Abstract
De fleste av det menneskelige genom er transkribert og genererer ikke-kodende RNA (ncRNAs) som ikke klarer å kode protein informasjon. Lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) er fremstår som en ny klasse av ncRNAs, men vår kunnskap om disse ncRNAs er begrenset. Tidligere har vårt laboratorium identifisert som en lncRNA, urothelial kreft assosiert 1 (UCA1), spilte en viktig rolle i blærekreft. Til tross for den nylige interesse i UCA1 som en diagnostisk markør for blærekreft, er lite kjent om sin transkripsjonsregulering. Å belyse regulering av UCA1 genekspresjon, har vi preget det menneskelige UCA1 genet promoter. En 2,0-kb-fragment av dens 5′-flankerende region ble klonet inn i et luciferase reporter vektor. Sletting og mutasjon analyse antydet at en Ets-to bindingssetet var avgjørende for UCA1 genet promoter aktivitet. Videre analyser av dette nettstedet ved gel skiftende, kromatin immun nedbør (chip), og kotransfeksjonseksperimenter viste at transkripsjonsfaktor Ets-2 direkte bundet til UCA1 promoter-regionen og stimulert UCA1 promoter aktivitet i blæren kreftceller. Tatt i betraktning den anti-apoptose funksjon av Ets-2, våre data antydet at Ets-2 regulerer apoptose prosessen ved å regulere ekspresjonen av UCA1, dessuten UCA1 kan være involvert i aktiveringen av Akt signalveien ved Ets-2 i blærecancerceller .
Citation: Wu W, Zhang S, Li X, Xue M, Cao S, Chen W (2013) Ets-2 Regulerer Cell apoptose via Akt Pathway, gjennom regulering av urothelial Cancer Associated en, en Long ikke-kodende RNA, i blærekreft celler. PLoS ONE 8 (9): e73920. doi: 10,1371 /journal.pone.0073920
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 6 mars 2013; Godkjent: 24 juli 2013; Publisert: 12. september 2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet fra stiftelsen Natural Science of China (Grant nr 81072104). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eukaryote genomer er ikke de enkle, godt ordre substrater av gentranskripsjon som en gang ble antatt. Vi vet nå dem til å transkribere et bredt spektrum av RNA-molekyler, som strekker seg fra lange protein-kodende mRNA til korte ikke-kodende transkripter, som ofte overlapper hverandre eller er innfelt på hver tråd [1]. Lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) er fremstår som en ny klasse av ikke-kodende RNA som inneholder mer enn 200 nukleotider, men vår kunnskap om disse lncRNAs er begrenset. LncRNAs er transkripsjonene som ligner protein-kodende mRNA i at de er avkortet, spleiset og polyadenylert RNA-polymerase II-transkripter. De skiller seg fra mRNA bare i deres mangel på protein-kodende åpne leserammer (ORF) [2].
I motsetning til det mangfold av RNA-arter ble identifisert bare et lite antall lncRNAs å ha eksperimentelt-avledede funksjoner. Videre har feilregulering av lncRNA blitt vist i forskjellige typer av kreft [3], [4], for eksempel Malat-1 i lungekreft [5], HULC i hepatocellulær karsinom [6], og varmluft i brystkreft [7] , noe som indikerer at lncRNAs kan spille en avgjørende rolle i tumordannelse eller tumorprogresjon.
