Abstract
Elektriske gradienter er til stede i mange utviklings og regenererende vev og rundt svulster. Mimicking endogene elektriske felt
in vitro
har dyptgripende virkninger på oppførselen til mange celletyper. Intriguingly, spesifikke celletyper migrere cathodally, andre anodally og noen polarisere med sin lengdeakse vinkelrett på den elektriske vektor. Disse slående fenomener er sannsynlig å ha
in vivo
relevans siden en av de avgjørende faktorer i løpet av kreft metastaser er evnen til å veksle mellom attraktive og frastøtende migrasjon i respons til ekstracellulære veiledning stimuli. Vi presenterer som tyder på at livmorhalskreft cellelinjen HeLa migrerer cathodally i en likestrøm elektrisk felt av fysiologisk intensitet, mens den sterkt metastatisk prostatakreft-cellelinje PC-3-M vandrer anodally. Spesielt, genetisk forstyrrelse av protein serin /treonin fosfatase-1 (PP1) og dens regulator NIPP1 redusere retnings migrasjon i disse cellelinjene. Motsatt den induserbare ekspresjon av NIPP1 slått retningsresponsen til HeLa-celler fra katodisk til svakt anodisk i en PP1 avhengig måte. Bemerkelsesverdig, induksjon av en hyperaktiv PP1 /NIPP1 holoenzyme, ytterligere forskjøvet retnings migrering mot anoden. Vi viser at PP1 tilknytning NIPP1 oppregulerer signalering av GTPase Cdc42 og viser at farmakologisk hemming av Cdc42 i celler som overuttrykker NIPP1 gjenvunnet katodisk migrasjon. Til sammen gir vi den første bevis for regulering av retnings celle migrasjon av NIPP1. I tillegg identifiserer vi PP1 /NIPP1 som en roman molekylære kompass som styrer rettet celle migrasjon via oppregulering av Cdc42 signalisering og foreslå en måte som PP1 /NIPP1 kan bidra til trekk egenskapene til kreftceller
Citation.: Martin-Granados C, Prescott AR, Van Dessel N, Van Eynde A, Arocena M, Klaska IP, et al. (2012) En rolle for PP1 /NIPP1 i Steering migrering av humane kreftceller. PLoS ONE syv (7): e40769. doi: 10,1371 /journal.pone.0040769
Redaktør: Maddy Parsons, Kings College London, Storbritannia
mottatt: 24 april 2012; Akseptert: 13. juni 2012; Publisert: 16.07.2012
Copyright: © 2012 Martin-Granados et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av en Wellcome Trust gi 079518 /z /06 /z til CDM og av utviklings Trust ved University of Aberdeen til JVF. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cell migrasjon spiller en sentral rolle i mange prosesser som embryoutvikling og sår reparasjon og mis-regulert signale svar på trekkende signaler kan indusere patologier som tumor metastaser, betennelser og epilepsi [1] – [4]. Epitel, endothelial, nevronale og immunceller, blant annet, er utsatt for en rekke stimuli som direkte celle migrasjon. I tillegg til de mer anerkjente kjemiske signaler, slik som vekstfaktorer og cytokiner, endogent genererte elektriske felter (EF) av ionisk karakter har blitt målt rundt skadet vev, inflammasjonssteder og tumorer [5] – [10]. Disse elektriske signalene kan virke som retningsstyrings signaler i løpet av sårtilheling, embryoutvikling og tumorigenesis [11], og derfor en forklaring på de molekylære mekanismene bak de cellulære responser til EF er av stor betydning. Bruk av en jevn, likestrøm (DC) EF til celler og vev
in vitro
etterligner effekten av en endogen EF [12] og dette har identifisert en rekke celleoverflatereseptorer, fosforylering signaliserer proteiner og andre budbringere som transduce elektriske signaler. For eksempel, epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og integriner er blant de første sensorene i de elektriske signaler i flere celletyper. EGFRs translocate innenfor planet av det ytre lipid bilaget til å samle seg på katodisk, apikale side av celler. For keratinocytter og corneale epitelceller dette skjer i løpet av 5-10 min fra EF eksponering [13], [14]. Som en konsekvens, blir EGF signale polarisert, forårsaker større katodisk aktivering av ERK1 /2, nedstrøms katodisk polymerisasjon av F-aktin og ledet migrering [13] – [15]. Lignende funn er rapportert å underbygge katodisk electrotaxis av embryonale og voksne nevrale stamceller [16]. I tillegg inte α5 og α5ß1 redistribuere og samlet cathodally på fibroblaster migrere cathodally, som gjør β1 inte i epitelceller [17], [18]. Videre uttømming av SS4 integrin eller tilsetning av et anti-integrin β1 subenhet antistoff undertrykker EF-rettet migrasjon [18], [19].
