Abstract
MYC over-uttrykk som bestemmes av molekylære midler har blitt rapportert som en gunstig prognostisk biomarkør i kolorektal kreft (CRC). Men MYC uttrykk analyse er ikke tilgjengelig i rutinemessig klinisk setting. Vi har undersøkt om immunhistokjemi (IHC) for myc-proteinet ved hjelp av en ny kommersielt tilgjengelig kanin-monoklonalt antistoff [klon Y69] som for tiden er i utstrakt klinisk bruk for lymfom diagnose kan bli brukt til å forutsi utfallet i resected CRC. Myc IHC ble utført på en vev microarray (TMA) som omfatter en retrospektiv kohort av 1421 CRC pasienter og scoret forblindet at alle kliniske og patologiske data. IHC ble også utført på en subcohort av hel seksjon CRC å vurdere fargingsegenskaper og samstemmighet med TMA uttrykk. MYC over-ekspresjon ble funnet i 980 (69%) av CRC og var forbundet med tumorstadium og DNA mismatch reparasjon /BRAF status. Det var betydelig avtale mellom TMA og hel seksjon myc IHC (kappa = 0,742, p 0,01). CRC med MYC overekspresjon viste forbedret 5 års overlevelse (93,2% vs. 57,3%), med den virkning betydelig modulert av den dominerende innvirkning av tumorstadium, alder ved diagnose og lymphovascular plass invasjon status på overlevelse. Vi konkluderer med at myc-status, som bestemt ved IHC alene kan brukes til å forutsi total overlevelse hos pasienter med CRC gjennomgår kirurgisk reseksjon
relasjon:. Toon CW, Chou A, Clarkson A, DeSilva K, Houang M, Chan JCY , et al. (2014) Immunhistokjemi for Myc Spår Overlevelse i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (2): e87456. doi: 10,1371 /journal.pone.0087456
Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 04.10.2013; Godkjent: 27 desember 2013; Publisert: 04.02.2014
Copyright: © 2014 Toon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Pathology Nord personalet Specialist Trust Fund. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Christopher W. Toon er ansatt Histopath Pathology. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne
Innledning
feilregulering av MYC (HGNC: 7553). er en tidlig konsekvens av aktiverende mutasjoner i APC (HGNC: 583), en sentral pådriver mutasjon i adenom-karsinom veien i tykk- og endetarmskreft (CRC). Mediert av beta-catenin via den kanoniske Wnt vei, avvikende over-ekspresjon av myc og syklin D1 resulterer i ukontrollert cellulær proliferasjon, overdragelse en vekstfordel til kreftceller [1], [2]. Rollen MYC over-uttrykk i kjøre CRC tumorigenesis Skapet er bekreftet av genuttrykk profilering studier [3], og mer nylig av CRC genom-wide analyse som en del av Kreft Genome Atlas Network initiativ [4].
Interessant MYC over-uttrykk som bestemmes av Northern blot analyse ble rapportert som en biomarkør for godt resultat i tykk- og endetarmskreft så langt tilbake som 1996. [5] tiden dens bruk som en prognostisk biomarkør er vanskelig å rettferdiggjøre på grunn av begrenset tilgjengelighet og kostnader involvert i molekylær testing. Derfor tester for MYC over-uttrykk i CRC er for øyeblikket ikke tilgjengelig, mulig eller garantert i rutinemessig klinisk setting.
Nylig en roman svært følsom og spesifikk kanin monoklonalt antistoff rettet mot myc protein (klone Y69) har blitt tilgjengelig. Dette antistoffet har blitt validert i rutinemessig klinisk setting i formalinfiksert parafin innleiret vev, hvor myc immunohistochemsitry i kombinasjon med BCL2 immunhistokjemi, har blitt brukt for å identifisere den dårlige prognostisk gruppen av non-Hodgkin lymfom kjent som «dobbelt rammet lymfom». [6], [7] Faktisk MYC og BCL2 uttrykk som bestemmes av immunohistochemsitry i formalinfiksert parafin innebygd vev har raskt blitt en del av rutinen diagnostiske vurderingen av pasienter med høy klasse B-celle lymfom. [8].
Vi har søkt å revidere bruken av MYC uttrykk som biomarkør i CRC ved å korrelere utfall med MYC uttrykk som bestemmes av dette allment tilgjengelig kanin monoklonalt antistoff.
Materialer og metoder
CRC kullet er blitt beskrevet tidligere. [9] I korthet retrospektive CRC saker ble rekruttert ved å søke på patologi database ved Institutt for Anatomisk patologi, Royal North Shore Hospital, Sydney for pasienter som hadde definitive operasjoner for CRC mellom 2004 og 2009. I denne perioden dette senteret utføres sentralisert patologisk testing for to kvartære henvisning sykehus med dedikerte kolorektal kirurgi enheter og 4 samfunnet sykehus. Derfor denne pasienten kohort representerer en sann øyeblikksbilde av CRC tilfeller oppstått i det australske samfunnet som helhet.
Eksklusjonskriterier var svulster i ekstra-colonic og appendiceal beliggenhet, svulster behandlet utelukkende endoluminally og histologiske typer enn adenokarsinom definert av WHO 2010 systemet. [10].
