Abstract
Resveratrol er en lovende chemopreventive agent som medierer mange cellulære mål som er involvert i kreftsignalveier. p53 har blitt foreslått å spille en rolle i anticancer egenskaper av resveratrol. Vi undersøkte resveratrol-indusert cytotoksisitet på H1299-celler, som er ikke-liten lungecancerceller som har en partiell delesjon av genet som koder for p53-protein. Resultatene for H1299 celler ble sammenlignet med dem for tre cellelinjer som konstitutivt uttrykker villtype p53: brystcancer MCF-7, adenocarcinomic alveolar basal epitel A549 og ikke-liten lungekreft H460. Celleviabilitet analyser avslørte at resveratrol redusert levedyktighet av alle fire av disse cellelinjene i en dose- og tidsavhengig måte. MCF-7, A549 og H460-celler var mer følsomme overfor resveratrol enn det som var H1299-celler når de utsettes for medikamentet i 24 timer ved konsentrasjoner over 100 pM. Resveratrol også økt p53-proteinnivåene i MCF-7-celler uten å endre de p53 mRNA-nivåer, noe som tyder på en post-translasjonell modulering av proteinet. Resveratrol-indusert cytotoksisitet i disse celler ble delvis mediert av p53 og involvert i aktivering av kaspaser 9 og 7 og spaltningen av PARP. I H1299-celler, resveratrol-indusert cytotoksisitet var mindre uttalt og (i motsetning til MCF-7-celler) celledød ble ikke ledsaget av kaspase-aktivering. Disse funn er i overensstemmelse med den observasjon at MCF-7-celler ble positivt merket ved TUNEL etter eksponering for 100 uM resveratrol mens H1299 celler under lignende betingelser ikke ble merket ved TUNEL. Transient transfeksjon av en villtype p53-GFP-genet forårsaket H1299 celler til å bli mer mottakelig for de pro-apoptotiske egenskaper resveratrol, i likhet med funn i p53-positive MCF-7 celler. Våre resultater tyder på en mulig terapeutisk strategi basert på bruk av resveratrol for behandling av tumorer som er typisk ikke svarer til konvensjonell terapi på grunn av tap av normal p53-funksjon
relasjon:. Ferraz da Costa DC, Casanova FA, Quarti J, Malheiros MS, Sanches D, dos Santos PS, et al. (2012) Transient Transfeksjon av en villtype p53 Gene Triggere Resveratrol apoptose i kreftceller. PLoS ONE 7 (11): e48746. doi: 10,1371 /journal.pone.0048746
Redaktør: Waldemar Debinski, Wake Forest University School of Medicine, USA
mottatt: 07.02.2012; Godkjent: 01.10.2012; Publisert: 12.11.2012
Copyright: © 2012 Costa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES); Fundação de Amparo à Pesquisa Carlos Chagas Filho do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ); og Fundação gjøre kreft i Brasil. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er et stort folkehelseproblem på verdensbasis, og antallet kreftrelaterte dødsfall er forventet å doble seg de neste 50 årene [1]. Epidemiologiske bevis tyder på at kostvaner er viktige risikofaktorer knyttet til kreftutvikling, og at fytokjemikalier som finnes naturlig i frukt og grønnsaker kan formidle en rekke tumormål [2], [3]. Kliniske applikasjoner har blitt foreslått for disse kosttilskudd bioaktive molekyler på grunn av sin store evne til å hemme, hente, eller utsette flere kreftfremkallende trinn [4], [5], [6].
