoverflaten innholdet av Cntn-1 ( Figur 2D), men også økt celleoverflate-E-cadherin (figur 2E). Tatt sammen, de ovenfor angitte observasjoner viser at Cntn-1 reduserer E-cadherin ekspresjon i det minste in vitro.
(A) Cellelysater ble fremstilt fra de angitte cellelinjer, etterfulgt av påvisning av E-cadherin, Cntn -1 og aktin av western blot (venstre panel). Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Nivåene av E-cadherin ble kvantifisert og plottes (betyr ± SD). *:
p
0,05 etter to-tailed student t-test. (B) Real time PCR-analyse av E-cadherin uttrykk i de angitte cellelinjer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. E-cadherin mRNA i A549 shCNTN celler ble vist som en fold endring som for A549 shCTRL celler. *:
p
0,05 etter to-tailed student t-test. (C) A549 shCTRL og A549 shCNTN celler ble transient transfektert med E-cadherin promoter drevet luciferase og en CMV-LacZ drevet konstruere i 48 timer, etterfulgt av å vurdere for luciferase og β-gal aktivitet. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. (D) Immunofluorescens farging av A549 shCTRL og A549 shCNTN for Cntn-1. (E) Immunofluorescens farging for E-cadherin på de angitte cellelinjer. Kjerner ble kontra med DAPI.
For ytterligere å bestemme forholdet mellom Cntn-1 og E-cadherin, har vi undersøkt 63 primær lungekarsinom (tabell 2). Omtrent 65% (41/63) og 35% (22/63) av primære lungekarsinom uttrykt lett påvisbar (Cntn-en
+) og undetectable Cntn-en (Cntn-en
-), henholdsvis ved IHC (Figur 3A). Dette er konsistent med den publiserte forekomsten for Cntn-en
+ versus Cntn-en
– primære lungekarsinom [15]. I tillegg, i vår analyse av 46 trinn I /II og 17 trinn III /IV primær lungekarsinomer (tabell 2), omtrent 61% av trinn I /II og 76% av trinn III /IV karsinomer er Cntn-1-positive (figur 3B), som indikerer en rolle Cntn-en i lungekreft progresjon.
Seksti tre primære lungekarsinom fra microarray ble IHC farget for Cntn-1 og E-cadherin. (A) Typisk bilder av lungekrefttilfellene med høye og lave nivåer av Cntn-en. Prosentandelen av lungekarsinomer med høye eller lave nivåer av Cntn-en er indikert. (B) Tissue microarrays ble skannet og analysert med ImageScope. Cntn-1 uttrykket etter lungekreft progresjon ble analysert. (C) Typiske bilder av lungekrefttilfellene med høye og lave nivåer av E-cadherin. Prosentandelen av lungekarsinomer med høye eller lave nivåer av E-cadherin er indikert. (D) På grunnlag av IHC-farging, ble andelen av Cntn-1-positive karsinomer som uttrykte høye eller lave nivåer av E-cadherin beregnet. (E) Primær lungekreft ble IHC farget for Cntn-1 og E-cadherin. Regioner positivt for Cntn-en og negative for E-cadherin (blå boks, blå sirkel), positivt for Cntn-en og positiv av E-cadherin (grønn boks), negativt for Cntn-en og positivt for E-cadherin (rød boks ) og begge Cntn-1 og E-cadherin negative (svart boks) kan observeres.
Vi har også analysert E-cadherin uttrykk i grunnskolen lungekarsinom. E-cadherin
+ og E-cadherin
– karsinom ble observert (figur 3C) med de aller fleste tilfeller blir E-cadherin-negative (63% eller 40/63). Dette er på linje med en rekke publikasjoner som viser 60% -70% av lunge adenokarsinom som uttrykker redusert E-cadherin uttrykk [31], [32]. Imidlertid, andre har også rapportert lavere prosenter, mindre enn 50% av lungekreft som uttrykker redusert E-cadherin [33], [34]. Viktigere, ca 61% av Cntn-1-positive karsinomer er også E-cadherin-negative (Figur 3D). Men vi observerer karsinom som var negative for både Cntn-1 og E-cadherin (data ikke vist), noe som tyder på at Cntn-en er ikke den eneste faktoren hemme E-cadherin uttrykk. I å støtte dette forslaget, mens Cntn-en negativ lungekreft regioner kan være E-cadherin positiv, fra den samme pasient i Cntn-1 karsinomer ekspresjon positiv lunge reduserte nivåer av E-cadherin (figur 3E). Til sammen støtter vår etterforskning konseptet at Cntn-en letter lungekreft progresjon /metastase delvis via nedregulering av E-cadherin.