Tidligere etablerte vi BLZ-211 og BLS-211 celler som er et par av blære overgangsordning celle carcinoma (TCC) cellelinjer klonet separat fra den samme pasientens prøve, men med forskjellige biologiske egenskaper [8], [9], [10]. Deretter Vi rapporterte en ny uttrykte sekvens-tag (EST) (Genbank deponeringsnummer DR159656) isolert fra disse to cellelinjer ved hjelp av subtraktive undertrykkelse hybridisering (SSH) teknikk [11]. Basert på denne EST, vi klonet og identifisert en ncRNA heter urothelial kreft forbundet en (UCA1) (Genbank deponeringsnummer EU334869) [12]. UCA1 tilhører lncRNAs på grunn av mangel av en sterk Kozak konsensussekvens for translasjon initiering i noen av ATG-kodoner ved flere små ORF’er [12]. Mange studier antydet at UCA1 kan virke som en molekylær markør av blærekreft på grunn av sin utmerkede spesifisitet og sensibilitet [13], [14]. En tidligere studie i vårt laboratorium innebar også at forhøyet UCA1 uttrykk kan påvirke blære kreft celle vekst og fremme invasjonen av blæren kreftceller [12], noe som tyder på at det ville være en roman terapeutisk mål gen av blærekreft. Til tross for denne interessen, er lite kjent om
cis
regulatoriske elementer som er direkte involvert i transkripsjonsmodulering av UCA1 genet i blærekreft. I tillegg studien ved vårt laboratorium har vist at det er tre spleisevarianter av UCA1-genet som foreligger i blærekreftceller [12], [15]. Den forhøyede ekspresjon av UCA1 i blærekreft og eksistensen av spleisevarianter sterkt tyder på at transkripsjonsregulering av genet UCA1 er strengt kontrollert. Den UCA1
cis
forskrift kan forme komplekse genuttrykk nettverk som til slutt driver biologiske prosesser, slik som celle apoptose.
I denne studien har vi identifisert arrangøren av den menneskelige UCA1 genet for første gang og undersøkte regulering av UCA1 arrangøren av Ets-2 transkripsjonsfaktor. Ets-2 kan påvirke blærekreft celle apoptose ved å regulere uttrykket av UCA1. Vi har også funnet lncRNA UCA1 kan være involvert i aktiveringen av Akt pathway. Denne forskningen vil gi innsikt i reguleringsmekanisme for UCA1 uttrykk i videre studier.
Materialer og metoder
Arrangøren Tippe
Tidligere full lengde UCA1 cDNA og dets transkripsjonen start hotellet (TSS) ble identifisert ved hjelp av SMART RACE teknologi [12]. I denne studien ble MegaBLAST (NCBI) program som brukes til å kartlegge UCA1 genet og dets 5 «flankerende region og DNA-sekvenser ble lastet ned fra GenBank (NC_000019.9). TSS av UCA1 genet ble merket som en. Å forutsi Arrangøren og antatte transkripsjonsfaktorer, ble følgende noen online programvare utnyttet. Arrangøren og TSS forutsi verktøy inkluderer FPROM programmet fra Softberry programvare (https://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom group=programs subgroup=promoter) og PromoterInspector program fra genomatix (http: //www.genomatix.de/online_help/help_gems/PromoterInspector_help.html) [16]. Den MatInspector program fra genomatix (https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html) [17], [18] ble anvendt for transkripsjonsfaktoren prediksjon.
plasmidkonstruksjoner
for å generere pGL3-UCA1-2000 plasmid ble et DNA fragment som inneholder
cis
region av UCA1 genet -1800 til 200 bp forsterket av PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase, Takara, Dalian ). PCR-produktet ble deretter skåret ut fra agarosegel og isoleres ved hjelp av agarosegel-DNA-fragment Recovery Kit (Takara, Dalian). Det rensede DNA-fragmentet ble deretter satt inn pGL3-Basic luciferase uttrykke vektor (Promega, USA) gjennom
Kpn
jeg og
Nhe
I områder. Andre avkortede fragmenter ble gjort på den ovenfor beskrevne måte. Primersettene anvendes for dette rekke produkter ble gitt i tabell 1. De amplifiserte DNA-fragmenter ble innsatt i pGL3-basisvektor gjennom samme restriksjonsendonukleasene områder. Alle DNA-konstruksjoner ble sekvensert.
seterettet mutagenese
Bytte mutasjon av Ets-to-bindingsseter ble generert av PCR-basert nettsted rettet mutagenese (Byotime, Kina) . Den pGL3-UCA1-1200 vektor ble brukt som DNA mal, og Ets-to kjernebindingssetet (GGGAAG) ble erstattet av en
Hind
III restriksjonssete (AAGCTT) (tabell 1). Mutant vektor ble kåret som pGL3-UCA1-1200-mut. Mutasjonene ble bekreftet ved restriksjonsenzymoppslutning og sekvensering.