Resveratrol (3,5,4 «-trihydroxy-
trans
stilben), som først ble beskrevet i 1940, er en naturlig polyphenol som er funnet i et bredt utvalg av planter, inkludert, druer, bær og peanøtter. Dette molekylet har blitt klassifisert som en phytoalexin fordi det er syntetisert av planter som reaksjon på en rekke miljømessige spenningsforhold som soppinfeksjoner, og UV-stråling [7], [8]. Resveratrol er funnet i både
cis- Hotell og
trans-
stereoisomere former;
trans
isomeren er formen som er knyttet til de fleste av molekylets biologiske aktiviteter. Resveratrol som et diett-forbindelsen har blitt beskrevet som en kraftig middel som er i stand til å forebygge kardiovaskulære, inflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer, inkludert fedme og diabetes [7], [9]. Molekylet er også i stand til å modulere et bredt spekter av molekylære mål, inkludert de som er involvert i kreftsignalveier [8], [10].
kreft potensialet resveratrol ble anerkjent i 1997, da dens evne å hemme alle tre stadier av kreftutvikling (dvs. initiering, markedsføring, og progresjon) ble første gang påvist [10]. Senere studier har vist at molekylet oppviser anticanceraktivitet når de ble testet i forskjellige eksperimentelle modeller [11], [12]. Flere studier har antydet at mekanismene som er ansvarlige for de kjemopreventive egenskapene til molekylet er nært forbundet med sin antioksidant og anti-inflammatoriske egenskaper [13].
resveratrol er knyttet til regulering av flere cellulære veier, inkludert inhibering av kreftfremkallende aktivering, stimulering av kreftfremkallende avgifte enzymer, modulering av proteiner som er involvert i kreftutvikling og apoptose [14], [15], [16], og inhibering av angiogenese [17]. Studier tyder også på at resveratrol kan brukes til å bevisstgjøre svulster til bestemte kreft Kjemoterapeutika legemidler [18]. Kollektivt, disse funnene gitt tilstrekkelig bevis for å utføre kliniske studier undersøke chemopreventive og kjemoterapeutiske egenskaper av denne bioaktive stoffet [4], [12].
p53 er en tumor-suppressor protein som spiller en viktig rolle i å forebygge kreftutvikling ved å fremkalle cellesyklus arrest eller apoptose som svar på gentoksisk stress. Dette proteinet blir regulert primært av ubiquitin ligase MDM2, som binder seg til p53 og er rettet mot den for nedbrytning i proteasomer. Normal p53-funksjon går tapt eller ikke aktiv i omtrent 50% av humane cancere [19], [20], [21], [22].
resveratrol er i stand til å indusere p53-avhengig celledød i JB6 mus epidermal cellelinje [23], og involvering av p53 i anti-kreftfremkallende funksjon av resveratrol er etablert i et bredt spekter av celler [7], [16], [23], [24], [25], [ ,,,0],26]. Flere studier har indikert at apoptose forekommer bare i celler som uttrykker villtype p53, men ikke på p53-mutert eller p53-manglende celler [23], [27]. Den nøyaktige rolle av resveratrol i p53-negative tumorcellelinjer, som kan være resistente mot konvensjonelle kjemoterapeutiske midler som følge av tap av p53-ekspresjon eller funksjon, ikke er blitt grundig undersøkt [28], [29], [30]. Det er viktig å fastslå hvorvidt den transfeksjon av vill-type p53 er i stand til å gjenopprette de pro-apoptotiske virkninger av resveratrol for det formål å vurdere ytterligere genterapiteknikker som tar sikte på å feste en defekt p53 molekyl. Flere studier av p53 genterapi har demonstrert effektiviteten av denne tilnærmingen ikke bare i tumorcellelinjer, men også i kliniske forsøk [31].
I den foreliggende studien undersøkte vi effekten av resveratrol i en cellelinje som bærer en delvis slettet p53-genet, og vi testet hypotesen om at transient transfeksjon av p53 ville føre til disse cellene til å bli i stand til å svare på de pro-apoptotiske egenskaper resveratrol. For direkte å undersøke dette problemet, transfekterte vi H1299 celler, som ikke uttrykker p53-genet, og sammenlignet resultatene med dem som ble oppnådd i MCF-7 human brystcancer, en cellelinje som er blitt grundig undersøkt, og som konstitutivt uttrykker villtype- p53-genet.
