Abstract
Isothiocyanates fra planter i størrelsesorden
korsblomstordenen
anses lovende kreft kjemoterapeutiske fytokjemikalier . Imidlertid har deres selektiv cytotoksisitet på leverkreft er knapt undersøkt. Derfor, i denne studien, vi systematisk studert kjemoterapeutiske potens av 4-methylthiobutyl isothiocyanate (MTBITC). Selektiv toksisitet ble undersøkt ved å sammenligne dens effekt på leverkreftceller og deres kjemoresistent subpopulasjoner av normale primære hepatocytter og levervev skiver. I tillegg, i en første vurdering ble
in vivo
toleranse av MTBITC undersøkt hos mus. Vekst arrest i G2 /M og apoptoseinduksjon var tydelig i alle
in vitro
kreft modeller behandlet med MTBITC, inkludert populasjoner med kreft initiere egenskaper. Dette ble funnet uavhengig fra TP53; imidlertid celledød ble forsinket i p53-infiserte celler sammenlignet med vill-type p53-celler som var sannsynligvis på grunn av differensiell BH3 bare genregulering i. e. Noxa og dens antagonist A1. I normale hepatocytter, ikke apoptose eller nekrose kunne påvises etter gjentatt administrering av opp til 50 uM MTBITC. I mus, oralt tilført MTBITC ble godt tolerert over 18 dager med behandling i opp til 50 mg /kg /dag, den høyeste testede dosen. Som konklusjon, kunne vi viser her at den drepende effekten av MTBITC har en klar selektivitet for kreftceller enn normale leverceller og dets cytotoksisitet gjelder også for kjemoresistent kreftceller initiering. Vår studie kan tjene for en bedre forståelse av celle egenskaper isothiocyanates på humane lever-avledet kreftceller
Citation. Lamy E, Hertrampf A, Herz C, Schüler J, Erlacher M, Bertele D, et al . (2013) Preklinisk Evaluering av fire-Methylthiobutyl Isothiocyanate på leverkreft og kreft stamceller med ulike p53 Status. PLoS ONE åtte (8): e70846. doi: 10,1371 /journal.pone.0070846
Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, Storbritannia
mottatt: 7 mai 2013; Godkjent: 23 juni 2013; Publisert: 02.08.2013
Copyright: © 2013 Lamy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. EL er finansiert av en akademisk stipend fra European Social Fond og departementet for vitenskap, forskning og kunst Baden-Württemberg, Tyskland. A. B. ble støttet for denne studien av en bevilgning fra Alexander von Humboldt Foundation Fellowship for erfarne forskere. Artikkelen behandlingstillegg ble finansiert av den tyske Research Foundation (DFG) og Albert Ludwig University, Freiburg i Funding Programme Open Access-publisering. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Torsten Giesemann og Julia Schueler er lønnede ansatte i Oncotest GmbH. Dette sysselsetting endrer ikke sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
leverkreft (HCC) er den vanligste kreft i fordøyelsessystemet i Sørøst-Asia og Afrika sør for Sahara; økt forekomst blir også lagt merke til i den industrialiserte verden [1]. Prognosen for pasienter med større eller multifokal HCC er dårlig, med det 5 års overlevelse er mindre enn 5% [2]. Dette er hovedsakelig på grunn av non-respons på kjemoterapi og strålebehandling i behandling av HCC og nedsatt TP53 funksjonen har blitt identifisert som viktig faktor for denne [3]. TP53 er en sentral aktør i vekst og apoptose [4] og en av de mest muterte tumorsuppressorgener i HCC [5]. I tillegg har konseptet at svært behandlingsresistente kreftstamceller (tumor-initiering celler, TIC) spiller en sentral rolle i patogenesen av HCC nylig fanget mye oppmerksomhet. TIC er i stand til selv-fornyende, differensierende, og opprettholde tumorvekst og heterogenitet. Vanlige antikreftbehandlinger slik som stråling og kjemoterapi ikke utrydde de fleste av svært motstandsdyktig TIC [6]. Således, etter alternative behandlingsstrategier som effektivt påvirker disse undergruppene, for derved å overvinne tumorresistens og ikke er avhengige av intakt p53 for kreftcelledreping er av største viktighet [7].