Cell Culture, Transient Transfeksjon
Menneskelig blære overgangsordning celle carcinoma (TCC) cellelinjer BLZ-211 og BLS-211 ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA). BLZ-211 og BLS-211 cellelinjer ble etablert av vår lab i 1994. blærekreft vev var fra kirurgiske prøver av en 55-år gammel mann med diagnosen multifokal papillær overgangsordning celle carcinoma (TCC) karakter II. Hele prosedyren ble administrert unber godkjenning av etikkutvalg av First Affiliated Hospital, School of Medicine, Xi’an Jiaotong University [8]. Celler med mer enn 80% konfluens ble benyttet for transfeksjon.
BLZ-211-celler ble transfektert med FuGENE®HD Transfection Reagent (Roche, USA) i 24-brønns plate. Hver brønn inneholdt 2 x 10
5-celler, 0,5 ug av pGL3-UCA1 serievektor, 0,02 ug av den interne kontroll-vektoren PRL-TK (Promega, USA), 1 ul FuGENE®HD, og 500 pl RPMI 1640 medium uten serum eller antibiotika. pGL3-basis (Promega, USA) vektor ble transfektert som kontroll. For siRNA transfeksjon ble celler transfektert med X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche, USA) i 6-brønns plate. Både Ets-2 siRNA og egge kontroll siRNA er kommersielle produkter (Santa Cruz, USA).
luciferase Assays
før analysen ble cellene vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) ved 48 timer etter transfeksjon og lysert i en passiv lyseringsbuffer (Promega, USA). Luciferase-aktivitet ble målt med et luminometer (Promega, USA) ved bruk av dual-luciferase reporter assay kit (Promega, USA). Resultatet ble normalisert til Renilla luciferase aktivitet. Rapporterte data var representert som gjennomsnittet fra tre uavhengige eksperimenter.
Elektro Mobility Skift Assay (EMSA)
Nuclear proteiner ble hentet fra BLZ-211 celler ved hjelp av kjernekraft protein ekstrakt kit (Byotime, Kina ). Da elektroforetiske mobilitet skift analyse ble utført i henhold til EMSA Kit (Pierce, USA). Deretter prober ble utarbeidet basert på Ets-to bindested i UCA1 genet arrangøren og den tilsvarende komplementære sekvens (5′-TGTCCTCTGGGAAGAAATGACC-3 «) kalt UCA1-vekt-Ets akkompagnert med en mutant versjon (5′-TGTCCTCTGTATAGAAATGACC-3′ ) også, heter UCA1-Mut-Ets. En 5»-biotin modifikasjon ble inkludert i UCA1-wt-Ets probe. For konkurranseanalyser, 200-ganger overskudd av ikke-merkede prober og umerkede mutante prober ble inkubert med reaksjonsblandingen før tilsetning av den merkede probe.
Chromatin Immunoutfelling (chip) Assay
1 x 10
7-celler ble kryssbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Deretter ble cellene vasket med kald PBS, høstet ved skraping og resuspendert i cellelyseringsbuffer inneholdende proteaseinhibitorer (Roche, USA). Etter inkubering i 10 minutter på is ble cellene sonikert for å generere omtrent 200-1000 bp DNA-fragmenter, og sentrifugert i 10 min ved 4 ° C. Supernatantene ble delt og inkubert med enten anti-Ets-2-antistoff (Santa Cruz, USA), eller IgG (BOOSTER, Kina) som en negativ kontroll ved 4 ° C over natten med rotasjon, respektivt. Immunkompleksene ble utfelt med laksesperm DNA /protein G-agarose (Millipore, USA) i 2 timer ved 4 ° C, deretter ble isolert, vasket, eluert med chip elueringsbuffer og omvendt tverrbundet ved oppvarming ved 65 ° C i 4 timer. DNA ble renset fra immunopresipitering med antistoff eller fra inngangsprøver og ble analysert ved hjelp av PCR, ved anvendelse av primere som flankerer Ets-2-bindingssete i UCA1 genpromoteren (tabell 1). Chip ble utført i duplikater.