Rollen av protein tyrosin (Tyr) kinaser i overføringen har blitt godt studeres, mens bidraget fra protein fosfataser har begynt å bli verdsatt bare nylig [20]. Faktisk er den eneste fosfatase er kjent for å være involvert i electrotaxis er lipid-fosfatase «fosfatase tensin homolog slettet på kromosom ti» (PTEN) [7].
Protein serin /treonin (Ser /Thr) fosfatase-1 (PP1) er en av de høyest konservert enzymer kjent og spiller en sentral rolle i en rekke cellulære prosesser, inkludert proteinsyntese, RNA-spleising, cellesyklusprogresjon og glykogen metabolismen [21], [22]. Et stort utvalg av regulatoriske subenheter forbinder med PP1 katalytiske subenheten for å bestemme dens cellulære lokalisering og substrat spesifisitet, mediere kontroll av disse mange fysiologiske prosesser via PP1 holoenzymes [22] – [24]. NIPP1 (atom inhibitor av proteinfosfatase 1) er et sterkt konservert og ubikvitært uttrykt protein som opprinnelig ble karakterisert som en PP1 inhibitor [25] – [27]. NIPP1 tjener som en form for stillas protein rundt hvilken en rekke proteiner som fosfataser, kinaser, skjøte faktorer og kromatin modifikatorer samle funksjonelt. NIPP1 inneholder to store PP1-interaksjon nettsteder som bor i de sentrale og C-terminale områder, blant dem aminosyreresidiene 200-203, som representerer en RVxF-type PP1 docking nettstedet. Nyere bevis tyder på at effekten av NIPP1 på PP1 er underlaget avhengige: det potent blokkerer defosforylering av mange PP1 underlag, men fremmer defosforylering underlag som er rekruttert via sin gaffelhode Associated (FHA) domene [28]. Interessant, PP1 bundet til overexpressed villtype NIPP1 (WT-NIPP1) er sterkt fosforylert ved Thr-320, et merke som inaktiverer PP1, mens PP1 bundet til en C-terminal avkortet NIPP1 protein (A C-NIPP1) er mindre fosforylert på Thr -320, som er veiledende for en hyperaktiv PP1 /NIPP1 holoenzyme [28].
en rolle for PP1 som en regulator av celle polaritet og migrasjon begynner å dukke opp. PP1 samhandler med flere proteiner som regulerer actin cytoskjelettet og bidrar til dannelse av cellulære fremspring og adhesjon [24]. Dessuten har en meget fersk rapport identifisert en funksjonell rolle for PP1 i å kontrollere tarmnervecellemigrasjon [29]. Her undersøkte vi om PP1 og NIPP1 nivå regulerer motilitet og retnings migrering av livmorhalskreft-avledet HeLa cellelinje. Videre utforsket vi bidraget fra NIPP1-assosiert PP1 til retnings migrering ved hjelp av HeLa Tet-Off (MTO) celler som ble utviklet for å å indusere uttrykke WT-NIPP1, C-terminalen avkortet NIPP1 (A C-NIPP1) eller en PP1-bindende mutant av NIPP1 (mNIPP1) [28], [30]. Vi brukte en DC elektrisk felt (EF) som en lett bearbeidbar veiledning kø kjent for å kontrollere rettet cellemigrering fra normale og tumorceller [31], [32]. Her viser vi at PP1 og NIPP1 nivåer er nødvendig for optimal tilfeldig motilitet av enkelt HeLa-celler og for ledet migrering i respons til en DC-EF. Vi bekrefter at NIPP1 nivåer er nødvendig for retningscellemigrasjon ved å teste electrotaxis av den svært metastatisk prostatakreft-avledet cellelinje PC-3-M. Videre demonstrerer vi at binding av PP1 til NIPP1 fungerer som et kompass som styrer den retning i hvilken cellene migrerer via regulerer ekspresjonen av integrin og vekstfaktorreseptorer, og Cdc42 GTPase aktivitet. Disse resultatene identifisere en funksjonell rolle for NIPP1 i celle migrasjon og avdekke PP1 /NIPP1 som første protein Ser /Thr fosfatase kompleks styring av retnings respons av celler til elektriske veiledning pekepinner.