Isothiocyanates (ITC) fra planter av for
korsblomstordenen
er i dag av stor interesse på grunn av deres potensielle anvendelse i forebygging og behandling av kreft. Mange undersøkelser viser at naturlig forekommende ITC og deres syntetiske analoger forsinke eller hemme tumorcellevekst, både
in vitro Hotell og
in vivo product: [8], [9]. Enda viktigere er det vist nylig at ITC kan undertrykke aldehyddehydrogenase (ALDH) -positivt TIC av brystkreft [10] og prostata [11]. Men effekten av ITC mot TIC av andre organer, inkludert lever, er ennå ikke bestemt. Generelt, informasjon om den cytotoksiske og cytostatiske potensialet til ITC på tumorceller i leveren er knappe [12] – [14]. Det er en forutsetning at potensielle terapeutiske midler viser lav toksisitet til vanlig svulst omkringliggende vev, men bare svært begrenset informasjon foreligger om virkningene av ITC på friskt vev. Her beskriver vi antineoplastisk aktivitet av 4-methylthiobutyl isotiocyanat (MTBITC, erucin) og dens selektiv dreping av tumorceller og TIC via en p53-uavhengig mekanisme. MTBITC er hentet fra enzymatisk hydrolyse av glucoerucin, isolert fra rakettplantearter (
eruca sativa Mill
. Og
diplotaxis tenuifolia L
.). Videre er det avledet
in vivo
av metabolsk reduksjon av isothiocyanate Sulforafane, som er karakteristisk for brokkoli (
kål
L.). For våre studier, brukte vi et sett med
in vitro
modeller som består av HCC cellelinjer, kjemoresistent TIC, primær normale hepatocytter og skiver presisjon snitt levervev (PCLS) stammer fra pasienter til å studere kreft selektiv cytotoksisitet av MTBITC . Våre funn ble deretter ytterligere underbygget av mekanistiske studier på differensial TP53 pathway aktivering på MTBITC behandling. Basert på vår
in vitro
resultatene vi endelig undersøkt toleranse av MTBITC i en musemodell.
Materialer og metoder
Etisk Erklæring
Normal hepatocytter var innhentet fra pasienter etter deres skriftlig informert samtykke fra Dept. of Surgery, Freiburg University Medical Center, Tyskland. Denne delen ble godkjent av etisk komité ved Universitetet i Freiburg (Ethik-Kommision der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg /Ethic provisjon av Albert-Ludwigs-Universität Freiburg). For vev slicing eksperimenter, human lever og leversvulstene resectates ble oppnådd fra pasienter etter deres skriftlig informert samtykke fra Dept. of General, Visceral Transplant Surgery, universitetssykehus, Tübingen, Tyskland. Studien protokollen ble godkjent av den lokale etiske komité (Ethik-Kommision an der medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Ethic provisjon av det medisinske fakultetet ved Eberhard-Karls-University og University Clinic Hospital Tübingen). Dyreforsøk ble gjennomført i henhold til retningslinjene for den tyske dyrevernloven (Tierschutzgesetz) og under tillatelse tallene i Regierungspräsidium Freiburg, Tyskland G-10/05 og 35 til 9185,64 /1. Dyrehelse ble undersøkt før randomisering å sikre at bare dyr uten noen symptomer på sykdom ble valgt ut til å gå inn testprosedyrer. I løpet av forsøkene ble dyrene overvåkes to ganger daglig angående generelle tilstand, mat og vann.