Cntn-en synker E-cadherin uttrykk via styrke AKT aktivering
for å undersøke mekanismene som er ansvarlig for Cntn-1-mediert nedregulering av E-cadherin uttrykk, må vi først avgjort om Cntn-1 påvirker sneglen uttrykk. Sneglen er den mest studerte inhibitor av E-cadherin transkripsjon [23]. I A549 celler, ikke knockdown av Cntn-en ikke endre snegle uttrykk (figur 4A), noe som tyder på at snegle kan ikke være den viktigste faktor involvert i Cntn-1-mediert hemming av E-cadherin uttrykk i A549 celler. Ved undersøkelse av andre E-cadherin transkripsjonsfaktorer, SIP1 og Slug uttrykk redusert etter Cntn-en knockdown i A549 celler (figur 4B, C). Imidlertid ble ingen endring sett for E47 og Twist (data ikke vist).
(A) Cellelysater for de angitte cellelinjer ble undersøkt for sneglen uttrykk ved western blot. Eksperimenter ble utført tre ganger. Typiske bilder (innfelt) og kvantifisering av Snail uttrykk vises. Sanntid PCR-analyse av (B) SIP1 og (C) Slug ekspresjon på de angitte cellelinjer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. MRNA i A549 shCNTN celler ble vist som en fold endring som for A549 shCTRL celler. *:
p
0,05 etter to-tailed student t-test
andre, og vi har nylig vist at AKT aktivitet reduserer E-cadherin uttrykk [35] – [39. ] og AKT aktivitet spiller en avgjørende rolle i tumordannelse og metastasering [40] – [42]. Vi har derfor undersøkt om AKT bidrar til Cntn-1-mediert nedregulering av E-cadherin. For å undersøke denne muligheten, vi bestemt status for AKT aktivering i A549 kontrollcellene og i A549 celler hvor Cntn-en ble slått ned. I forhold til shCTRL celler, knockdown av Cntn-en betydelig redusert AKT-aktivering (figur 5A). For ytterligere å bekrefte endringer i AKT aktivering, viste vi at i forhold til shCTRL celler fosforylering av serin 9 av GSK3P, et veletablert AKT mål [41], ble betydelig redusert i Cntn-1 knockdown celler (figur 5B). Samlet utgjør disse observasjonene viser at Cntn-en spiller en rolle i AKT aktivering.
(A) Cellelysater for A549 shCTRL og A549 shCNTN ble undersøkt for p-AKT og total AKT av western blot (venstre panel) . AKT aktivering ble kvantifisert (høyre panel). (B) fosforylering ved Ser9 av GSK3p (pGSK3β), GSK3p, og GAPDH uttrykk i A549 shCTRL og A549 shCNTN celler ble også bestemt.
Vi så bestemt om modulering av AKT aktivitet bidrar til Cntn-en -indusert reduksjon av E-cadherin uttrykk. Hemming av AKT aktivering med en AKT-inhibitor øket E-cadherin ekspresjon i A549-celler (figur 6A), noe som indikerer at reduksjon av AKT aktivering ved knockdown av Cntn-1 kan bidra til den observerte inhibering av A549 celle invasjon (figur 1). For å teste denne muligheten, kunne vi vise at mens knockdown av Cntn-en redusert A549 celle invasjon på DMSO behandling (vesikkel kontroll), knockdown av Cntn-en ikke lenger hemme A549 celle invasjon når AKT aktivering ble hemmet (figur 6B) . Samlet utgjør disse observasjonene støtter forestillingen om at Cntn-1 hemmer E-cadherin uttrykk via styrke AKT aktivering. Som reduksjon i E-cadherin spiller en viktig rolle i kreft metastase [29], [30], bidrar tap av E-cadherin derfor til lungekreft metastaser.