Vi fant at transient transfeksjon av villtype p53-GFP-genet fører H1299 celler til å bli mer følsomme for resveratrol og lydhør overfor sine pro-apoptotiske egenskaper, på samme måte som funn i MCF-7 celler. Våre resultater tyder på at anvendelsen av resveratrol, i kombinasjon med andre metoder for å fremme p53-aktivitet i celler, slik som genterapi ved bruk av villtype p53-genet eller kjemikalier som gjenoppretter p53-funksjon, er et lovende ny terapeutisk strategi for behandling av kreft.
Materialer og metoder
1. Reagenser
Alle reagenser brukt i denne studien var av analytisk kvalitet. Annexin V /propidium jodid Apoptose Assay kit, bovint insulin, MTT (3,4,5-dimethiazol-2,5-difenyltetrazoliumbromid), phenylarsine oksyd, pifithrin-α, PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), PRIMA-1, protease-inhibitorer cocktail (# 8340), og
trans-
resveratrol (3,5,4′-trihydroxy
trans
stilben) ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Okadasyre og BAX inhibitor peptid (V5) var fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Z-VAD-FMK [Z-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2F] var fra Calbiochem (San Diego, California, USA). Z-LEHD-FMK var fra R p53 rev: 5′-CTT CTT TGG CTG GGG AGA GG-3 «(626bp); GAPDH fwd: ATC ACC ATC TTC CAG GAG GCG; GAPDH rev: CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG (574bp). Den densitometrisk kvantifisering av båndene ble bestemt ved hjelp ImageJ programvare, versjon 1.43r.
6. H1299 celle transfeksjon
full-lengde p53-EGFP plasmid ble hentet fra GenScript Corp (Piscataway, NJ, USA). De forbigående transfeksjon Forsøkene ble utført ved hjelp Fugene (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For analyse av GFP-p53, ble cellene sådd ut på glassbunn retter 48 timer før starten av behandlingen. Celler ble merket med 10 ug /ml Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) i 30 minutter og vasket tre imes med PBS [35]. Bilder ble samlet inn ved hjelp av en konfokal mikroskop (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) og ble analysert ved bruk av Zeiss LSM Image Browser program, versjon 4,2,0121.
7. Annexin V /propidiumjodid apoptose assay
celler på 70-80% konfluens ble sådd ut på 24-brønners glassbunn retter, og analysene ble utført ved anvendelse av Annexin V /propidium jodid Apoptose Assay kit ifølge produsentens instruksjoner . Bilder ble samlet inn ved hjelp av en konfokal mikroskop (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland). For å få bildene følgende bølgelengder ble brukt: annexin V-FITC (EX /EM ~488 nm /~540 nm) og propidiumjodid (EX /EM ~495 nm /~635 nm). Bilder ble analysert ved hjelp av Zeiss LSM Image Browser program, versjon 4,2,0121.
8. TUNEL analysen
Terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) ble utført ved hjelp av en klikk-it® TUNEL Alexa Fluor® Imaging Assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Positive kontroller ble oppnådd ved behandling av celler med deoksyribonuklease I, i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble analysert ved hjelp av et konfokalt fluorescensmikroskop (Carl Zeiss International, Oberkochen, Tyskland). Bilder ble analysert ved hjelp av Zeiss LSM Image Browser, versjon 4,2,0121.