Chemicals
DMSO, verapamil-hydroklorid, deksametason, erysoline, etanol, propidiumjodid (PI) og nøytral rød (NR) ble kjøpt fra Sigma Aldrich (Steinheim, Tyskland). Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM), kalvefosterserum (FCS), trypsin 10 x (25 mg /ml), trypsin-EDTA 10 x (5 mg /ml), Hanks balanserte saltbuffer (HBSS, uten Ca og Mg), og fosfatbufret saltvann (PBS uten Ca og Mg) var fra PAA Laboratories GmbH (Coelbe, Tyskland). Penicillin-streptomycin (P /S) oppløsning og Hoechst 33342-oppløsning (10 mg /ml), RPMI 1640, insulin-transferrin-selen (ITS), Collagenase type IV, og 5,5 «, 6,6»-tetraklor-1 , 1 «, 3,3»-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid (JC-1) var fra Life Technologies Invitrogen (Darmstadt, Tyskland), WST-1 reagens fra Roche (Mannheim, Tyskland). Accumax ble kjøpt fra eBioscience (Frankfurt, Tyskland), Collagen G fra Schubert Weiss (München, Tyskland), Collage CLS II fra Biochrom (Berlin, Tyskland) og EDTA fra Serva Electrophoresis (Heidelberg, Tyskland). CaCl
2, Glukose, EGTA, Eddiksyre (renhet 100%), ble Roti®-Fenol /kloroform /Isoamylalkohol og kloroform /Isoamylalkohol ervervet fra Carl Roth (Karlsruhe, Tyskland), camptothecin (CPT) fra Tocris (Eching, Tyskland), Caspase 3/7 GLO reagens fra Promega (Mannheim, Tyskland) og Triton X-100 fra Merck (Mannheim, Tyskland). Rompun 2%, og xylazinchloride ble kjøpt fra Bayer (Leverkusen, Tyskland), ketanest 10% og ketaminiumchloride fra Essex Tierarznei (München, Tyskland). 4-methylthiobutyl isothiocyanate (MTBITC, erucin) ble syntetisert ved Inst. for organisk kjemi, Universitetet i Giessen, Tyskland som beskrevet tidligere [15]. Valinomycin ble kjøpt fra Fluka, (Buchs, Sveits). ITC ble oppløst i sterilt DMSO.
HCC cellelinjer, isolasjon og dyrking av HCC explants og Hepatocytter
HCC cellelinjer.
HepG2 (wt-53) og Hep3B ( null-p53) cellelinjer ble oppnådd fra den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), Braunschweig, Tyskland. Huh-7 celler (mut-p53) opprinnelig etablert av Nakabayashi et al. [16] ble vennlig levert av H. Blum (University Medical Center Freiburg, Tyskland). Cellene ble dyrket i lav glukose DMEM supplementert med 15% (HepG2) eller 10% (Huh7, Hep3B) FCS og 1% P /S i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C inntil 70% av konfluens og deretter høstet med trypsin. Cellelinje Verifikasjonen ble gjort ved mikroskopisk sjekke morfologi av cellene og utføre vekstkurve analyse på en jevnlig basis. Kun celler i passasje nummer 4-10 ble anvendt. Cellekulturen ble videre testet negativt for mycoplasma forurensning.
HCC explants.
Menneskelig levertumor engraftments (LIXF, leverkreft xenograft Freiburg), opprinnelig etablert av Oncotest GmbH, Tyskland, ble dyrket subkutant i nakne mus som beskrevet andre steder [17]. Explants ble sendt til vårt laboratorium umiddelbart etter operasjonen, unngå kjøling eller andre manipulasjoner. Prosedyren for å forberede kulturer var i samsvar med Patrawala
et al.
[18].
Primære humane hepatocytter.
Normal hepatocytter ble isolert innen 2 timer. Vurdering av ikke-tumorous leveren parenchyma ble utført av en erfaren patolog med kompetanse i leveren patologi. Hepatocytter ble isolert ved anvendelse av den to-trinns kollagenase perfusjon teknikk i henhold til en modifisert protokoll fra guguen-Guillouzo
et al.
[19] og Strom
et al.
[20]. Cellene ble til slutt resuspendert i RPMI-1640 supplert med 15% FCS, 2 mM L-glutamin 1% P /S, 1% ITS, 100 nM deksametason og dyrket i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C for 20 timer.
Murine hepatocytter.
Murine hepatocytter ble ferskt isolert med en lignende perfusjon teknikk beskrevet for humane hepatocytter og dyrket i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C for 10 timer.
Precision-kutt Tissue Kutting (PCLS)
Kutting startet innen en time etter reseksjon på en vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Tyskland) som beskrevet tidligere [21] Slices ble inkubert i oksygenert Williams E medium inneholdende 25 mM glukose og 50 ug /ml gentamycin (Lonza Bioscience, Verviers, Belgia) i en oksygenert atmosfære (80% oksygen, 5% CO
2).