Western Blot
Celler ble pelletert og deretter lysert ved RIPA buffer (Thermo Scientific, USA). Etter SDS-PAGE oppløsning og membran overføring, ble målet proteiner undersøkt med antistoff mot humant Ets-2 (Santa Cruz, USA), Akt, Pakt (Cell Signaling, USA), Bax (Epitomics, USA) eller GAPDH (Abmart, Kina ) etterfulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundære immunglobulin-antistoffer (Santa Cruz, USA). Til slutt ble båndene visualisert ved kjemiluminescens bruke en chemiluminescence deteksjon kit (Pierce, USA) og de spesifikke båndene ble registrert på røntgenfilm.
apoptose analysen
For å kvantifisere apoptose, ble cellene farget med Annexin V og PI bruker Annexin V-FITC /PI apoptose deteksjon kit (Keygene Biotech, Kina) etter produsentens instruksjoner. Fluorescens ble påvist ved fluorescens mikroskop (Olympus, Japan) og flowcytometri cyan ADP 9 farge fra Beckman Coulter (Beckman Coulter Brea, CA). Flowcytometri eksperimenter ble utført i tre paralleller og gjentatt tre ganger.
Statistical Analysis
Data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) fra tre separate forsøk. Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av SPSS 13,0 programvare. Forskjeller mellom gruppene ble analysert ved hjelp av Student
t
-test.
P
. 0,05 verdi ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Kloning og Bioinformatial Analyse av UCA1 Arrangøren omegn
I forrige undersøkelse, den transkripsjon start hotellet (TSS) av UCA1 ble identifisert ved 5′-RACE [12]. Den MegaBLAST program NCBI ble benyttet for å bestemme TSS på UCA1-genet, som var plassert på 15939757 stilling av chr19 (GRCh37 /hg19). Merking dette området som en, totalt 3,0 kb DNA-sekvenser av det UCA1 5′-flankerende region regulering (-2000 bp- + 1000 bp) ble oppnådd fra GenBank, som ble anvendt for bioinformatical analyse. Resultatet av FPROM program antydet at TSS ligger på 135 bp, og en TATA-boks på 105 bp. Analysen av PromoterInspector program indikerte at promotorområdet er mellom -515 bp og 100 bp regionen. Tatt i betraktning de tidligere 5′-RACE resultater og prediksjon resultater, vi valgte sekvensene fra -1800 bp til 200 bp for å følge forskning. For å evaluere UCA1 promoter aktivitet, reporter konstruksjoner som inneholder en rekke av de 5′-flankerende sekvenser (pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900, pGL3-UCA1-600, pGL3-UCA1-350) ble målt ved hjelp av luciferase-analyse i BLZ-211-celler. Konstruksjonene pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900 og pGL3-UCA1-600 vises forskjellig promoter aktivitet. Den pGL3-UAC1-1200 ga sterkest promoter aktivitet i disse konstruksjonene. Spesielt, når DNA-fragmentet mellom -400 bp og -150 bp ble slettet, promotoren aktiviteten var nesten opphevet (fig. 1A), noe som tyder på at det foreligger en kritisk positiv regulatorisk element i denne regionen. Disse sletting eksperimenter tyder på at UCA1 promoter aktivitet påvist i BLZ-211 celler er hovedsakelig tilskrives den positive regulatoriske element mellom -400 bp og -150 bp av arrangøren regionen. Det var mange transkripsjonsfaktor (TF) -binding områder i denne regionen spådd av bioinformatikk programmet MatInspector, inkludert antatte Ets-2, C /EBP, SP-1, c-Myb,
et, al
. (Fig. 1B). Fra disse transkripsjonsfaktorer, valgte vi Ets-2 som potensialet TF på grunn av sitt høyeste prognose poengsum.
(A) Luciferase assay. Fem avkortede DNA-fragmenter av UCA1 promoter-regionen i pGL3 vektorer, en negativ kontroll vektor, pGL3-grunnleggende og positiv kontroll vektor, ble pGL3-kontroll, transfektert inn i BLZ-211 celler. Luciferase-aktiviteter ble målt ved 48 timer etter transfeksjon. Verdier representerer middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05. (B) Transkripsjonell Faktorer prediksjon ved hjelp MatInspector programvare. Transkripsjonsfaktorer med høy prognose poengsum var til stede.
