Abstract
Bakgrunn
Immundempende faktorer som regulatoriske T-celler (tregs) begrense effekten av immunterapi. Histon-deacetylase (HDAC) inhibitorer er blitt rapportert å ha antitumoraktivitet i forskjellige ondartede sykdommer og immunmodulerende effekter. Heri, rapporterer vi Tregs-målretting og immunfremmende effekten av en klasse jeg bestemt HDAC hemmer, entinostat, i kombinasjon med enten IL-2 i en murine nyrecellekarsinom (Renca) modell eller en survivin basert vaksine terapi (SurVaxM) i en kastrering resistent prostatakreft (CR Myc-cap) modell.
Metoder og resultater
Renca eller CR Myc-Cap svulster ble implantert orthotopically eller subkutant, henholdsvis. Inokulerte mus ble randomisert til fire behandlingsgrupper: kjøretøy, entinostat, cytokin eller vaksine, og kombinasjonen. Tregs i blodet ble bestemt ved FACS-analyse. Sanntids kvantitativ PCR og Western blot-analyse av isolerte T-celle-subpopulasjoner fra milt ble utført for å bestemme foxp3 gen og proteinekspresjon. Den undertrykkende funksjon av Tregs ble testet ved T-celle-proliferasjonsanalyse. Lav dose (5 mg /kg) entinostat redusert foxp3 nivåer i Tregs, og dette var forbundet med øket tumorvekst-inhibering i kombinasjon med enten IL-2 eller en SurVaxM vaksine. Entinostat nedregulert foxp3 uttrykk transcriptionally og blokkert Tregs undertrykkende funksjon uten å påvirke T effektorceller (Teffs).
In vitro
lav dose entinostat (0,5 pM) indusert STAT3 acetylering og en spesifikk hemmer av STAT3 delvis reddet entinostat-indusert nedregulering av foxp3, noe som tyder på at STAT3 signalering er involvert i foxp3 nedregulering av entinostat.
Konklusjoner
Disse resultatene viser en ny immunmodulerende effekt av klasse i HDAC hemming og gi en begrunnelse for klinisk testing av entinostat å forbedre kreft immunterapi
Citation. Shen L, Ciesielski M, Ramakrishnan S, Miles KM, Ellis L, Sotomayor P, et al. (2012) Klasse I histondeacetylase inhibitor Entinostat undertrykker regulatoriske T-celler og forbedrer immunterapi i nyre og prostata kreft Models. PLoS ONE 7 (1): e30815. doi: 10,1371 /journal.pone.0030815
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 10 august 2011; Godkjent: 21 desember 2011; Publisert: 27 januar 2012
Copyright: © 2012 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av et forskningsstipend av National Cancer Institute-23 R21CA137649. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tumor vekst representerer et resultat av kreftceller rømmer vertens immun overvåking. Til tross for noen suksesser, har immunterapeutiske intervensjoner vist begrenset nytte. En viktig hindring er representert ved tilstedeværelsen av immunsuppressive faktorer som synes å være fremherskende hos kreftpasienter. Disse immunundertrykkende komponentene omfatter Tregs [1], [2], myeloide avledet suppressorceller (MDSCs), immunologiske kontrollposter mediert av celleoverflate-molekyler slik som CTLA-4 [3] og PD-1 [4], og sirkulerende cytokiner så som TGF -β og IL-10 [5]. Studier har vist at disse toleransemekanismer kan være forårsaket av svulsten og omkringliggende stromale celler. Tregs normalt opprettholder toleransen for selvantigener og forhindre autoimmune responser [6], [7]. På den annen side har Tregs blitt identifisert som en av de store aktørene i tumor immuntoleranse. Den støtte bevis omfatter Tregs opprykk i kreftpasienter og Tregs utvidelse følgende immunoterapi [2], [8] – [11]. Ytterligere kliniske rapporter tyder på at nedbryting av tregs kan forsterke en antitumor immunrespons hos kreftpasienter.
Høy dose IL-2 er en FDA-godkjente behandling for utvalgte pasienter med metastatisk klarcellet nyrecellekreft [12], [ ,,,0],1. 3]. IL-2 terapi induserer objektive responser i omtrent 20% av pasientene med slitesterke komplett respons i en liten fraksjon. Gitt den begrensede effekten av høydose IL-2 terapi, har ekstra innsats vært rettet for å øke effekten av denne immunterapeutisk tilnærming.