Bestemmelse av Drug virkning på kreftceller
for forsøkene, kreft celler ble sådd, supplert med kulturmedium og inkubert i 48 timer ved 37 ° C. Deretter ble subsammenflytende cellene eksponert for ITC i 24 timer til 96 timer. For eksponering 24 timer, kulturen medium, ble inneholder ITC erstattes hver 24 h
Påvisning av Cytotoksisitet
Nøytral rød oppbevaring analysen
nøytral rød oppbevaring analysen.. bestemmer akkumulering av nøytralrødt farvestoff i lysosomene til levedyktige, uskadde celler som ble anvendt som en annen parameter for deteksjon av cytostase /cytotoksisitet. Følgende forbindelse eksponering, ble celler inkubert i 3 timer med NR fargestoff (50 ug /ml) oppløst i den tilsvarende dyrkningsmediet. Cellene ble deretter vasket forsiktig med forvarmet PBS og 150 ul medium fiksering (EtOH: AcCOOH: avionisert vann, 50% 1%: 49%) ble tilsatt etterfulgt av forsiktig risting i 20 min. Absorbansen ble registrert ved 540 nm ved hjelp av en Tecan mikroplateleser.
Påvisning av apoptose og veksthemming
caspase 3/7 cleavage analysen.
Induksjon av apoptose i cellelinjer og primære celler ble bestemt ved hjelp av Caspase3 /7-Glo analyse (Promega, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
apoptose i levervev skiver ble bestemt ved inkubasjon med 50 mikrometer av
N
-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-aminomethylcoumarin (Ac-DEVD-AMC; Biomol, Hamburg, Tyskland) i analysebuffer (50 mM HEPES, pH 7,4, 1% sukrose, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT). Underlaget cleavage ble målt kinetisk ved spektrofluorimetri. Kaspase 3/7 aktivitet ble bestemt som hellingen av den resulterende lineære regresjoner og uttrykt i vilkårlige fluorescensenheter pr minutt.
Vurdering av Mitokondriell membranpotensialet (MMP).
For deteksjon av endringer i MMP på celle-nivået, det lipofile kation JC-1 ble anvendt som beskrevet andre steder [14].
SubG1 DNA-innhold og cellesyklusfordeling.
for påvisning av cellesyklusfordelingen , PI farging av DNA etter fiksering ble anvendt, som beskrevet andre steder [14].
Påvisning av Nekrose
propidium jodid (PI) opptaksanalyse.
analysen er basert på kvantifisering av PI farget nekrotiske celler. Derfor, etter forbindelse eksponering, PI (2 ug /ml) ble tilsatt til hver brønn i en 96-brønners mikrotiterplate i 5 min ved RT under kontinuerlig risting. Deretter ble platene sentrifugert ved 189 g (3 min, RT). Mengden av intracellulært PI fluorescens ble målt ved anvendelse av en Tecan mikroplateavleser ved Ex.:. 525 nm /nm Em595
LDH-frigivelse assay for vevssnitt
Prosentandelen av laktat-dehydrogenase (LDH) slipper i supernatanten som surrogat for membranintegritet ble bestemt ved bruk av LDH Mono-P analysen (Analyticon, Lichtenfels, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Mengden av LDH som blir frigjort i supernatanten ble bestemt og normalisert til proteininnholdet i individuelle stykker, noe som ble bestemt ved en Pierce BCA-analyse (Thermo Scientific, Dreieich, Tyskland).
Isolering og analyse av side Population (SP ) celler
SP og ikke-SP celler ble analysert og isolert fra Huh7 celler som beskrevet før [22]. Kort sagt ble Huh7-celler trypsinert, telles og en million celler /ml ble resuspendert i DMEM w /o fenol rød inneholdende 2% FCS og 10 mM HEPES. Cellene ble farget med 20 ug /ml Hoechst 33342 alene eller sammen med verapamil (50 uM) ved 37 ° C i 90 min. Deretter ble cellene vasket en gang med iskald HBSS inneholdende 2% FCS og 10 mM HEPES. Analyse og sortering av SP og ikke-SP-celler ble utført ved hjelp MoFlo (DAKOCytomation). Etterpå ble cellene vasket med HBSS, telt og utsådd i kulturskåler i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter eksponert for MTBITC og deretter anvendt for analyse.
Påvisning av Aldehydedehydrogenase
Ekspresjon av enzymet Aldehydedehydrogenase (ALDH) ble analysert ved anvendelse av ALDEFLUOR Kit fra Stemcell Technologies (Grenoble, Frankrike) i henhold til produksjon protokoll. Som positiv kontroll, ALDH inhibitor DEAB, som ble gitt i settet, ble brukt.