ETS-2-bindende nettsteder Bidra til arrangøren Activation
For å undersøke om Ets-2 er kritisk for UCA1 promoter aktivitet, vi erstattet ETS-to bindingsseter til
Hind
III restriksjonsendonukleaseseter i pGL3-UCA1-1200-mut. Sammenlignet med reporteren luciferase aktiviteten til villtype pGL3-UCA1-1200, den pGL3-UCA1-1200-mut ga en mye lavere promoter aktivitet i BLZ-211 celler (fig. 2A), noe som viser at disse Ets-2 bindingsseter faktisk spilt en viktig rolle i reguleringen av UCA1 promoteraktivitet. For å bekrefte om transkripsjonsfaktor Ets-2 kan binde seg til denne regionen, ble kjerneekstrakt fra BLZ-211 celler forberedt og EMSA ble utført. De 22 bp oligonukleotider fra -378 til -357 nt inneholdende de Ets-2-bindingsseter ble anvendt som villtype-proben og den samme region med muterte bindingsseter ble anvendt som den mutante probe (fig. 2B). Som vist på fig. 2B, en fremtredende DNA-protein-kompleks ble dannet med vill-type sonde. Bindingen ble konkurrert ut av et 200-gangers overskudd av umerket villtype-proben, men ikke etter en 200-gangers overskudd av umerket probe mutant. Resultatene indikerte at denne regionen var ansvarlig for den DNA-proteinkompleks formasjonen. For ytterligere å undersøke om Ets-2 kan binde direkte til den proksimale UCA1 arrangøren
in vivo
, ble ChIP utført ved hjelp av antistoff mot Ets-2 til immunpresipitere formaldehyd-fiksert kromatin fra BLZ-211 celler. Som vist på fig. 2C, fremtredende PCR-produktene inneholdende de Ets-2-bindingsseter ble oppdaget ved bruk av DNA trukket ned av antistoff mot Ets-2, mens ingen amplifikasjon ble observert i DNA-immunopresipitert ved IgG, noe som viser at Ets-2 kan direkte binde til UCA1 promoteren i BLZ-211 celler.
(A) Luciferase assay. ETS-2 bindingsseter (GGGAAG) ble erstattet med
Hind
III sider (AAGCTT) ved seterettet mutagenese (øvre panel). Relative luciferase-aktivitet av villtype (wt) og de mutante vektorer (mutant) ble målt ved hjelp av luciferase-assay. Verdier representerer middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05. (B)
In vitro
påvisning av Ets-2 transkripsjonsfaktor binding til promoter-regionen til UCA1 genet ved EMSA-analyse. Ett hovedbånd ble observert når biotinmerket Ets-2-probe ble inkubert med det nukleære ekstrakt (spor 2). Ets-2-binding ble ikke inhibert av den mutante-sonden (felt 3), mens det ble konkurrert med umerket kald-sonden (felt 4). (C)
In vivo
påvisning av Ets-2 transkripsjonsfaktor binding til promoter-regionen til UCA1 genpromoteren av Chip-analyse. Inngangs kromatin (Input), som representerte deler av sonikert kromatin før immunoutfelling, ble anvendt som en positiv kontroll. IgG antistoff ble brukt som en negtive kontroll chip analysen.
ETS-2 er avgjørende for transkripsjon Regulering av UCA1
For å avgjøre om transkripsjonsfaktor Ets-2 kunne regulere UCA1 uttrykk , semi-kvantitativ RT-PCR ble utført etter banket ned Ets-2 av spesifikke siRNA i BLZ-211 celler. PCR Resultatene viste at UCA1 mRNA uttrykket ble redusert med rundt 50% etter demping av Ets-2 uttrykk (Fig. 3A). Videre, ettersom luciferase-analyseresultatene er vist, da vi co-transfektert den Ets-2-spesifikk siRNA eller egge kontroll siRNA med pGL3-UCA1-1200 inn i BLZ-211 celler, knockdown av Ets-2 forårsaket redusert aktivitet av UCA1 promoter i sammenligning med det forvrengte styre siRNA gruppe (fig. 3B). Disse resultatene indikerte at Ets-2 kan regulere ekspresjonen av UCA1 ved å påvirke aktiviteten av UCA1 promoteren.