Vaksine terapi forbli begrenset nytte i solide svulster, selv om vaksinen terapi Sipuleucel-T var nylig er godkjent for behandling av kastrering motstandsdyktig prostatakreft. Tregs er dominerende i ulike kreftformer, inkludert avansert prostatakreft [2]. Studier har vist at tilstedeværelsen av immunsuppressive faktorer som Tregs spiller en viktig rolle i immuntoleranse og lav effekt i vaksineterapi [14], [15]. Følgelig er kombinasjonen av vaksiner med metode (r) for å utarme eller undertrykke Tregs representerer en rasjonell strategi i prostatacancerterapi.
HDACs har vist seg å være involvert i onkogene transformasjon ved å formidle den transkripsjonelle regulering av gener som er involvert i cellesyklusprogresjon, proliferasjon og apoptose [16], [17]. HDAC-inhibitorer er under utvikling for behandling av kreft og har vist antitumoraktivitet i forskjellige tumorer. HDACs har vært preget inn i fire ulike klasser med ulike mål og subcellulære steder. I tillegg til histoner, er flere ikke-histonproteinene også reversibelt acetylert ved lysinrester og disse post-translasjonelle modifikasjoner kan også spille en viktig rolle i antitumor-virkningene av HDAC-inhibitorer [18] – [20]. Den syntetiske benzamide, entinostat, er en selektiv hemmer av klasse I HDACs. Entinostat har antitumor aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
i flere tumormodeller [21] – [24]. I tillegg har vår gruppe som tidligere er rapportert synergistisk antitumoraktivitet av entinostat i kombinasjon med høy dose IL-2 i Renca modellen [25].
Nyere eksperimentelle studier har vist at HDAC-inhibitorer har potensiell immunmodulerende aktivitet både i
n vitro Hotell og
in vivo
modeller av betennelse, autoimmunitet og transplantasjon. HDAC-inhibitorer kan påvirke immunresponser ved å regulere produksjonen av cytokiner. I en murin modell av allogen benmargstransplantasjon, en HDAC-inhibitor, vorinostat (Saha), redusert akutt graft-versus-host sykdom med undertrykkelse av pro-betennelses cytokiner slik som TNF-α, IL-1, og INF-γ [26 ]. Den HDAC-inhibitor, LAQ824, har vist seg å endre aktivering og funksjon av makrofager og dendrittiske celler. LAQ824 har også blitt funnet å modulere dendrittisk celle funksjon å inhibere Th1, men ikke Th2-effektorfunksjon [27]. I tillegg kan HDAC-inhibitorer regulere transkripsjonen av store histocompatibility klasse I og II [28], eller aktivering av kostimulerende molekyler [28], [29]. Mer nylig er det blitt rapportert at en panne HDAC-inhibitor, tricostatin A (TSA) kan øke funksjonen til Tregs og øke deres immunundertrykkende effekt
in vivo product: [30]. Videre er de positive resultater fra kliniske studier på kutane T-celle lymfomer (CTCL) antyder at HDAC-inhibitorer kan påvirke immunresponsen, siden noen av de patologiske mekanismene for CTCL blir mediert gjennom betennelse og en ubalanse i immunsystemet. Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at antitumor aktivitet av HDAC hemmere kan være delvis på grunn av deres immunmodulerende egenskaper.
I denne studien har vi forskjellige resultater i vårt system og rapportere at behandling med entinostat reduserer foxp3 uttrykk i Tregs og hemmer undertrykkende funksjon av tregs. I tillegg ble STAT3 signale vist seg å være forbundet med foxp3 nedregulering av entinostat. Denne egenskapen av entinostat kan forsterke antitumor immunrespons mot IL-2 og vaksine terapi og gir en begrunnelse for bruk av entinostat i kombinasjonsstrategier med immunterapi.