(A) A549 celler ble behandlet med en AKT inhibitor (AKT inhibitor VIII) ved økende konsentrasjoner og deretter undersøkt for E-cadherin, AKT aktivering (Pakt), AKT, og Actin uttrykk. (B) A549 shCTRL og A549 shCNTN-1 celler ble mock-behandlet (DMSO, topp to paneler) eller behandlet med en AKT inhibitor (to nederste paneler), etterfulgt av å bestemme sine invasjonskapasitet Matrigel innsatser. Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Både typiske bilder og kvantifisering av celle invasjon evne vises. *:.
p
0,05 etter to-tailed student t-test
Cntn-en øker AKT-aktivering ved å redusere PHLPP2 uttrykk
AKT aktivitet reguleres av både oppstrøms og nedstrøms fosfataser, PTEN og PHLPP (PH domene leucine-rik gjenta protein fosfatase). Vi har fastslått derfor enten det ene eller begge fosfataser er involvert i Cntn-1 knockdown-induserte reduksjon av AKT aktivering. I forhold til shCTRL celler, knockdown av Cntn-en ikke signifikant innvirkning PTEN uttrykk (figur 7A). Men reduksjonen i Cntn-en økt betydelig PHLPP2 uttrykk i A549 celler (figur 7B). Videre oppregulering av PHLPP2 i Cntn-1 knockdown A549-celler ble delvis tilskrives økningen i PHLPP2 mRNA (figur 7C), som kan være et resultat av enten oppregulering av PHLPP2 gentranskripsjon eller stabilisering av PHLPP2 mRNA.
(A) A549 shCTRL og A549 shCNTN-1 cellelysater ble undersøkt for PTEN uttrykk ved western blot (øverst). Eksperimenter ble utført tre ganger. Typiske bilder fra et enkelt eksperiment ble vist (venstre panel). PTEN uttrykk ble også kvantifisert (høyre panel). (B) PHLPP2 uttrykk i A549 shCTRL og A549 shCNTN cellelinjer ble undersøkt ved western blot (øverst). Forsøkene ble gjentatt tre ganger. Typiske bilder fra et enkelt eksperiment ble vist (venstre panel). PHLPP2 uttrykk ble kvantifisert (høyre panel). *:
p
0,05 etter to-tailed student t-test. (C) Real time PCR-analyse av PHLPP2 uttrykk i de angitte cellelinjer. β-actin ble brukt som en intern kontroll.
Cntn-en regulering av E-cadherin og AKT aktivisering er ikke unikt for A549
For å finne ut om Cntn-1 regulerer E- cadherin og AKT i andre kreftcellelinjer, undersøkte vi en rekke bryst, nyre, lunge og livmorhalskreft for Cntn-1 og E-cadherin uttrykk. Til tross for den rekke krefttyper som ble undersøkt, Cntn-1 er ikke en universelt uttrykt protein i kreft (figur S1). I tillegg, siden to brystcancer cellelinjer undersøkt uttrykte E-cadherin, fortsatte vi å undersøke om Cntn-1 kan regulert E-cadherin og AKT-aktivitet i disse to cellelinjene. Ved ektopisk overekspresjon av Cntn-1 i BT549, vi har observert en reduksjon av E-cadherin ekspresjon sammenlignet med tom vektorkontroll uten forandring i AKT aktivering (fig S2). I motsetning til overekspresjon av Cntn-1 i MCF7-celler førte til en økning i AKT aktivering sammenlignet med tom vektorkontroll (figur 8A, B), men det var ingen endring ble observert i E-cadherin (figur 8C, D). På grunnlag av disse bevisene er Cntn-1-medierte regulering av E-cadherin og AKT ikke begrenset til lungekreft, og kan spille en rolle i andre krefttyper som uttrykker Cntn-1.
(A) Cntn-1 ble overuttrykt i MCF7-celler og cellelysatene ble samlet og kjørt på western blot for Cntn-1, p-AKT, AKT og aktin uttrykk. (B) immunfluorescens farging for Cntn-en på de angitte cellelinjer. (C) Cellelysater ble samlet inn fra de angitte cellelinjer. Bare 10 ug av cellelysater ble kjørt på western blot for E-cadherin og aktin uttrykk. (D) Immunofluorescens farging for E-cadherin på de angitte cellelinjer. Kjerner ble kontra med DAPI
Diskusjoner
Cntn-en er en neural vedheft protein med funksjoner i axon veiledning og synapse formasjon [8] -. [10].