(A) Ekspresjon av Ets-2 og UCA1 ble målt ved hjelp av RT-PCR følgende Ets-2-spesifikk siRNA eller egge siRNA behandling i BLZ-211 celler. 18 S-rRNA ble anvendt som en intern kontroll. (B) Luciferase-analyse. Ets-to spesifikke siRNA eller egge kontroll siRNA ble ko-transfektert med pGL3-UCA1-1200 i BLZ-211 celler. Verdier representerer middelverdier ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05. NSC: uspesifikk kontroll siRNA
UCA1 kan være involvert i apoptose indusert av Ets-to knockdown i BLZ-211 Cells
Rollen Ets-2 i blærekreft. er uklart, så vi bekreftet den funksjonelle konsekvensen av Ets-to knockdown i blæren kreftceller. En økning nivå av apoptose ble observert etter en 48-timers behandling med Ets-2 sirnas i BLZ-211 celler via fluorescens mikroskop. Resultatene av celle apoptose-analysene viste en økt grad av apoptose i BLZ-211-celler når cellene ble behandlet med Ets-2-spesifikk siRNA i forhold til det forvrengte styre siRNA behandling (Fig. 4A). For å kontrollere om Ets-2 indusert UCA1 genekspresjon var involvert i apoptose vi studerte en annen blære TCC cellelinje, heter BLS-211. BLS-211 er mangel på endogen UCA1 ekspresjon og er avledet fra den samme pasient som BLZ-211-cellelinjen. Interessant, etter banket ned Ets-2 genet, vi fikk ikke observert påfølgende apoptose i BLS-211 celler (fig. S1). I tillegg regnet vi apoptotiske celler ved hjelp av flowcytometri i begge cellelinjer separat. I samsvar med fluorescens mikroskop resultater, flowcytometri Resultatene viste en signifikant økning av celle pro-apoptose (øvre høyre kvadrant) etter Ets-to knockdown i BLZ-211 celler (12,49 ± 1,21%
vs.
6,40 ± 1,47%), mens ingen økning av pro-apoptose ble observert etter Ets-2 knockdown i BLS-211-celler (4,12 ± 0,28%
vs.
3,20 ± 2,50%) (fig. 4B). Disse resultatene antydet at UCA1 kan være involvert i cellen apoptose indusert av undertrykkelse av Ets-2.
(A) induksjon av apoptose etter en 48-timers behandling av Ets-2 siRNA eller eggekontroll sirnas i BLZ-211-celler ble undersøkt ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Cellene ble farget med Annexin V (grønn) og PI (rød). Scale bar 25 mikrometer. Bildene var representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Apoptose ble kvantifisert ved flowcytometri (FCM). FCM Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter. Cellular pro-apoptose prosesser (øvre høyre kvadrant) ble økt etter Ets-to knockdown i BLZ-211 celler (12,49 ± 1,21% vs 6,40 ± 1,47%, *
P
0,05), mens ingen signifikant endring i BLS-211 celler (4,12 ± 0,28% vs 3,20 ± 2,50%,
P
0,05). NSC. Uspesifikk kontroll siRNA
UCA1 kan delta i Inaktivering av Akt Pathway i Cell apoptose indusert av Ets-2 Nedregule
For å avgjøre om undertrykkelse av Ets -2 indusere apoptose i blærecancerceller via Akt vei, en privotal apoptose regulator vei, undersøkte vi proteinekspresjonen nivået av total Akt og fosforylert Akt (pakt). Interessant, viste den vestlige blotting resultatene etter stanse ETS-2, Pakt uttrykk ble senere redusert, mens uttrykk for proapoptotiske protein Bax ble økt (Fig. 5, venstre panel). Våre resultater antydet at Ets-to knockdown aktivert for å indusere apoptose i BLZ-211 celler via inaktivering av Akt sti og ført til endringer i nedstrøms målmolekylene. Dermed har vi antatt at UCA1 genekspresjon kan være assosiert med aktivering av Akt reaksjonsvei som er involvert i den Ets-2-mediert anti-apoptose prosess i blærecancerceller. For å løse dette konseptet, vi neste studerte protein uttrykk nivået av Akt, Pakt og Bax i BLS-211 celler. Som vist, var det ingen merkbar forskjell mellom Ets-2 siRNA behandlede gruppen og egge siRNA-behandlede gruppe (fig. 5, høyre panel). Våre resultater antydet at nedregulering av Ets-2, en transkripsjonsfaktor på UCA1 genet, kan indusere apoptose i BLZ-211-celler ved å minske UCA1 uttrykk, og dette kan bidra til inaktivering av Akt veien (fig. 6).