Resultater
Entinostat styrke høydose IL-2 terapi er assosiert med modulering av Tregs i tumorbærende mus
gruppe som tidligere rapportert at klasse i HDAC-inhibitor, entinostat, har en antitumoreffekt i Renca modellen [25], [31]. Entinostat ser ut til å ha en immunmodulerende effekt som fører til en synergistisk antitumoreffekt i kombinasjon med IL-2. IL-2-behandling fremmer proliferasjon og aktivering av T-effektorceller (Teffs), men også induserer immunundertrykkende Tregs med stabil ekspresjon av IL-2-reseptoren CD25. Derfor, i denne studien, har vi fokusert på effekten av entinostat på tregs. Vi har testet effekten av entinostat som en monoterapi eller i kombinasjon med IL-2 på Tregs i Renca modell. Renca celler ble inokulert orthotopically i BALB /c-mus. Tre dager etter inokulering, dyr som fikk behandling med enten bærer, IL-2, entinostat (5 mg /kg), eller en kombinasjon. Etter 5 dagers behandling ble perifert blod tatt fra hver mus, farget for celleoverflatemarkører og intracellulær foxp3 protein, og utsatt for fluorescens assosiert cellesortering (FACS) analyse. Ingen signifikante forskjeller ble observert i antall CD4
+ foxp3
+ Tregs (Fig. 1A og B). Imidlertid foxp3 proteinnivåer i CD4
+ foxp3
+ celler, slik som vist som midlere fluorescensintensitet (MFI), redusert med entinostat behandling (Fig. 1A og B). En økning i foxp3 nivåer ble observert med IL-2 behandling alene, bekrefter forestillingen om at IL-2 fremmer Tregs samtidig som den støtter T-celledeling. Ved kombinasjonsbehandling entinostat fortsatt reddet foxp3 nivåer tilbake til kontrollnivåer (Fig. 1A og B). Western blot analyser viste at
in vivo
entinostat behandling økte acetylering nivå av H3 histon i splenocytes (Fig. 1F). Antitumor-virkningene av behandlingene ble evaluert ved å vurdere tumorvekter etter to uker. Ingen betydelige kroppsvekt endringer ble observert med behandlinger. IL-2 induserte behandlingen en beskjeden reduksjon av tumorvekt ( 10%). Entinostat monoterapi ved administrering en 5 mg /kg førte til en signifikant tumor vektreduksjon sammenlignet med kontrollgruppen (~40% reduksjon, fig. 1C). Kombinasjonen av entinostat med IL-2 hadde en mye større hemmende virkning på tumorvekst (~80% reduksjon, fig. 1C). For å avgjøre om reduksjon av foxp3 uttrykk og hemming av tumorvekst indusert av entinostat var assosiert med økt immunrespons, undersøkte vi IFN-γ induksjon. IFN-γ ble svakt indusert i CD8-celler i IL-2-behandlede dyr, mens CD8-celler i kombinasjon-behandlede dyr hadde mye høyere IFN-γ induksjon (fig. 1D). Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at entinostat forbedrer CD8 celle immunrespons indusert av IL-2 og samtidig redusere foxp3 nivå i tregs.
Mus med orthotopic inokulering av Renca celler ble behandlet i 5 dager. Blod ble trukket fra mus på den femte dagen og farget for antistoffer spesifikke for CD4, CD25, og foxp3. Tumorvekter ble målt ved slutten av to ukers behandling. A og B, Effekt av entinostat på Tregs i tumorbærende mus. A, Effekter av kjøretøy, IL-2, entinostat, eller kombinasjonsbehandling på Tregs foxp3 uttrykk. Celler ble farget og utsatt for strømningscytometri-analyse. Dot tomter ble gated for CD4
+ celler. Den rektangulære området omslutter CD4
+ foxp3
+ celler, tallene på toppen representerer prosentandelen av foxp3
+ celler. Tallene på undersiden i området representerer den midlere fluorescensintensitet (MFI) av foxp3 PE farging av CD4
+ foxp3
+ -celler. B, Kvantifisering av Tregs prosent i CD4 befolkningen (venstre panel) og foxp3 nivåer (MFI) i Tregs (panel høyre) ved FACS analyse. Verdier er midler og feilfelt representerer S.D. for 5-7 prøver per gruppe. I panelet til høyre,
p
= 0,0011 for IL-2 vs kjøretøy;
p
= 0.000009 for entinostat vs. kjøretøy. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. C, Tumor vektmålingene. Kolonner, mener gram tumor; Barer, S.D. n = 5-7.