Resultater
PP1 og NIPP1 er nødvendig for tilfeldig og Directional Migrasjon av HeLa og PC-3-M-cellene i respons til elektrisk Veiledning Cues
en veldig fersk studie har vist at behandling av enteriske nerve crest celler med okadasyre, hemmer protein fosfataser 1 og 2A, induserer urettet cellefremspring og tilfeldige celle bevegelser [29]. Derfor, undersøkte vi en potensiell rolle for PP1 i å regulere retnings migrering av cervikal epitel karsinom-avledet HeLa-Tet-Off (MTO) -celler i respons til elektriske lede signaler. For dette, testet vi effekten av tidligere godkjente sirnas rettet mot alle tre isoformer PP1 på tilfeldig motilitet av enkeltceller og på den rettede trekkende responsen av celler til en påtrykt EF (electrotaxis) [33]. PP1 proteinnivåer ble redusert med 85% etter 48 timer med transfeksjon (fig. 1A). I fravær av en EF, både kontroll og PP1 knockdown (KD) celler migrert tilfeldig (Fig. 1B). Når en DC EF ble brukt, 82% ± 5 av kontroll siRNA celler migrert cathodally (rød, til høyre) (figur 1B, jf. Video S1). EF behandling økt avstanden migrert, hastigheten på migrasjonen og directedness av kontroll siRNA-celler (fig. 1C). Men PP1 uttømming helt svekket electrotaxis, 57% ± 2 av PP1 siRNA celler migrert cathodally (rød, høyre) og 43% ± 2 anodally (svart, venstre) (figur 1B, C, jf. Video S2). Videre har vi observert at celler utarmet på PP1 vist færre cellulære fremspring og mer stress fibre sammenlignet med kontroll siRNA-celler (Fig. 1D). Spesielt tap av PP1 redusert filopodia dannelse i ubehandlede og EF-behandlede celler (fig. 1E).
A. Behandling av foreldre HeLa Tet-Off (MTO) celler med siRNA sterkt utarmer PP1 nivåer 48 timer etter transfeksjon. Endogene PP1 nivåer ble visualisert med PP1 antistoffer som gjenkjenner alle isoformer. B. Plot diagrammer viser at tapet av PP1 svekker evnen til cellene til å migrere mot katoden. Hver linje representerer overføringen banen til en enkelt celle. Utgangspunktet for hver celle vandringsbane er i origo. Celle spor med endeposisjonene til høyre vises i rødt ( «C», katoden) og de til venstre vises i sort ( «A», anode). EF-ubehandlede celler ble undersøkt som kontroller. Kontroll siRNA celler migrerer sterkt mot katoden; PP1 siRNA behandlede celler er ikke i stand til å migrere i respons til en DC-EF. Scales vise avstand migrert i mikrometer. C. PP1 uttømming reduserer sterkt avstand migrert, hastighet og directedness svar på fysiologisk DC EF. Feil barer er S.E.M.
p
verdier for signifikante forskjeller i avstand, hastighet og directedness vises. D. Lokalisering av endogent PP1 og fordeling av filamentformig-aktin i kontroll og PP1 utarmet celler behandlet med DC EF. Endogene PP1 nivåer ble visualisert med PP1 antistoffer som gjenkjenner alle isoformer (grønn) og polymeriserte aktin ble oppdaget ved hjelp av rhodamine phalloidin (rød). Kjernen er farget med DAPI (blå). Piler markerer celler med en sterk reduksjon i PP1 nivåer som korrelerer med defekter i dannelsen av aktin rike fremspring. Representative bilder vises. Scale bar er 50 mikrometer. E. antall celler med filopodia ble kvantifisert ved å telle 100 celler. Feil barer er S.E.M.
p
verdier for signifikante forskjeller vises. Bilder viser en detalj av celle utstikkere i kontroll siRNA og PP1 siRNA celler. Piler markere mange filopodia i kontrollceller og skissere områder med stor mangel på filopodia på cellekantene i PP1 siRNA celler.