Ets-2 og apoptose relaterte proteiner ble oppdaget av Western blot. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. NSC:.. Ikke-spesifikk kontroll siRNA
Stiplet linje fra UCA1 til Akt indikerer at sammenhengen mellom UCA1 og Akt kan være indirekte
Diskusjoner
Blærekreft er en av de vanligste kreftformen i Kina, rangering som den første hyppig svulst i urinveiene. Vi har tidligere demonstrert at UCA1 kan fremme cellevekst og invasjon i blærekreft [12]. UCA1 er en lncRNA, siden den har flere små ORF skjønt ingen sterke Kozak konsensussekvenser ble funnet i noen av de ATG-kodon [12], [13]. Flere lncRNAs har blitt identifisert som er knyttet til sykdommer hos mennesker og har spesifikke funksjoner knyttet til menneskelige sykdommer [19]. Tidligere viste vi den romlige og tidsmessige uttrykk mønster av UCA1. Imidlertid har den transkripsjonelle regulering av UCA1 genekspresjon ikke blitt undersøkt. Her, for første gang, har vi karakterisert promoterregionen av det humane genet UCA1 og rapporterte dets regulering av Ets-2 transkripsjonsfaktor.
I motsetning til konvensjonelle protein-kodende gener, sekvenser, transkripsjonsstartsetene de ekson strukturer, og lengdene av disse lange ikke-kodende gener er alle svært variabel [20]. Basert på deres genom nærhet til proteinkodende gener, er lncRNAs klassifisert som overlapper hverandre, cis-antisense, toveis eller intronic ncRNAs [21], [22] .Den mekanismer lncRNA uttrykk er ukjent, selv om det er mye som tyder på at lncRNAs er regulert av tilsvarende mekanismer som proteinkodende gener. I korthet, i studiet av Wang et al, fant de en kjerne promoter region (fra nukleotidene -132 til -48) av lncRNA HULC genet og de kjennetegnes en CREB-bindingssete mellom nukleotidene -67 og -53 i kjernen promoter-regionen [ ,,,0],23]. I en annen studie av Zhao et al, analyseres de et 5 kb genomisk DNA-fragment oppstrøms for det første ekson av den lncRNA MEG3 genet, karakterisert v en CRE område som er involvert i MEG3 gentranskripsjon og også funnet flere proteiner fra CREB familien direkte bindes til CRE side [24]. Videre har mange studier tyder på at de mekanismer som ncRNA ekspresjon er endret i kreft er lik de for protein-kodende gener, inkludert epigenetiske mekanismer [25], [26], [27], [28].
i vår studie, analyserte vi den proksimale promoter-regionen i UCA1 som ligger på -2000 nukleotider oppstrøms av transkripsjon start stedet av UCA1 genet. Vi demonstrert av luciferase aktivitetsanalyse og analyse sletting at regionen mellom nukleotidene -400 til -150 kan bidra til den grunnleggende promoter-aktivitet. Og i denne regionen spådde vi mange kjente transkripsjonsfaktor via bioinformatikk prediksjon metoder. Vi har også demonstrert av EMSA og chip analyse at Ets-2 bindingsseter mellom nukleotidene -385 og -380 spilt en viktig rolle i reguleringen av UCA1 promoter aktivitet. I vår studie har vi brukt BLS-211 celler, som ble ikke klarte å uttrykke UCA1 genet selv om de uttrykte Ets-2-genet. Når vi behandlet cellene med Ets-2 siRNA ble UCA1 arrangøren aktiviteten ikke fullstendig avskaffet. Begge observasjoner tyder på at UCA1 ekspresjon kan kontrolleres ved andre transkripsjonsfaktorer. Verdt å merke seg når regionen mellom nukleotidene -700 og -400 ble slettet, arrangøren aktiviteten betraktelig redusert. Det foreslår en tilstedeværelsen av noen transkripsjonelle aktivatorer i denne regionen. For ytterligere klargjøring fremtidige studier må være fokusert på andre TF’er av promotorområdet av UCA1-genet, noe som bidrar til aktiviteten av UCA1-genet.