p
= 0,0209 for entinostat vs. kjøretøy;
p
= 0,0077 for kombinasjon kontra kjøretøy;
p
= 0,0272 for kombinasjon vs. entinostat. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. D, Entinostat forbedret IFN-γ type immunrespons indusert av IL-2-behandling. Splenocytter (1 x 10
6 celler) ble høstet og stimulert med PMA (20 ng /ml) og Ionomycin (1 pg /ml) i 5 timer i nærvær av Brefeldin A. Cellene ble så farget for overflatemarkører og intracellulær IFN-γ. Histogrammene viser prosentandel av IFN-γ uttrykkende celler i CD8 populasjon.
p
= 0,01 for kombinasjonen vs. IL-2. E, Entinostat redusert tumorinfiltrasjon av tregs. Tumorsnitt ble farget med anti-foxp3 antistoff for å vise infiltrasjon av tregs. Histogram viser gjennomsnittlig antall farget Tregs i tilfeldige 20 × oppløsning lyse felt (Tregs tall i hvert felt ble oppnådd ved blindet count). F, Entinostat behandling indusert H3 histone acetylering i splenocytes. BALB /c-mus ble behandlet med bærer (0,5% metocel) eller 5 mg /kg /dag entinostat med sonde i 5 dager. Cellene ble høstet fra milt og utsatt for Western blot analyse for acetylert-H3 histone.
Vi undersøkte om entinostat behandling påvirket Tregs som ble infiltrere svulstene. Immunhistokjemi farging av tumorsnitt viste at entinostat behandling redusert Tregs infiltrasjon (Fig. 1E og S1 fig.).
Vi har også testet anti-mus CD25 antistoff, PC61, å utarme Tregs [32] i Renca modell. PC61 behandling på 500 ug /mus /wk var tilstrekkelig til å utarme CD25
+ celler (fig. 2A), dramatisk redusert CD4
+ foxp3
+ Tregs celle nummer (Fig. 2A), og hadde en lignende antitumor effekt som observeres med entinostat (fig. 2B). I tillegg legger PC61 behandling ikke har en ekstra antitumor aktivitet over entinostat behandling (Fig. 2B), noe som antyder at entinostat og PC61 kan ha en redundant mekanisme aktivitet.
A, Tomter viser effekten av kjøretøy, PC61, entinostat eller kombinasjonsbehandling på CD25 og foxp3 nivåer. Kvantifisering av tregs prosentsats, foxp3 uttrykk ved FACS analyse vist som histogram. Verdier er midler og feilfelt representerer S.D. for 6-7 prøver per gruppe. B, Tumor vektmålinger fra PC61 uttømming eksperiment. Kolonner, mener gram tumor; Barer, S.D .. n = 6-7. * Representerer
p
0,05 for markerte punktet vs. kjøretøy; ** Representerer
p
. 0,01 for markerte punktet vs. kjøretøy
Entinostat synergizes med peptid vaksine terapi i en kastrering resistent prostatakreft modell
I tillegg til et cytokin terapi, vi også testet entinostat i kombinasjon med andre immunterapeutisk tilnærming, et peptid vaksine terapi, i et kastrerings motstandsdyktig prostatakreft (CR Myc-CAP) modell. Vi brukte en roman modifisert survivin peptid vaksine SVN53-67 /M57-KLH (SurVaxM) [33]. Survivin er et intracellulært tumor-assosiert antigen uttrykt i faste tumorer, inkludert prostata kreft. Nivået av Survivin ekspresjon er assosiert med tumorprogresjon og aggressivitet [34], og representerer en passende mål for vaksineterapi. En transplant kastrering resistent prostatakreft (CR Myc-cap) modellen er utviklet i vårt laboratorium [35]. Myc-cap celler, avledet fra Hi-myc transgen prostatakreft musemodell [36], ble injisert (1 × 10
6 celler /mus) subkutant i mannlige FVB mus. Tumor bærende dyr ble kirurgisk kastrert post svulst etablering og påfølgende svulster ble passert gjennom 5 ekstra runder med kirurgisk kastrerte FVB mus. Survivin uttrykk ble bekreftet i Myc-Cap svulster ved immunhistokjemi. CR Myc-Cap tumorbærende mus ble randomisert i fire grupper og behandlet med kjøretøy, entinostat (5 dager /uke, 5 mg /kg), SurVaxM (en dose /uke) eller kombinasjon. Etter tre uker med behandling, entinostat eller SurVaxM enkelt behandling viste moderat antitumoreffekt (10-25% reduksjon) (Fig. 3A og B). Men kombinasjonen av entinostat og SurVaxM dramatisk redusert tumorvekt (~80% reduksjon,
p
= 0,002) sammenlignet med enten bærer eller enkel behandlingsgrupper (Fig. 3A og B). Perifere blodcellefarging viste at behandling med entinostat alene og i kombinasjon med SurVaxM redusert foxp3 nivå i Tregs av tumorbærende mus (Fig. 3C), men hadde ingen virkning på Tregs nummer (data ikke vist).