Videre undersøkte vi en mulig regulerende rolle for PP1 Interactor NIPP1 i dannelsen av aktin fremspring og i tilfeldig og retnings migrasjon av MTO celler. Først undersøkte vi om NIPP1 er nødvendig for migrasjon ved å teste effekten av tidligere validerte siRNAs rettet mot NIPP1 [34]. NIPP1 proteinnivåer ble redusert med 80% etter 48 timer med transfeksjon (fig. 2A). I fravær av en EF, både kontroll og NIPP1 knockdown (KD) celler migrert tilfeldig (Fig. 2B). I nærvær av en EF, kontrollceller viste sterk katodisk migrasjon; 87% ± 4 av kontroll siRNA celler migrert cathodally (rød, høyre) og 13% ± 4 anodally (svart, venstre) (figur 2B, jf. Video S3). Men NIPP1 KD celler viste en mye avstumpet katodisk migrasjon, 57% ± 3 av NIPP1 siRNA celler migrert cathodally (rød, høyre) og 43% ± 3 anodally (svart, venstre) (Fig. 2B, C og se video S4). Videre, i fravær av et EF en to-gangers reduksjon i hastigheten og dermed avstanden til cellemigrering ble sett i NIPP1 siRNA-celler sammenlignet med kontroll siRNA behandlede celler (Fig. 2C). Den reduserte hastigheten og distansen av vandring forårsaket av manglende NIPP1 var enda større i celler eksponert for en EF som viste en fire-gangers reduksjon i cellemigrering og over en to-gangers reduksjon i hastigheten på migrasjonen forhold til EF-behandlede kontroll siRNA cellene (fig. 2C). I samsvar med tidligere rapporter, DC EF fremmet aktin polymerisasjon og dannelse av aktin rike celle utstikkere i kontroll MTO celler (Fig. 2D). Imidlertid NIPP1 KD cellene hadde færre cellefremspring (fig. 2D). Spesielt ble evnen til å danne filopodia i NIPP1 KD-celler utsatt sterkt i ubehandlede og EF-behandlede celler (fig. 2E).
A. Behandling av foreldre HeLa Tet-Off (MTO) celler med siRNA sterkt utarmer NIPP1 nivåer 48 timer etter transfeksjon. Cellelysater ble analysert ved SDS /PAGE og immunoblotting. Band som tilsvarer alle PP1 isoformene ble oppdaget og GAPDH ble brukt som lasting kontroll. B. Plot diagrammer viser at tap av NIPP1 svekker evnen til cellene til å migrere mot katoden. Kontroll siRNA celler migrerer sterkt mot katoden; NIPP1 siRNA behandlede cellene vise en mye redusert katodisk reaksjon. Scales vise avstand migrert i mikrometer. Vekter er forskjellig mellom diagrammer for å inkludere sporene av hver celle analysert. C. NIPP1 uttømming reduserer sterkt avstand migrert, hastighet og directedness svar på fysiologisk DC EF. Dataene er fra minst tre forsøk. Feil barer er S.E.M.
p
verdier for signifikante forskjeller i avstand, hastighet og directedness vises. D. Lokalisering av endogent NIPP1 og fordeling av filamentformig-aktin i kontroll og NIPP1 utarmet celler behandlet med DC EF. Endogene NIPP1 nivåer ble anerkjent med en kanin anti-NIPP1 antistoff (grønn) og polymerisert aktin ble oppdaget ved hjelp av rhodamine phalloidin (rød). Kjerner er farget med DAPI (blå). NIPP1 lokaliserer til kjernen i EF-behandlede og ubehandlede celler, og dens nivå er utarmet av siRNA. Scale bar er 50 mikrometer. E. antall celler med filopodia ble kvantifisert ved å telle 100 celler. Feil barer er S.E.M.
p
verdier for signifikante forskjeller vises. Bilder viser en detalj av celle utstikkere i kontroll siRNA og NIPP1si RNA celler. Piler markere mange filopodia i kontrollceller og skissere områder med stor mangel på filopodia på cellekantene i NIPP1 siRNA celler.
For ytterligere å validere våre data og for å utelukke mulige off-target effekter av siRNA rettet mot NIPP1 vi også undersøkt electrotactic responsen i svært metastatisk human prostatakreft cellelinje, PC-3-M, utarmet i NIPP1 nivåer via uttrykk for en shRNA targeting NIPP1 etter IPTG behandling. NIPP1 ble redusert med ca 70% etter 5 dager med IPTG behandling (fig. 3A). Vi viser for første gang at PC-3-M-celler viser en meget robust electrotactic respons mot anoden som antydet med en sterkt negativ directedness fra -0,9 (fig. 3B, C og se video S5), og det tap av NIPP1 sterkt reduserer retnings responsen av disse cellene til en DC-EF (fig. 3B, C og se video S6).