Ets-2 ble først karakterisert som et proto-onkogen. Gjennom årene Ets transkripsjonsfaktor familie ble et vanlig element i tumorgenesen [29]. Funn av Carbone
et al
antydet at nedregulering av Ets-2 i prostatakreftceller ble assosiert med reduserte nivåer av anti-apoptotiske proteiner BCL-x (L), vekst regulatoriske forhold cyclin D1, og c-myc . Denne studien viste den spesifikke rollen Ets-2 for å fremme vekst og overlevelse av prostata kreft celler [30]. I en annen undersøkelse viste de at transient ekspresjon av Ets-2 beskytter cellene mot apoptose ved å øke promotoraktiviteten av Bcl-xl og følgelig forbedre dets mRNA og protein ekspresjonsnivåene i mesothelioma cellelinjer [31]. Tidligere Hanke
et al
funnet at forholdet mellom Ets-2 mRNA til urokinase-plasminogen-aktivator (uPA) mRNA i urinen kan være en potensiell markør for blærekreft [32]. Selv om det er data støttet at Ets-2 tar del i blærekreft utvikling, de eksakte roller og mekanismer for Ets TFS i blærekreft er stort sett ukjent.
I vår studie viste vi en hemming av UCA1 uttrykk indusert av Ets-2 genet demping. Funksjonell konsekvens av Ets-2 genet Slå førte til apoptose i BLZ-211 celler. Vi demonstrerte også at Akt bane var involvert i denne prosessen. Serin-treonin-kinase Akt (også kjent som proteinkinase B) er en sentral konvergens node i et bredt innflytelsesrik signaleringsnett. Akt regulerer viktige cellulære funksjoner som migrasjon, spredning, differensiering, apoptose, og metabolisme [33]. I tillegg aktivering av Akt reaksjonsvei spiller en sentral rolle ved inhibering av apoptose indusert ved en rekke stimuli, inkludert vekstfaktor uttak, løsgjøring av ekstracellulær matriks, UV-bestråling, cellesyklus uoverensstemmelse og aktivering av FAS signalering [34], [35] [36]. For å teste om Ets-2 regulerer Akt vei gjennom UCA1, vi brukte en annen blærekreft cellelinje BLS-211, som mangler av UCA1 genekspresjon og det er avledet fra samme pasient som BLZ-211. Mest interessant, som følge av svekket ekspresjon av Ets-2 i BLS-211-celler vi ikke observere nedregulering av pakt og økning av celle apoptose. Disse resultatene viste at UCA1 kan være involvert i aktiveringen av pakt reaksjonsveien av Ets-2 (fig. 6). Disse resultatene var i samsvar med vår tidligere studie viste at Pakt er nedregulert i UCA1 stabile knockdown BLZ-211 celler [37]. LncRNAs har vist seg å nære biologiske aktiviteter. Så vidt man vet, den brede funksjonelle repertoar av lncRNAs inkluderer roller i høy ordre kromosomale dynamikk, telomere biologi og subcellulære strukturelt [22], [38]. Dess vår studie andre studier har også foreslått at lncRNA kan være involvert i regulering av signalveien, slik som wnt vei, Ras-reaksjonsveien [39], [40]. Men den mekanismen som hvordan Ets-2 regulerer Akt sti er fortsatt uklart, og om Akt signaliserer proteiner direkte kontakt med UCA1 må bevises videre.
I sammendraget, så vi på regulatoriske elementer som er direkte involvert i UCA1 gentranskripsjon og funnet at arrangøren aktivitet UCA1 er i hovedsak knyttet til Ets-to bindingssetet innenfor den proksimale promoter regionen. Vi viste at transkripsjonsfaktor Ets-2 kan direkte binde seg til dette området, og det er viktig å transkripsjonen kontroll av UCA1 uttrykk. I tillegg er våre resultater viste at UCA1 kan være involvert i reguleringen av Akt sti av Ets-2. Derfor konkluderte vi med at Ets-2 regulerer uttrykket av UCA1, dess lncRNA UCA1 kan være involvert i aktiveringen av Akt signalveien ved Ets-2. Våre funn argumentere for videre forskning på dette feltet. Dette er et nytt felt med stadig økende betydning. Det er en økende betydning og interesse for å utforske funksjon og regulering av disse lncRNAs.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