A og B, Entinostat forbedrer antitumoreffekt av survivin vaksine, SurVaxM. FVB mus ble kastrert og subkutant inokulert med liten kastreringsresistent tumor stykker. Omtrent 7 dager etter inokulering når tumorene nådde en gjennomsnittlig størrelse på 50 mm
2, ble musene behandlet i tre uker med kjøretøy, entinostat (5 mg /kg, en dose /dag, 5 dager /uke), Survivin vaksine SurVaxM (100 ug /dose, en dose /uke), eller en kombinasjon. A, enkelt svulst vekst grafen linjer ble generert av serie caliper målinger. B, Svulster ble høstet ved slutten av behandlingen og veide (kombinasjon vs. survivin vaksine,
p
= 0,003). C, Entinostat behandling redusert foxp3 nivåer i Tregs fra CR Myc-Cap tumorbærende mus. Etter 5 dagers behandling, ble perifere blodceller samlet opp fra mus, farget for CD4 og foxp3, og underkastet FACS-analyse. Kvantifisering av foxp3 bety fluorescens intensitet (foxp3 MFI) (kjøretøy vs. entinostat,
p
= 0,0002; kombinasjon vs. survivin,
p
= 0,0004).
survivin vaksine induserer behandling antigen-spesifikke CD8-celler og entinostat synergizes med vaksine for å indusere IFN-γ immunrespons
for å vurdere nærværet av survivin antigen-spesifikke T-celler som kan bli generert som respons på vaksinering vi gjorde en survivin vaksine-spesifikt peptid-MHC klasse I tetramer bindingsbestemmelse. Tetrameren er spesifikk for en Survivin peptid-epitop [33]. Splenocytter ble isolert fra mus som mottok forskjellige behandlinger som utføres i terapien eksperimentet og underkastet Survivin spesifikk markør tetramer og overflatefarging. Bare de splenocytter fra mus som var behandlet med den Survivin vaksine (vaksine enkelt- og kombinasjonsbehandling) viste induksjon av antigen-spesifikke CD8-celler (Fig. 4A). Interessant, foreslår den intracellulære cytokin farging betydelig induksjon av CD8
+ IFN-γ
+ celler enn kjøretøy nivå i kombinasjonsgruppen, som samsvarer med den forbedrede antitumoraktivitet (fig. 4B).
A . Tetramer analyse av splenocytter oppnådd fra mus immunisert med SurVaxM. Splenocytter ble farget med anti CD8 antistoffer og Survivin spesifikke tetramers for flowcytometrisk analyse. Resultatene er basert på portstyring av CD8 + T-celler, og indikerer prosent av dobbeltmerkede celler (CD8 + /Tetramer +) med hensyn til spesifikk tetramer. B, Bad behandling førte til CD8
+ IFN-γ
+ celler induksjon. Mus ble behandlet som angitt. Splenocytter ble stimulert og intracellulær IFN-γ farging ble utført som beskrevet i figur 1D.
p
. 0,01 for kombinasjonen vs. kjøretøy
Entinostat undertrykker foxp3 genuttrykk i Treg celler og hemmer Tregs funksjon
For ytterligere å undersøke immunfremmende effekt av entinostat, behandlet vi naive BALB /c-mus med enten bærer eller entinostat (5 mg /kg eller 20 mg /kg) i 5 dager. Splenocytter og lymfeknuteceller ble høstet. Antallet Tregs og foxp3 uttrykk ble åpnet av FACS analyse.