9. Statistisk analyse
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (S.E.M.). Det ble utført dataanalysen og ikke-lineære regresjoner med Sigmaplot programvaren (v. 10.0, Systat Inc., CA, USA) integrert med SigmaStat programvare (v. 3.2, Systat Inc. CA, USA). Elevens
t
-test ble brukt til å sammenligne midler, og
p
0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
1.. Resveratrol reduserer human bryst- og lungecancercellelevedyktighet i en tids- og doseavhengig måte
Fordi p53 har blitt foreslått å spille en rolle i anticancer egenskaper resveratrol, testet vi den cytotoksiske effekten av denne forbindelsen i MCF-7 brystcancer, lungecancer A549 og H460-lungecancercellelinjer (som uttrykker villtype p53) og i p53-manglende ikke-liten lungecancercellelinje H1299. Som forventet, ble p53 mRNA ekspresjon bekreftet ved RT-PCR i p53-positive cellelinjer, men ikke i H1299-celler (data ikke vist). For å teste hvorvidt resveratrol hadde en cytotoksisk effekt, idet hver av cellelinjene ble dyrket med forskjellige resveratrol konsentrasjoner i området fra 10 til 500 uM i 5 minutter, 24 timer og 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-reduksjonsanalysen. Resveratrol redusert MCF-7, A549, H460 og H1299 cellelevedyktighet i en tids- og doseavhengig måte (fig. 1). Sensitiviteten av MCF-7, A549 og H460-celler som var større enn den til H1299, særlig når cellene ble eksponert i 24 timer til resveratrol høyere konsentrasjoner enn 100 uM. Eksponering for 500 uM resveratrol for 24 eller 48 h redusert levedyktighet av MCF-7 celler til nesten null (fig. 1A). Svært lignende profiler ble observert for A549 og H460-celler (fig. 1C og 1D). I motsetning til ca. 50% og 20% av H1299 cellene forble levedyktige etter 24 og 48 timer, henholdsvis (fig. 1B). DMSO-bærer (0,5%) påvirket ikke levedyktigheten av kontrollceller (data ikke vist). Vi testet også effekten av resveratrol for perifere mononukleære blodceller (PBMC), en mindre transformert cellelinje sammenlignet med de kreftcellelinjer som ble studert. vist resveratrol en ikke-signifikant virkning på PBMC levedyktighet (fig. S1), noe som tyder på at den cytotoksiske effekten av denne forbindelsen er spesifikk for kreftcellelinjer.
MCF-7 (A), H1299 (B), A549 (C), og H460-celler (D) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av
trans
-Resveratrol (10-500 uM) fortynnet i DMSO i 5 minutter, 24 timer og 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Sluttkonsentrasjonen av DMSO i kulturmediet var 0,5%. Resultatene (n = 4) er uttrykt som en% av kontrollverdien, og de data som presenteres er gjennomsnitt ± S.E.M.
2. Resveratrol-indusert cytotoksisitet i MCF-7-celler blir mediert av p53-aktivering
De cellulære nivåer av p53 ble undersøkt i resveratrol-behandlede MCF-7-celler. Cellene ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av resveratrol i 24 timer, og nivåer av p53 og MDM2 ble bestemt ved Western-blotting-analyse (Fig. 2A). Resveratrol ved konsentrasjoner på 100 og 200 uM ga en signifikant (
p
0,05) doseavhengig økning i det totale nivå av p53. Denne økningen ble ikke ledsaget av en økning i cellenivå av MDM2. P53 /MDM2-forholdet, bestemt ved densitometrisk kvantifisering, viste at de forhøyede nivåene av p53 etter stimulering ved resveratrol ikke ble ledsaget av en økning av MDM2-protein mediert degradering. p53 mRNA-nivåer ble ikke endret når MCF-7-celler ble behandlet med resveratrol under de samme eksperimentelle betingelser (Fig. 2B), noe som tyder på at økningen i cellulære nivåer av p53-protein var ikke skyldes en stimulering av p53-genekspresjon.