A. Behandling av PC-3-M celler med IPTG induserer NIPP1 uttømming. Cellelysater ble analysert ved SDS /PAGE og immunoblotting. Bånd tilsvarende de PP1 isoformene ble detektert og GAPDH ble anvendt som kontroll lasting. B. Plot diagrammer viser at tap av NIPP1 svekker evnen til PC-3-M-celler til å migrere anodally. Migrasjon baner ble sporet i tre timer. Utgangspunktet for hver celle vandringsbane er i origo. Celle spor med sluttposisjonen til høyre vises i rødt og de til venstre vises i svart. Katoden er merket som «C» og anode som «A» når en like EF tilføres cellene. Kontroll egge PC-3-M-celler migrerer sterkt anodally (negativ directedness verdi); celler som uttrykker shRNA targeting NIPP1 viser en mye redusert anodisk reaksjon. Scales vise avstand migrert i mikrometer. Vekter er forskjellig mellom diagrammer for å inkludere sporene av hver celle analysert. C. NIPP1 uttømming sterkt redusert avstand migrert og directedness svar på fysiologisk DC EF. Dataene er fra minst tre forsøk. Feil barer er S.E.M.
p
verdier for signifikante forskjeller i avstand, hastighet og directedness vises.
Sammen er disse dataene viser at både PP1 og NIPP1 kreves for retnings vandrende responsen HeLa og PC -3-M-celler til en DC EF.
PP1 /NIPP1 Styrer Retnings Cell Migration
Deretter tok vi en motsatt tilnærming og utforsket effekten av overekspresjon av NIPP1 og dens binding til PP1 på EF-indusert retnings migrasjon. For dette har vi brukt tidligere preget HeLa Tet-Off (MTO) cellelinjer som uttrykker tre forskjellige NIPP1 varianter i fravær av doxycylin (fig. 4A) [28], [30]. Tre dager etter doxycyklin fjernet fra mediet, ble ekspresjon av de NIPP1 variantene evaluert ved Western blotting (fig. 4B). Disse variantene inkludert FLAG-merket WT-NIPP1, som er forbundet med (delvis) inaktivt PP1, C-terminalt nicked FLAG-NIPP1 (A C-NIPP1) som er kompleksdannet til konstitutivt aktiv PP1 og et punkt mutant (mNIPP1) som mangler en funksjonell RVxF-type PP1 bindende motiv og kan derfor bare marginalt binde seg til PP1 (fig. 4A).
A. Cartoon av endogen NIPP1 og annerledes FLAG-merket NIPP1 varianter uttrykt etter doxycyklin fjerning i HeLa Tet-Off (MTO) cellelinjer. Alle tre NIPP1 variantene har en gaffelhode tilknyttet domene (FHA). Konsensus PP1-bindende sekvens, RVTF i W.T-NIPP1 har blitt mutert til RATA i FLAG-mNIPP1 variant. Den C-terminale auto-hemmende (ID) domenet er ikke inkludert i den FLAG merket A C-NIPP1 protein, noe som resulterer i ekspresjon av et konstitutivt aktiv PP1 /NIPP1 holoenzyme. B. Ekspresjon av NIPP1 varianter bekreftet ved Western-blotting etter fjerning av doxycyklin. Cellelysater ble analysert ved SDS /PAGE og immunoblotting. Bånd tilsvarende de PP1 isoformene ble detektert og GAPDH ble anvendt som kontroll lasting. C. NIPP1 uttrykk og lokalisering i MTO-celler ble bekreftet av ICC i EF-behandlede og ubehandlede MTO celler. Anti-Flag antistoff og rhodamine phalloidin har blitt brukt til å påvise flagget-taggede NIPP1 varianter (grønn) og F-aktin (rød). Kjernene ble farget med DAPI. Overexpressed NIPP1 lokaliserer til kjernen i EF-behandlede og ubehandlede celler. Scale bar er 50 mikrometer. Diagrammer viser at en EF av fysiologisk styrke (200 mV /mm) induserte forskjellige trekkende responser i MTO celler som uttrykker ulike NIPP1 varianter. EF-ubehandlet MTO-celler er vist som kontroller. Migrerings baner som ble sporet i tre timer i fravær og nærvær av EF. Hver celle posisjon ved 0 h er plassert i origo (0, 0). Celler som sluttposisjonen er til høyre er farget rød og de til venstre vises i svart. Katoden er merket som «C» og anode er merket som «A» når DC EF er brukt på celler. Scales vise avstand migrert i mikrometer. Legg merke til at vekten er forskjellig blant diagrammer for å inkludere sporene av hver celle analysert.