In vivo
behandling med entinostat hadde ingen signifikant effekt på antall Tregs (CD4
+ foxp3
+ T-celler) i CD4
+ T-cellepopulasjon fra enten lymfeknuter eller milt. Men sammenlignet med kjøretøy-behandlede mus, Tregs fra behandlede mus hadde en nedgang doseavhengig i foxp3 nivåer (Fig. 5A). Effekten av entinostat på foxp3 ekspresjon ble også testet ved å måle foxp3 mRNA-nivåer i isolerte cellepopulasjon ved kvantitativ sanntids RT-PCR. Tregs (CD4
+ CD25
+) og ikke-Tregs (CD4
+ CD25
-) CD4 T-celler ble renset fra entinostat- og kjøretøy-behandlede mus ved hjelp av magnetiske kuler.
In vivo
entinostat behandling signifikant redusert foxp3 messenger RNA i Tregs, sammenlignet med Tregs fra kjøretøy behandlede mus (Fig. 5B). Den reduserte foxp3 protein-ekspresjon i behandlede Tregs ble også bekreftet ved Western blot-analyse (fig. 5C).
BALB /c-mus ble behandlet med bærer (0,5% metocel) eller 5 mg /kg /dag eller 20 mg /kg /dag av entinostat med sonde i 5 dager. Celler ble høstet fra milt og lymfeknuter. A,
In vivo
entinostat behandling reduseres uttrykket nivået av foxp3 i CD4
+ foxp3
+ (treg) celler. Celler ble farget med fluorescens-konjugert antistoff som er spesifikke for CD4, CD25, og foxp3 og utsatt for strømningscytometri-analyse. Dot tomter ble gated for CD4
+ celler. Den rektangulære området omslutter CD4
+ foxp3
+ celler, tallene på toppen representerer prosentandelen av foxp3
+ celler. Tallene på undersiden i området representerer den midlere fluorescensintensitet av foxp3 PE farging av CD4
+ foxp3
+ -celler. Panelene på høyre representerer kvantifisering av tregs prosent (øverst) og foxp3 uttrykk (nederst) i FACS analyse. Grafen viser midler, Feilstolpene representerer standardavviket for 6 prøver i hver gruppe.
p
= 0,00078 for 5 mg /kg entinostat vs. kjøretøy;
p
= 0.000004 for 20 mg /kg entinostat vs. kjøretøy;
p
= 0,0038 for 20 mg /kg entinostat vs. 5 mg /kg entinostat. α = 0,05. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. B,
In vivo
entinostat behandling redusert foxp3 mRNA nivåer i isolert Tregs. Totalt RNA ble ekstrahert fra isolerte CD4
+ CD25
+ T-celler (tregs) og CD4
+ CD25
– T-celler (Teffs) og ble analysert for foxp3 mRNA ved real time RT-PCR. Foxp3 mRNA nivåer ble normalisert til GAPDH mRNA (eller ribosomalt RNA RPL13A) og verdiene representerer midler for tre prøver (tre mus per prøve) per gruppe og har relative enheter.
p
= 0,0157 for Tregs behandlet med entinostat vs. Tregs behandlet med kjøretøy. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter. C,
In vivo
entinostat behandling redusert foxp3 protein nivå i tregs. Totalt celleprotein ble ekstrahert fra isolerte Tregs og Teffs og ble analysert for foxp3 protein ved Western blot. D, Effektene av HDAC-inhibitor, entinostat, på Tregs undertrykkende funksjon og Teffs proliferasjon. Tregs undertrykkelse assays: 2 x 10
5 CFSE-merkede Teffs ble stimulert med 0,5 ug /ml anti-CD3ε antistoff og 4 x 10
5 bestrålte antigenpresenterende celler (CD4-celler fattige splenocytter) og ko-dyrket med Tregs i forskjellige forhold til Teffs for 62-80 timer. Prosentandeler av inndelte Teffs ble beregnet ved alle forholdspunkter for hver behandling. Prosentandelen av undertrykkelse av Teffs dele ble beregnet for hvert punkt ved å sammenlikne celle dele ved hver forholdet til cellen dele i fravær av Tregs (00:01). Venstre panel: Effekt av entinostat behandling på Tregs funksjon. Høyre panel: Effekt av entinostat behandling på spredning av Teffs. Histogrammet viser prosentandelen av delt Teffs uten Tregs. Dataene er representative for tre separate eksperimenter. Verdier er midler fra tredoble målinger. * Representerer