Cell Migration (scratch) Analyse
scratch Analysen ble utført som beskrevet andre steder [23]. Lys mikroskopiske bilder anskaffet for hver prøve ble analysert kvantitativt ved hjelp av databehandling programvare Bilde J (https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html). For hvert bilde, ble avstandene mellom den ene siden av bunnen og den andre målt. Ved å sammenligne bildene fra tid 0 til siste tidspunkt (72 h) avstanden til hver scratch nedleggelse ble innhentet og halveringstiden for gab nedleggelse beregnes.
Cell Synkronisering av Serum deprivasjon og DMSO
for cellesynkronisering ved G0 /G1, ble mediet fjernet fra HepG2-cellene og erstattet med medium uten FCS i 96 timer. Etter den tid, ble cellene enten utsatt for DMSO eller MTBITC i ytterligere 24 timer i medium som inneholder forskjellige FCS konsentrasjoner. Cellene ble deretter høstet og analysert for deres DNA-innhold fordeling.
I et andre sett av eksperimenter, ble 2% DMSO tilsatt til kulturmediet av vedheftende økende HepG2-celler i 72 timer. Deretter ble cellene forsynes med friskt kulturmedium inneholdende enten DMSO eller MTBITC i 24 timer, deretter høstet og analysert for deres DNA-innhold fordeling.
In vivo
Toleranse for MTBITC
Crl: NU-Foxn1mice (hårløse mus) ble kjøpt fra Charles River, Erkrath, Tyskland og fikk i microisolators i barriere forhold. Behandlingen ble utført av daglig oralt inntak med bil eller MTBITC suspendert i bilen i 18 dager.
Gene Expression analyse av p53 hjelp Kvantitativ Real Time PCR
Total RNA ble isolert med RNeasy mini Isolation kit fra Qiagen (Hilden, Tyskland), etterfulgt av et rensetrinn ved hjelp av RNase-fri DNase kit fra Qiagen (Hilden, Tyskland). Totalt 2 mikrogram av RNA fra hver prøve ble ansatt for cDNA produksjon ved hjelp av First Strand cDNA Synthesis Kit fra Fermentas (St. Leon-Rot, Tyskland). CDNA-prøvene ble deretter fortynnet 1:02 til 1:05 og forsterket med LightCycler Faststart DNA Master
PLUS SYBR grønn I Kit fra Roche (Mannheim, Tyskland). p53 cDNA ble amplifisert ved hjelp av 5′-følelse CCTTCCCAGAAAACCTACCA-3 «, og 5′-antisense TCATAG GGCACCACCACACT-3′ oligonukleotider som frembringer et 371 bp fragment. Referanse genet beta-mikroglobulin cDNA ble amplifisert ved hjelp av 5»-følelse AGGCTATCC AGCGTACTCCA-3 «og 5′-antisens ACGGCAGGCATACTCATCTT-3» oligonukleotider som frembringer et 248 bp fragment. Alle primerpar kryss intron /ekson grenser og dermed gjør PCR produktene representerer ikke genomisk DNA forurensning. PCR-betingelsene var: første 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 10 s, 59 ° C i 10 s og 72 ° C i 30 sek. Amplifiseringsproduktene ble kvantifisert med programvaren LightCycler 2,0 fra Roche, Mannheim, Tyskland, ved å fremstille en standardkurve ved anvendelse av kjente fortynninger av standard cDNA. For å normalisere p53-mRNA-ekspresjon for sample-til-sample forskjeller i RNA-inngang, RNA kvalitet, og revers transkriptase effektivitet, ble referansegenet beta-mikroglobulin amplifisert i parallell. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Gene Expression analyse ved hjelp av en signalveien Array
RNA isolert fra 10
6 celler per prøve ble utført med RT
2 qPCR -Grade RNA Isolation Kit (SABioscience, Frederick, Maryland, USA). cDNA ble syntetisert ved hjelp av RT
2 PCR Array First Strand Synthesis Kit (SABioscience, Frederick, Maryland, USA). Kvantitativ real-time PCR av den menneskelige p53 signalveien RT
2 Profiler ™ Array (katalog nr .: PAHS-027, SABioscience, Frederick, Maryland, USA) ble gjort ved hjelp av en MyiQ ensfarget Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, München, Tyskland). For dataanalyse web-baserte RT
2 Profiler ™ PCR Array dataanalyse ble brukt. Data ble analysert ved «to
-ΔΔCt metoden» ved hjelp av programvare som leveres av produsenten. For hvert gen, ble fold-endring beregnes som forskjellen i genekspresjon mellom to grupper. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittet for 3 uavhengige eksperimenter.