Lokalisering av de tre ulike NIPP1 varianter ble undersøkt av immunocytochemistry. I likhet med endogene NIPP1, FLAG-merket W.T- og A C-NIPP1 ble lokalisert på det sterkeste til kjernen i EF-behandlede og ubehandlede celler (fig. 4C, celle bilder). Perinukleær farging av FLAG-merket PP1-bindende mutant av NIPP1 (mNIPP1) kan også observeres (fig. 4C, celle bilder).
Neste, vi testet om foreningen av PP1 med NIPP1 påvirker electrotaxis av MTO celler . Uten EF, ble cellemigrasjon orientert tilfeldig for alle celletyper (Fig. 4C, «no EF» tomter). Men MTO celler som uttrykker FLAG-merket NIPP1 varianter viste en rekke forskjellige virkemåter i en EF. 72% ± 3 av foreldre MTO celler migrert cathodally (høyre) og 28% ± 3 anodally (til venstre) og vises en directedness på 0,27 ± 0,05 (fig 4C, jf. Video S7). Overekspresjon av W.T-NIPP1 skiftet katodisk reaksjon på noe anodisk, med bare 35% ± 12 celler migrerer cathodally og 65% ± 12 anodally, og en directedness av -0,12 ± 0,05 (fig 4C, jf. Video S8). Videre overekspresjon av A C-NIPP1 induserte en sterk endring i retnings respons. Kun 16% ± 5 av celler migrert cathodally med en bemerkelsesverdig 84% ± 5 av celler migrerer anodally gi et sterkt tilbake directedness av -0,55 ± 0,04 (fig 4C, jf. Video S9). Interessant, overekspresjon av mNIPP1 påvirket ikke katodisk migrasjon og cellene oppførte seg på samme måte som sperre MTO-celler; 80% ± 13 migrert cathodally og 20% ± 13 anodally, og vist en sterk katodisk directedness på 0,52 ± 0,1 (fig 4C, jf. Video S10).
Disse resultatene viser at kontrollen av retnings migrasjon av NIPP1 avhenger på sin tilknytning til PP1. Når NIPP1 ble overexpressed og i stand til å binde PP1, den katodisk migrasjon skiftet til litt anodisk. Videre induksjon av en konstitutivt aktiv PP1 /NIPP1 holoenzyme indusert en enda sterkere anodisk reaksjon. Men PP1-bindende mutant av NIPP1 forårsaket katodisk migrasjon, i likhet med foreldre celler.
PP1 /NIPP1 Styrer sentrosomen Positioning under Migration
En korrelasjon mellom posisjonen til sentrosomen og retning av celle migrasjon har blitt observert i flere celletyper [35]. I mange tilfeller er det sentrosomen er plassert bak den fremre kant og foran kjernen. Derfor vi neste forsøkte å underbygge resultatene fra måleretnings responsen i MTO celler som overuttrykker FLAG-merket NIPP1 variantene ved å utforske om det var en sammenheng mellom posisjonen til sentrosomen og retning av celle bevegelse i MTO celler. I MTO-celler (ingen EF) centrosomes ble plassert tilfeldig (Fig. 5). Centrosomes av foreldre celler i en EF polarisert cathodally (Polarisering indeks (PI) = 0,46 (se eksperimentelle prosedyrer) Fig. 5). Imidlertid, celler som overuttrykker W.T-NIPP1 viste nesten den samme fordeling av centrosomes mot katoden og anoden (PI = -0,09, fig. 5). Forstyrrelse av EF-indusert katodisk centrosomal polarisasjonen i celler overuttrykkende WT-NIPP1 var avhengig PP1 binding til NIPP1 fordi celler som overuttrykker mNIPP1 polarisert sine centrosomes mot katoden (PI = 0,77), som gjorde det parentale celler (PI = 0,46, Fig. 5) . Intriguingly, induksjon av en konstitutivt aktiv PP1 /NIPP1 holoenzyme induserte både en sterk anodisk polarisering av centrosomes (PI = -0,23) og sterk anodisk migrering av celler (fig. 4C, 5). Disse funn viser at posisjoneringen av den sentrosomen under trekket speiler retnings migrasjon i HeLa-celler. Viktigst, tyder dette på data som foreningen av PP1 med NIPP1 styrer bryteren til anodisk sentrosomen polarisering og anodisk migrasjon, som sannsynligvis gjenspeiler engasjement av lignende cytoskeletal maskiner i begge prosessene.