p
0,05 for markerte punktet vs. kjøretøy; ** Representerer
p
. 0,01 for markerte punktet vs. kjøretøy
For å avgjøre om redusert foxp3 uttrykk i entinostat behandlet Tregs fører til nedsatt undertrykkende funksjon av tregs, CFSE-merket rensede CD4
+ CD25
– T-celler (Teffs) ble dyrket med anti-CD3e-antistoff og antigen-presenterende celler. Tregs ble deretter tilsatt til kulturen med forskjellig Treg vs. teff-forhold (fig. 5D). BALB /c-mus ble behandlet med bærer eller forskjellige doser av entinostat
in vivo
som angitt. Tregs ble isolert fra splenocytter fra forskjellig behandlede mus og dyrket med isolerte Teffs fra kjøretøy-behandlede mus for å teste effekten av behandlingen på tregs undertrykkende aktiviteter (Fig. 5D, venstre panel). I tillegg Teffs isolert fra splenocytter fra differensielt behandlede mus ble stimulert til å teste effekten av forskjellige behandlinger på proliferasjon kapasitet på Teffs (fig. 5D, høyre panel). Entinostat (5 mg /kg) behandlet Tregs var to til tre ganger (for eksempel ved Tregs:Teff = 1:04, 25% vs. 63% undertrykkelse) mindre effektiv i å undertrykke Teffs spredning enn kjøretøy behandlet Tregs (Fig. 5D , venstre panel). Høyere entinostat dose (20 mg /kg) ytterligere hemmet Treg undertrykkende funksjon med opptil sju ganger (Tregs:Teffs = 01:02) reduksjon (fig. 5D, venstre panel). Interessant,
in vivo
lav dose entinostat behandling (5 mg /kg) viste minimale hemming av proliferasjon kapasitet på Teffs, mens høyere dose (20 mg /kg) inhiberte signifikant kapasitet Teffs proliferasjon, i forhold til kjøretøyet behandlede Teffs (fig. 5D, panel til høyre). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at
in vivo
behandling med lav, ikke cytotoksiske dose entinostat [25] hemmer Tregs undertrykkende funksjon med minimal innflytelse på Teffs voksende kapasitet.
STAT3 er acetylert ved entinostat behandling og er assosiert med foxp3 nedregule
Vi neste undersøkt mulige signalformidlere som er ansvarlige for foxp3 nedregule indusert av entinostat. STAT3 signalering aktiveres ved acetylering og har vært implisert i foxp3 modulering [37], [38]. For å teste om STAT3 er et av målene for entinostat, HepG2-celler, en hepatomcellelinje med induserbar STAT3 signalering som brukes for STAT3 aliserte studier [38], ble behandlet i 6 timer. Behandling med 0,5 pM entinostat var tilstrekkelig til å indusere acetylering av STAT3 (Fig. 6A) uten vesentlig å endre total STAT3 proteinnivåer (Fig. 6A). I tillegg, testet vi STAT3 acetylering i splenocytter. Igjen, entinostat behandling øket acetylering av STAT3 i splenocytter (fig. 6B). For å fremme test om STAT3 er formidling av nedregulering av foxp3 av entinostat, brukte vi en svært spesifikk, celle gjennomtrengelig peptid STAT3 hemmer [39]. Entinostat behandling reduserte foxp3 nivåer i Tregs, mens nærværet av den STAT3 spesifikk hemmer delvis, men betydelig nøytraliseres den hemmende effekten av entinostat på foxp3 ekspresjon i Tregs (~ 50% nøytralisering) både i fravær og nærvær av IL-2 (fig. 6C og henholdsvis 6D,). I alle betingelsene, var det ingen signifikant forskjell i antall Tregs. Dette resultatet tyder på at STAT3 er delvis involvert i entinostat nedregulering av ekspresjon i foxp3 Tregs.