Protein Analyse ved Immunoblotting
Proteinkonsentrasjonen ble bestemt som beskrevet av Bradford [24]. For immunoblotting ble 20 ug av proteinet blandes med ferdige SDS-prøvebuffer inneholdende, supplert med 0,5% β-merkaptoetanol. Elektroforese ble utført i henhold til metoden til Laemmli [25]. Gelen ble så overført til en nitrocellulosemembran ved tank-blotting. De uspesifikke bindingsseter ble blokkert med 5% lettmelk i TBS /T og inkubert med primære, og deretter pepperrot peroksidase (HRP) -merket sekundært antistoff i 1 time eller over natt. Etter antistoff inkubering ble proteiner av interesse påvist ved kjemiluminescens teknikk. Et digitalt bilde av western blot ble tatt av et CCD-kamera. Størrelse tilnærmelser ble tatt ved å sammenligne de fargede båndene som for et protein standard lastes under elektroforese. Prosessen ble gjentatt for den strukturelle protein β-aktin.
stanse av p53 ved RNAi
HepG2-celler ble høstet ved trypsination og 2,5 x 10
5-celler ble underkastet revers transfeksjon med Transpass R1 (nr .: M2551S) fra NEB (Frankfurt a. M., Tyskland). For transfeksjon, ble 10 ul TransPass R1 blandet med 240 ul DMEM og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur før tilsetning av siRNA oligomerer (p53 snarvei siRNA-miks, nr .: N2011S, NEB, Frankfurt en M., Tyskland,. Få tak siRNA katt. . no sc-37007, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, USA; fluorescein konjugert kontroll siRNA, nr .: N2100S, NEB, Frankfurt en M., Tyskland) ved en sluttkonsentrasjon på 25 nM, etterfulgt av en annen inkuberingstrinn ved RT. i 15 min 250 ul av transfeksjon komplekset ble deretter overført til hver brønn og HepG2-celler inneholdende DMEM + 15% FCS w /o antibiotika ble deretter inkubert med komplekset i 24 timer under standard cellekulturbetingelser. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS og supplert med friskt DMEM inneholdende 15% FCS i ytterligere 24 timer før eksponering til teststoffet i 24 timer.
RT-MLPA og qPCR
RT- MLPA ble brukt til å analysere mRNA ekspresjon av Bcl-2-familiemedlemmer. RNA fra HepG2 og Hep3B celler ble isolert som beskrevet ovenfor. RT-MLPA (MRC Holland, kit RM002, R011-C1) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet spesifikke mRNA ble reverstranskribert inn i cDNA og bundet av to oligonukleotider følgelig ligert ved en varmestabil ligase. Hver sonde gir opphav til et amplifikasjonsprodukt av unike lengde separert ved kapillær-sekvense (Genescan). Analysen ble utført med GeneMapper (Applied Biosystems). Summen av alle toppdata ble satt til 100% for å normalisere for variasjoner mellom forskjellige prøver, og enkle topper ble beregnet i forhold til 100%. Analyse av mRNA regulering av Bcl-2 og BMF var ikke mulig for tekniske årsaker.
Data Analysis
Resultatene ble beregnet ved hjelp Graphpad Prism 5.0-programvaren (La Jolla, California). Median veksthemmende konsentrasjon (IC50) ble beregnet verdi etter normalisering av respons og logaritmiske transformasjon med den følgende ligning: Y = 100 /(1 + 10
∧ ((LogIC50-X) * hillslope)). Variansanalyse mellom grupper ble utført ved enveis ANOVA og signifikans av forskjell mellom kontroll- og behandlingsgruppene ble analysert ved hjelp av Dunnetts multiple sammenligningstest. Forskjellene med p≤0.05 (*) eller p≤0.01 (**) ble vurdert som statistisk signifikant.