Effekter av resveratrol på p53 og MDM2 proteinnivåer (A) og på p53 mRNA nivåer (B) i MCF-7 celler. Cellene ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av resveratrol eller DMSO (0,5%) i 24 timer. De proteinnivåer ble bestemt ved Western-blotting-analyse, som beskrevet i Materialer og Metoder. GAPDH ekspresjon ble anvendt som en kontroll. I panelene A og B representerer data 3-5 uavhengige eksperimenter, og båndintensitetene er grafisk representert med hver gruppe av bilder. (C) MCF-7 cellelevedyktighet i nærvær av p53-spesifikke inhibitor pifithrin-α. Cellene ble eksponert for 30 uM pifithrin i 1 time før behandling med forskjellige
trans
-Resveratrol konsentrasjoner (50-200 um). Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Resultatene (n = 3) uttrykkes som en% av kontroll, og de data som er vist er gjennomsnitt ± S.E.M. *
p
. 0,05 sammenlignet med de respektive kontroll (Student
t
-test)
En resveratrol-mediert økning av p53 nivåer ble ikke observert ved eksponering av cellene til denne forbindelsen i 24 timer, etterfulgt av fjerning av resveratrol fra dyrkningsmediet for en ytterligere 24 timers periode (data ikke vist). Eksponering av MCF-7 celler til 200 uM resveratrol fremmet fosforyleringen av checkpoint-2-protein (Chk2, et protein som er involvert i en rekke cellulære prosesser, inkludert p53-aktivering i respons til DNA-skade) ved Thr68 (Fig. 3A) og øket cellenivå av p21, som er en av de store p53-responsive gener (fig. 3B).
Effekter av resveratrol på fosfo-Chk2 (A) og på p21 protein nivå (B) i MCF-7-celler. Cellene ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av
trans-
resveratrol eller DMSO (0,5%) i 24 timer. De proteinnivåer ble bestemt ved Western-blotting-analyse, som beskrevet i Materialer og Metoder. GAPDH ekspresjon ble anvendt som en kontroll. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter, og båndintensitetene er grafisk representert med hver gruppe av bilder.
*
p
0,05 sammenlignet med de respektive kontroll (Student
t
-test)
For å finne ut om resveratrol-indusert MCF. -7 celledød er mediert av p53, ble MTT-reduksjonsanalysen utføres i nærvær av pifithrin-α, en spesifikk p53-inhibitor som blokkerer transkripsjonen av p53-responsive gener og blokkerer også p53-mediert apoptose [36] (fig. 2C ). Celler ble utsatt for pifithrin-α 30 uM i 1 time og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av resveratrol for 24 timer. Vi har observert et større antall levedyktige celler under disse betingelser (Fig. 2C, grå søyler) enn i fravær av pifithrin-α (fig. 2C, sorte stolper), noe som tyder på en mulig involvering av p53 i resveratrol-indusert celledød.
Vi undersøkte også effekten av PRIMA-1, en p53 aktivator medikament, på p53-positive cancercellelinjer. PRIMA-1 ved en konsentrasjon på 100 uM redusert celle-levedyktighet, og kombinasjonen av dette stoffet med 100 uM resveratrol forsterket den cytotoksiske effekten av resveratrol i MCF-7, A549 og H460-celler (Fig. 4).
cellene ble eksponert i 24 timer til 100 mikrometer
trans-
resveratrol, 100 mikrometer PRIMA-en, eller 100 mikrometer
trans-
resveratrol pluss 100 mikrometer PRIMA-en 100 mikrometer. Dataene representerer 3 uavhengige eksperimenter.