A og B, induserer Entinostat behandling STAT3 acetylering. HepG2-celler eller splenocytter ble behandlet i 6 timer, høstet, og lysert for Western immunobloting eller immunopresipitering. A, Entinostat indusert STAT3 acetylering i HepG2 celler. Øvre panel: Cellelysater ble analysert direkte og utslettet med anti-STAT3 og aktin. Bunnfelt, ble Cellelysater immunopresipitert med anti-STAT3-antistoff og deretter blottet med anti-STAT3-antistoff og med anti-acetylert lysin antistoff. B, Entinostat indusert STAT3 acetylering i splenocytes. IP og Western blot ble gjennomført som beskrevet i A. C og D, er nedregulering av foxp3 inhiberes ved å blokkere STAT3 signalering. Splenocytter ble høstet fra BALB /c-mus og satt i kultur. Kulturer ble behandlet med bærer eller 0,5 mM spesifikk STAT3 peptid inhibitor i en time, etterfulgt av kjøretøy eller 0,5 uM entinostat behandling i 23 timer. Celler ble høstet og analysert ved strømningscytometri ved å bruke fluorescens-konjugerte antistoffer som er spesifikke for CD4, og foxp3. Fixable live /dead fargestoff ble brukt til å farge celler og levende celler ble inngjerdet. Cellekulturen var i fravær (panel C) eller i nærvær (panel D) av IL-2. I hver betingelse, histogrammer viser kvantifisering av foxp3 ekspresjon i Tregs ved FACS-analyse. Grafen viser midler, feilfelt representerer standardavvik. I C,
p
= 0,0002 for entinostat vs. STAT3 hemmer + entinostat. I D,
p
= 0,00015 for entinostat vs. STAT3 hemmer + entinostat. Resultatene er representative for tre separate eksperimenter.
klasse I, men ikke klasse II HDAC hemming undertrykker foxp3 uttrykk i Tregs
in vitro
Tidligere studier har rapportert at inhibering av HDACs øker Tregs nummer, og fremmer Tregs funksjon og tilhørende immunrespons undertrykkelse [30], [40]. Derfor, undersøkte vi hvorvidt inhibering av forskjellige klasser av HDACs kan ha forskjellige effekter på Tregs. Vi testet andre HDAC hemmere, inkludert den selektive klasse I-inhibitor, MGCD0103, pan-hemmer, panobinostat, og to selektive klasse II-hemmere, MC1568 og MC1575 [41]. Splenocytter isolert fra BALB /c-mus ble dyrket med forskjellige behandlinger for 24 timer. Dosene av inhibitorer ble valgt basert på tidligere undersøkelser [41], [42]. Cellene ble høstet, farget for overflatemarkører og foxp3, og underkastet FACS-analyse. Både klasse I HDAC hemmere, entinostat og MGCD0103, nedregulert foxp3 i Tregs (Fig. 7A). Både entinostat og panobinostat redusert foxp3 protein nivåer i Tregs befolkning på en doseavhengig måte. Selektive klasse II HDAC hemmere ikke har en signifikant effekt på tregs (Fig. 7B). Disse resultatene foreslår at inhibering av klasse I, klasse II ikke HDACs fører til nedregulering av foxp3.
Splenocytter ble isolert fra BALB /c-mus og satt i kultur med forskjellige behandlingsbetingelser som er angitt i 24 timer. Cellene ble høstet, farget for overflatemarkører og intracellulær foxp3, og underkastet FACS-analyse. Plot gating og parameter indikasjon ble beskrevet i Figur 1. Histograms showet kvantifisering av foxp3 nivåer i tregs. A, både klasse I HDAC hemmere, entinostat og MGCD0103, hemme foxp3 uttrykk i tregs. Når man sammenligner entinostat med MGCD0103, ble PE konjugert anti-foxp3 antistoff brukt. B, klasse I HDAC hemmer, entinostat, og en pan-hemmer, panobinostat, men ikke klasse II HDAC hemmere, MC1568 og MC1575, hemme foxp3 uttrykk i tregs. Når man sammenligner entinostat med klasse II HDAC hemmere og den pan-hemmer, panobinostat ble Alexa 700 konjugert anti-foxp3 antistoff brukt siden andre fluorokromkonjugerte kanaler forstyrret av autofluorescence av klasse II HDAC hemmere. ** Representerer
p
. 0,01 for markert behandling vs. kjøretøy
Diskusjoner
I vår studie gir vi bevis for at klassen jeg HDAC hemmer, entinostat, hemmer Tregs og forbedrer den antitumoreffekt av to forskjellige immunterapier. I entinostat og IL-2 kombinasjonsstrategien, IL-2-aktiverte behandling og fremmet spredning av Teffs, men også aktivert Tregs (fig. 1).