Resultater
Cytotoksisitet av ITC i levertumorceller sammenlignet med vanlig Hepatocytter
Vi brukte NR oppbevaring analyse for vurdering av MTBITC cytotoksisitet på kreftceller i forhold til normale hepatocytter. Denne analysen har blitt rapportert så høyt sensitive cytotoksisitet parameter [26]. En konsentrasjonsavhengig levedyktighet tap, som bestemt ved svekket lysosomal NR retensjonen evne ble observert i alle de testede cancerceller etter MTBITC behandling i 24 timer (figur 1A). I motsetning til i humane hepatocytter ble det ikke relevant levedyktighet tap sett i løpet av 24-72 timer behandlet med 50 M MTBITC (figur 1b). I murine hepatocytter, MTBITC utløst noen prosesser utvide nøytral-rød akkumulere kapasitet Lysosomers etter 72 timer med MTBITC behandling (figur 1b). Basert på resultatene utledet etter 24 timer MTBTIC behandling, ble IC50-verdier beregnet ved 23.18 um (HepG2), 20,89 um (Huh7), 31.97 um (Hep3B), 13.11 um (LIXF), 72.09 (humane hepatocytter) og 47.81 (murine hepatocytter) .
MTBITC behandling selektivt svekker celleoverlevelse av levertumorceller (a) sammenlignet med primære hepatocytter (b). Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av NR oppbevaring analysen etter eksponering for MTBITC for 24-72 timer. Resultatene ble uttrykt i forhold til kontroll (0,1% DMSO), barer er gjennomsnittlig + SD, (antall uavhengige forsøk er gitt nedenfor tallene). Positiv kontroll (+), 0,01% Triton X-100. ** ≤p 0,01 i forhold til DMSO
Vekst og apoptose induksjon i Human HCC celler og normale Hepatocytter /PCLS
For å vurdere innholdet av levedyktighet fall observert i MTBITC-. stresset HCC celler, vi søkt å fastslå om dette var på grunn av en stans i cellevekst, apoptotiske eller nekrotiske prosesser (figur 2 og 3). Vi først analysert cellene for caspase 3/7 aktivering som spesifikk apoptose markør. I løpet av 24 timer, MTBITC induserte signifikant apoptose ved 25 pM, men bare i p53-vekt (HepG2-celler); ingen økning kan sees i p53-Mut (Huh7) celler, p53-null (Hep3B) celler eller LIXF (figur 2a). Normale leverceller forble upåvirket av behandlingen, som undersøkt i humane eller murine celler ved 24 timer (figur 2c). Vi kunne ikke finne noen tegn til at MTBITC induserte en nekrotisk reaksjon i maligne eller normale celler, selv på 50 mikrometer, som bestemmes av PI cellefarging (figur 2b og d). Betingelser for gjentatt eksponering (opptil 72 timer), noe som vil være tilfelle etter kjemoterapi, ikke lenger sensitiv friske hepatocytter til apoptose (figur 2c) eller nekrose (figur 2d). Observasjonene er gjort i normale hepatocytter ble ytterligere bekreftet ved hjelp PCLS. Dette
ex vivo
modell gjør det mulig å dekke kompleksiteten av leveren struktur og mangfoldet av metabolske, homeostatisk, endokrine og biotransformasjon funksjoner. Derfor er det bedre reflekterer den høye graden av biologisk organiseringen av organet [27]. Eksponering av PCLS til 25 uM MTBITC ikke øke apoptose (figur 2e) eller nekrose (figur 2f) hastighet i sunt vev, men snarere trykkes det, sammenlignet med kontroll skiver. I motsetning til dette, den positive kontroll, 1 pg /ml aktinomycin D kombinert med 100 ng /ml TNF-indusert lever dyp apoptose (figur 2e).
Virkning av MTBITC på apoptose (a, c, og e) eller nekrose (b, d og f) induksjon i ondartede og friske celler. Distinkt apoptose-induksjon ble vurdert ved hjelp av kaspase 3/7 aktivitet etter behandling med celle MTBITC i 12 til 72 timer. Positiv kontroll (+): 10 uM CPT eller staurosporin (a, c), 1 pg /ml aktinomycin D /100 ng /ml TNF (ActD /TNF) (e). Nekrose induksjon ble kvantifisert ved bruk av spesifikt opptak av PI i isolerte celler (B og D) eller LDH-frigivelse fra PCLS (f). Positiv kontroll (+): 0,2% triton X-100. Resultatene ble uttrykt relativt til oppløsningsmidlet (0,1% DMSO). Barer er gjennomsnittlig + SD, (antall uavhengige forsøk er gitt nedenfor tallene,. Eksperimenter utført på PCLS ble utført i tre eksemplarer).