A. En DC EF polariserer centrosomes til katoden i paren MTO-celler som ses ved å telle cellene i 5 områder, topp (t), venstre (katode i EF-behandlede celler), bunn (b), til venstre (anode i EF-behandlede celler ) og sentrum av kjernen (merket som en hvit prikk). B. Foreldre celler og mNIPP1 celler posisjonere sine centrosomes cathodally i en EF, mens overekspresjon av W.T-NIPP1 forstyrrer katodisk centrosomal polarisering og overekspresjon av A C-NIPP1 skifter katodisk polarisering av centrosomes til anodisk. 100 celler ble telt i hvert enkelt tilfelle, og resultatene er uttrykt som prosent.
Hemming av Cdc42 Snur NIPP1-indusert anodisk Migrasjon og Centrosomal Polarisering
Effektene av NIPP1 på dannelsen av filopodia (fig. 2), retningscellevandring (fig. 4C) og sentrosomen posisjonering i et fysiologisk EF (fig. 5) er avhengig av PP1. Interessant nok et genom-wide Profilene på MTO-celler avdekket at NIPP1 også påvirker ekspresjonen av mange gener i en PP1 avhengig måte [30]. Det er vel etablert at GTPase Cdc42 styrer filopodial forlengelse og sentrosomen posisjonering i migrerende celler [36] – [38], og at retnings migrering av corneale epitel-celler i respons til en DC-EF styres av et Cdc42 /Rho-bryteren [39 ]. Sammen er disse dataene føre til fristende hypotesen om at NIPP1-indusert anodisk polarisering medieres ved å signalisere gjennom Cdc42. For å teste dette begrepet, vi først analysert i listen av gener som er signifikant oppregulert ved overekspresjon av WT-NIPP1 eller A C-NIPP1, men ikke ved mNIPP1, alt i forhold til den paren MTO-cellelinjen [30] og upubliserte data (se material og metoder). Interessant, har vi funnet 24 gener som er involvert i cytoskeletal dynamikk, celle-matrise interaksjoner og Cdc42 vei, og aktiveres av overekspresjon av WT-NIPP1 eller A C-NIPP1, men ikke ved mNIPP1 (tabell 1).
Deretter målte vi Cdc42 GTPase-aktivitet i MTO-celler i en fysiologisk EF og kontrollert hvorvidt den målte aktivitet ble inhibert ved den spesifikke og celle-gjennomtrengelig Cdc42 GTPase-inhibitor ML141 (CID2950007) [40]. Vi fant ut at en DC EF induserer en liten, men signifikant økning i Cdc42 GTPase aktivitet i alle MTO-celler (fig 6A, p. 0,001), og at behandling av disse cellene med 10 mm ML141 fullstendig avskaffet Cdc42 GTPase aktivitet (p-verdier sammenligne prøvene i fravær og nærvær av ML141 var i alle tilfeller 0,01). Interessant, hemming av Cdc42 påvirket ikke katodisk migrasjon av foreldre celler (directedness = 0,42 ± 0,06, Fig. 6B, se video S11). Imidlertid ble reversering i EF-ledet migrering av overekspresjon av W.T-NIPP1 gjenvunnet ved inhibering av Cdc42 (directedness = 0,29 ± 0,05, Fig. 6B; se video S12). Tilsvarende EF eksponert A C-NIPP1 celler, som vandrer anodally, tapte dette svaret når Cdc42 ble hemmet med ML141 og viste selv en moderat katodisk reaksjon (directedness = 0.2 ± 0.1, Fig. 6B, se video S13). EF-stimulering av disse celler (+ ML141) fremmes dannelsen av stress fibre (data ikke vist) og indusert cellespredning og rusket sammen med blebbing av aktin cytoskjelettet (data ikke vist). I mange tilfeller hvor sterk rusket ble observert, ble cellene løsnet. En økning i sub-populasjon G1 (døde celler) i ML141-forbehandlet A C-NIPP1 celler (bestemt ved flowcytometri), kan muligens forklare den lave migrasjon og løsgjøring observert i disse cellene. I kontrast, gjorde ML141 ikke føre til en defekt i levedyktighet av foreldre, mNIPP1 og W.T-NIPP1 celler (fig. S1).