3. Resveratrol induserer ikke apoptose i H1299 p53-null celler
For å teste om resveratrol-indusert MCF-7 celledød er apoptose-mediert, utførte vi en annexin V /propidiumjodid analysen. Resveratrol på 100 uM indusert fosfatidylserin eksternalisering (en prosess som indikerer apoptose), som vist med annexin V-merkede celler i figur 5. Denne effekten ble avskaffet i nærvær av pifithrin-α, noe som indikerer at p53-mediert apoptose ble forekommer i celler. Propidiumjodid-merkede celler ble ikke detektert under de samme betingelser. En TUNEL assay ble også utført på MCF-7 og H1299 celler. Resveratrol-indusert apoptotisk celledød ble observert i MCF-7-celler, men ikke i H1299-celler (fig. 6). Resveratrol-indusert apoptose i MCF-7-celler ble ledsaget av en betydelig proteolytisk spaltning av caspase 9 og kaspase 7 (fig. 7A). Poly (ADP) ribose polymerase ble spaltet i to små fragmenter av eksponering for økende konsentrasjoner av resveratrol. Ingen aktivering av kaspaser 9 og 7 ble påvist i p53-negative H1299-celler (fig. 7B). For å teste muligheten for at resveratrol-indusert celledød er mediert av kaspase signalveier i MCF-7, men ikke i H1299, utførte vi en MTT-reduksjon assay i nærvær av kokekaret kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK (fig. 4C). Celler ble eksponert for 50 uM Z-VAD-FMK i 1 time og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av resveratrol for 24 timer. Antallet levedyktige MCF-7-celler var signifikant høyere i nærvær av 100 eller 200 uM resveratrol (fig. 7C, grå søyler) enn i fravær av inhibitor (fig. 7C, sorte stolper), noe som tyder på at caspaser er involvert i resveratrol indusert celledød. Z-VAD-FMK ikke påvirke levedyktigheten til H1299 celler under samme forhold. Den mulige involvering av caspases ble også undersøkt ved hjelp av caspase 9-spesifikk hemmer Z-LEDH-FMK. MCF-7, men ikke H1299 viste en høyere prosentandel av levedyktige celler sammenlignet med kontrollen i nærvær av Z-LEDH-FMK (fig. S2).
Cellene ble behandlet med
trans-
resveratrol (100 mm) eller DMSO (0,5%) og analysert ved hjelp av Annexin V /propidium Iodide apoptose Assay kit (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I ett eksperiment ble cellene eksponert for 30 uM pifithrin i 1 time før behandling med
trans
-Resveratrol. Bilder ble samlet av konfokalmikroskopi (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Annexin V-FITC fluorescens: EX /EM ~488 nm /~540 nm; og Propidium Iodide fluorescens: EX /EM ~495 nm /~635 nm. Hvert bilde vises er representerer to uavhengige forsøk.
Cellene ble behandlet med
trans-
resveratrol (100 mm) og merket ved hjelp av en klikk-it® TUNEL Alexa Fluor® Imaging analysen sett (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). TUNEL fluorescens: EX /EM ~495 nm /519 nm. Hvert bilde representerer to uavhengige forsøk.
(A) Aktivering av caspase 9, caspase 7, og PARP av resveratrol i MCF-7 celler. (B) Nivåer av caspase 9 og caspase 7 i H1299 celler eksponert for resveratrol. For western blotting-analyse ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av resveratrol. Dataene representerer 3-4 uavhengige forsøk, og bandet intensiteter er grafisk representert med hver gruppe av bilder. (C) MCF-7 og H1299 cellene ble pre-inkubert med 50 pM av den kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK i 1 time før behandling med forskjellige konsentrasjoner av
trans
-Resveratrol. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Resultatene (n = 3) er uttrykt som% av kontroll, og de data som er vist er gjennomsnitt ± S.E.M. *
p
0,05 sammenlignet med de respektive kontroll (Student
t
-test)
Vi har undersøkt mulige involvering av Bax i resveratrol-. induserte apoptose av MCF-7-celler ved å måle de cellulære nivåer av dette proteinet og ved å bruke en spesifikk Bax peptid inhibitor (V5) etter behandling av celler med resveratrol. Vi observerte høyere Bax nivåer i celler behandlet med 100 uM resveratrol og høyere antall levedyktige celler i nærvær av V5, noe som tyder på involvering av dette pro-apoptotiske protein i MCF-7 celledøden kaskade (Fig. S3).