G2 /M arrest (A til D) og apoptose (e ) induksjon etter behandling av HCC celler med MTBITC, som bestemmes av PI farging av DNA og flowcytometri analyse. Effekt av MTBITC eller 0,1% DMSO (væske) ble bestemt etter 24 timer (LIXF) eller 72 timer (HepG2, Huh7, Hep3B). Barer er gjennomsnittlig + SD (n = 3).
Vi målte effekten av MTBITC på cellesyklus. Den subG1 toppen ble dermed brukt som apoptose indikator. Etter 24 timers eksponering for MTBITC, en sterk konsentrasjonsavhengig G2 /M arrest var tydelig i LIXF (figur 3a) og alle HCC cellelinjer testet, men igjen uten noen klare tegn til apoptose i p53-mut eller p53-null-celler (data ikke vist). Da vår analyse ble utvidet til en 3-dagers periode MTBITC eksponering, som vi allerede hadde etablert som en langvarig MTBITC behandling ikke øke skade friske celler. Som vist i figur 3b-d, G2 /M blokk som holdes under ITC behandling, og dette var i størrelsesorden p53-null-celler p53-mut-celler p53-wt-celler. Selv innen 24 timer, gjorde p53-svekket cellene ikke gjennomgå celledød, 72 t-behandling med MTBITC utløst apoptose i alle cellelinjene testet (figur 3e).
Effekt av MTBITC på TIC Cells
ved siden undersøkte virkningen av MTBITC på kjemoresistent SP-celler, isolert fra Huh7-celler ved hjelp av DNA-bindende fargestoff Hoechst 33342 og flowcytometri. I motsetning til HepG2-cellelinjen, som inneholdt mindre enn 0,3% av SP-celler, inneholdt Huh7 cellelinje SP-celler i en konsentrasjon på ca. 1,5%, og ble derfor brukt for videre eksperimenter (figur 4a). Hensiktsmessig SP diskriminering i Huh7-celler ble utført ved ABC-transportør-inhiberende kontrollforsøk ved bruk av verapamil (figur 4a), som med hell blokkerte Hoechst fargestoff effluks. Karakterisering av de sorterte cellepopulasjoner viste at i) evnen til SP-celler til dyseutstrømningen Hoechst fargestoff er tapt for det meste i løpet av en uke i cellekultur (figur 4a), som demonstrert ved ny analyse av sorterte SP-celler. ii) SP cellene vokste betydelig raskere enn NSP celler under samme behandlingsforhold, som bestemmes etter 72 (figur 4b). iii) Migrering av SP-celler var høyere enn for total Huh7 cellepopulasjon, bestemt ved bunnen av analysen (data ikke vist). Migrasjon ble også brukt som en annen parameter for å undersøke kjemoterapeutiske styrken av MTBITC. Som vist i figur 4c, i løpet av 48 timer, kontrollcellene hadde nesten fullstendig beveget mot åpningen av den nylig skapte gab og lukket «scratch». I motsetning til etablering av komplett celle-celle kontakt var fortsatt ikke tydelig etter 72 timer i MTBITC behandlede celler. Bestemmelse av cellemigrering hastighet viste at under MTBITC behandlings SP-celler er nødvendig 44,1 h for å lukke til gab med 50%, kontrollceller 26,2 timer. Ingen narkotika følsomhet forskjeller når det gjelder veksthemming kunne observeres etter MTBITC behandling mellom SP og NSP celler (figur 4d). Vår videre analyse viste at MTBITC arrestert ikke-SP og SP underfraksjonene i G2 /M og presset dem til programmert celledød, selv om i en mindre grad i SP-celler sammenlignet med sine ikke-SP motstykke (figur 4e og f). Vi neste undersøkte evnen til MTBITC for å redusere mengden av ALDH-positive celler fra HepG2 og Huh7 cellelinjer. Som vist i figur 4g, MTBITC-behandling konsentrasjonsavhengig måte resulterte i en oppheving av denne markør; g.