A. Effekt av ML141 på Cdc42 GTPase aktivitet i ustimulerte celler dyrket i fullstendig medium og i EF-stimulerte MTO celler som overuttrykker flagget-NIPP1 proteinvarianter. Nivåer av Cdc42-GTP fastsatt av G-LISA foreldre, W.T-NIPP1, A C-NIPP1 og mRATA celler i fravær eller nærvær av DC EF og i celler pre-behandlet med 10 mm av ML141 før elektrisk stimulering.
p
verdier foreldre til W.T-NIPP1 og foreldre til A C-NIPP1 i fullstendig medium var 0,1 og 0,01, henholdsvis;
p
verdier sammenligne prøvene i fravær og nærvær av ML141 var i alle tilfeller og 0,01. B. Cdc42 hemming redder katodisk polarisering og dette korrelerer med sentrosomen posisjonering. Directedness verdier for migrering av EF-behandlede celler inkubert med ML141. Cdc42 hemming redder den positive celle directedness redusert med W.T-NIPP1 overekspresjon. Den sterkt negative directedness verdi vises ved A C-NIPP1 celler blir nærmere 0 når cellene forbehandlet med Cdc42 hemmer. For forenkling directedness verdier i fravær av EF av foreldre, W.T-NIPP1, A C-NIPP1, og mNIPP1 med og uten ML141 ikke er tatt med i diagrammet. Disse var, uten ML141, -0,07 ± 0,04; 0,05 ± 0,09; -0,08 ± 0,05 og -0,01 ± 0,04, henholdsvis; med ML141 var -0,07 ± 0,04; 0,09 ± 0,05; -0,07 ± 0,05 og -0,01 ± 0,04, henholdsvis. I fravær av EF-verdier var i alle tilfeller meget nær 0 og forskjeller mellom de fire linjene ikke var statistisk signifikant i noen av tilfellene. Data ble kvantifisert fra minst tre forsøk. Feil barer er S.E.M.
p
verdier for signifikante forskjeller i directedness vises. Polarisering indeks av centrosomes beregnet som beskrevet i materialer og metoder. Polarisering indeks av WT-NIPP1 og A C-NIPP1 celler blir lik den polariseringsindeksen av foreldrenes celler når cellene behandles med Cdc42 inhibitor ML141.
Hemming av Cdc42 GTPase i celler overekspresjon NIPP1 men ute av stand til å binde PP1 (mNIPP1) påvirket ikke deres sterke katodisk migrasjon (directedness = 0,57 ± 0,03, fig. 6B, se video S14). Disse resultatene viser klart at bryteren i retning av EF-indusert migrering forårsaket av overekspresjon av NIPP1 avhenger av foreningen av NIPP1 med PP1 og at det formidles av Cdc42 GTPase aktivitet.
Vi har også undersøkt om hemming av Cdc42 i MTO-celler kunne gjenvinne polarisasjonen av centrosomes mot katoden i WT-NIPP1 og A C-NIPP1 celler. Vi viser at Cdc42 hemming økte centrosomal PI av foreldre celler til nivåer sammenlignes med de som ble observert i mNIPP1 celler (PI = 0,76 i begge tilfeller), utvinnes katodisk centrosomal polarisering i WT-NIPP1 celler (PI = 0,59) og mest påfallende, indusert sterk polarisasjon av centrosomes mot katoden i A C-NIPP1 celler (PI = 0,62) (fig. 6B). Disse funnene tyder på at EF-indusert centrosomal polarisering mot katoden er Cdc42 GTPase uavhengig. Men anodisk polarisering av centrosomes observert i WT-NIPP1 og A C-NIPP1 celler krever både sin tilknytning PP1 og Cdc42 GTPase aktivitet.
Diskusjoner
Konkret har vi funnet at både PP1 og NIPP1 positivt