4. H1299 celler krever p53 å gjennomgå apoptose i respons til resveratrol eksponering
For å avgjøre om uttrykket av p53 i H1299 celler fører til at cellene til å bli utsatt for effektene av resveratrol, gjennomførte vi transient transfeksjon analyser av villtype p53 -GFP plasmid. En MTT-assay ble utført i p53-transfektert H1299 å teste cytotoksisiteten av resveratrol i disse cellene. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 100 uM resveratrol i ytterligere 24 timer. Den cytotoksiske effekten av resveratrol på H1299-celler ble forbedret (dvs. cellene ble mer utsatt for denne forbindelse) gjennom p53-ekspresjon (Fig. 8A). Effektene av resveratrol for H1299-celler så vel som på MCF-7-celler synes å være avhengig av vill-type p53-funksjon. Den forbigående transfeksjon av p53-GFP utløst resveratrol-indusert apoptose i H1299 (Fig. 8B). Hastigheten for transfeksjonseffektivitet oppnådd i disse forsøkene var ca. 60% (Fig. 8C). Fusjonerte bilder fra fluorescens mikroskopi (fig. 8D) viser at de fleste av de p53-transfiserte celler ble gjennomgår apoptose (hvite piler).
(A) p53-transfekterte og ikke-transfekterte H1299-celler ble behandlet med resveratrol ( 100 uM). Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Resultatene (n = 4) er uttrykt i% av kontroll, og dataene som vises er gjennomsnitt ± SEM *
p
0,05 sammenlignet med de respektive kontroll (Student
t
-test). (B) Cellene ble transient transfektert med full-lengde p53-EGFP-plasmid og behandlet med resveratrol (100 uM). Cellene ble deretter dobbelt merket med Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og med klikk-it® TUNEL Alexa Fluor® Imaging analysen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Hoeschst fluorescens: EX /EM ~350 nm /461 nm. TUNEL fluorescens: EX /EM ~495 nm /519 nm. I det fusjonerte bilder, pilene indikerer celledød av p53-transfekterte celler. (C) Frekvensen av transfeksjonseffektivitet for H1299 celler. (D) Kvantifisering av apoptotiske og ikke-apoptotiske transfektert H1299 celler etter eksponering for resveratrol.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi effekten av resveratrol på p53-mangel ikke-liten humane lungekreft-cellelinje H1299 sammenlignet med effekten av resveratrol for kreftcellelinjer (human brystcancer MCF-7, cancer celle lunge A549 og H460) som uttrykker villtype p53. Hypotesen testet var at p53 transfeksjon i H1299 celler, som bærer en delvis slettet p53-genet, som gjør disse cellene i stand til å svare på resveratrol pro-apoptotiske egenskaper. MCF-7, A549 og H460-celler ble funnet å være mer følsomme for resveratrol-induserte cytotoksiske effekter enn det som var H1299 celler. Resveratrol indusert caspase-mediert apoptose i MCF-7-celler, men ikke på H1299-celler og forbigående transfeksjon av vill-type p53 gjengitt H1299 utsatt for de pro-apoptotiske virkninger av resveratrol.
H1299-celler var mer resistente overfor resveratrol , spesielt ved høye konsentrasjoner, enn det som var p53-positive cancercellelinjer. Mangelen på p53-ekspresjon i H1299 kan forklare dens høyere motstand mot celledød sammenlignet med p53-positiv MCF-7-celler. H1299 ikke gjennomgår apoptose etter eksponering for resveratrol, i motsetning til MCF-7. Andre mekanismer for celledød kan være relatert til denne virkning;
f.eks
., En fersk studie indikerte at resveratrol utløser et samspill av prosesser som skjer i løpet av apoptose, cellesyklus arrest, og autofagi i tumorceller [37].
Resveratrol-indusert cytotoksisitet og apoptose ble mediert delvis av p53 i MCF-7-celler, som angitt ved cellelevedyktigheten eksperimenter utført i nærvær av p53-spesifikke inhibitor pifithrin-α. De endogene nivåene av p53-protein var betydelig høyere i nærvær av resveratrol, som er i overensstemmelse med andre rapporter [38], [39]. I den foreliggende undersøkelse ble økningen av p53-nivåer ikke er etterfulgt av en økning i MDM2 nivåer, noe som tyder på at høye p53 /MDM2-forholdet reflekterte et lavere ubiquitin-avhengig p53-degradering nivå, sannsynligvis som et resultat av stabiliseringsmekanismer som opererer på proteinet .