Svulster ble uavhengig vurdert av tre patologer (CT, KDS og AG) for å bekrefte diagnosen og til restage svulstene i henhold til 7
th edition 2009 AJCC /TNM. [11] For resections involverer synkrone tumorer, tumor med høyest patologiske fasen ble valgt og annotert. Microarray (TMA) som inneholder duplikat 1 mm kjerner ble deretter konstruert fra tilgjengelige svulst vevsblokker
Immunohistokjemi ble utført på TMA med en kommersielt tilgjengelig kanin anti-myc antistoff (klone Y69, katt. Ab32072, Abcam, Burlingame CA USA) bruker Leica BondIII Autostainer (Leica Microsystems, Mount Waverley, Victoria, Australia) i henhold til produsentens protokoll. Glassene ble avvokset i Bond Dewax løsning (AR9222, Leica Microsystems) og hydrert i Bond Wash løsning (AR9590, Leica Microsystems). Heat indusert epitop gjenfinning ble utført i 60 minutter i produsentens alkaliske henting løsning ER2 (VBS varenummer: AR9640, Leica Microsystems). Platene ble deretter inkubert med det primære antistoff i en fortynning på 1 i 100 i 30 minutter ved romtemperatur. Antistoffpåvisning ble utført ved hjelp av biotin gratis Bond Polymer Definert Detection System (DS9713 Leica Microsystems) i henhold til produsentens protokoll. Slides ble deretter kontra med hematoksylin.
MYC over-uttrykk ble vurdert av myc IHC, rangert med en to-lags visuelt system av en praktiserende kirurgisk patolog (CT) blindet for all klinisk, patologisk og utfallet informasjon. Nukleær farging i alle intensitet på mer enn 10% av neoplastiske celler ble merket som positivt (over-uttrykt). Alle andre mønstre av flekker ble scoret som negative. En ekstern kontroll (en MYC forsterket lymfom) ble kjørt med hver gruppe med lysbilder.
DNA mismatch reparasjon (MMR) og BRAF IHC status ble bestemt ved immunhistokjemi som tidligere beskrevet [9], [12].
for å undersøke nøyaktigheten av TMA IHC tolkning, ble Myc IHC utført på hele deler av CRC på en subcohort av 98 sammenhengende CRC fra 2004, tolket av samme assessor på TMA (CT) blindet for all klinisk, patologisk og TMA data.
Sammenheng mellom MYC over-uttrykk og CRC pasient clinicopathological variabler ble undersøkt i 2 × 2 contingengy tabeller for kategoriske variabler eller ved hjelp av Mann-Whitney test for alder (tabell 1). Variabler som viste en betydning av p 0,10 ble inkludert i en binær logistisk regresjonsmodell for ytterligere å undersøke forholdet mellom MYC over-uttrykk og DNA mismatch reparasjon (MMR) /BRAF status IHC fenotype (tabell 2)
.
Oppfølging ble oppnådd ved undersøkelse av sykehus-poster, de fra kirurgenes private rom og arkiv offentlig dødsannonser og nekrologer i delstaten New South Wales, Australia. Total overlevelse ble definert som varigheten i live fra tidspunktet for endelig kirurgi. Pasientene ble fulgt opp til død eller deres siste dato for oppfølging ikke mer enn 7 år etter endelig kirurgi.
Kaplan Meier analyse ble brukt til å rapportere 5 års samlet overlevelse for CRC med og uten MYC over-uttrykk , med den forskjell vurdert av Logg Rank Test. Multivariat Cox regresjon ble brukt til å utforske sammenhengen mellom justerte effekten av MYC over-uttrykk på total overlevelse, i en full modell som inkluderte alder ved diagnose, kjønn, anatomisk sted for svulst, tumor stadium, kombinert mismatch reparasjon mangel og BRAF IHC status, tumorstørrelse, grad histologisk, nærvær eller fravær av lymphovascular plass invasjon og peritumoral lymfocyttrespons status
A s . 0,05 ble tatt som signifikant, bortsett fra i den innledende modellering ved hjelp av binær logistisk regresjon (nevnt ovenfor). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av IBM SPSS statistikk V21 på OSX.
Resultater
Totalt 1421 CRC ble vurdert på TMA. De kliniske og patologiske funksjoner er oppsummert i tabell 1. Kort fortalt var det tilnærmet lik kjønnsfordeling, med en median alder av diagnose på 74 år (spredning 17-100 år). Den 5-års overlevelse for kohorten var 66,3%, med et gjennomsnitt på 52,9% (95% CI = 5,14 til 5,44).
Myc IHC viste konsekvent atom immuno-lokalisering, og det var en synlig forskjell mellom saker som var negative (scores som negative for over-uttrykk), og de som viste svak til sterk farging i 10% eller mer neoplastiske celler (merket som positivt for over-uttrykk). Eksempler på myc IHC fargingsegenskapene er presentert i Figur 1. Utbredelsen av MYC over-uttrykk i CRC var 69%.
De kliniske og patologiske trekk ved myc IHC negative (n = 441, 31,0% ) og myc IHC positive (mYC over-uttrykt, n = 980, 69,0%) CRC er oppsummert i tabell 1. mYC over-ekspresjon var signifikant assosiert med tumorstadium og MMR /BRAF IHC fenotype, men ikke kjønn, anatomiske stedet, histologisk grad, tilstedeværelse eller fravær av lymphovascular plass invasjon, og heller ikke peritumoral lymfocyttreaksjon status. Forholdet mellom MYC over-ekspresjon og alder ved diagnose tendens til signifikans (p = 0,07).
Tabell 2 viser den innstilte effekt av MMR /BRAF IHC fenotype på myc IHC status. MYC over-uttrykk ble sterkt forbundet med MMRd /BRAFV600E IHC fenotype [odds ratio = 2,17 (95% CI = 1,45 til 3,24), p 0,01].
5-års overlevelse for CRC med MYC løpet ekspresjon var 93,2% (totalt 50
th persentilen overlevelse 3,06 år, interkvartile området 0,56 til 5,22), sammenlignet med myc negativ CRC på 57,3% (totalt 50
th persentilen overlevelse 2,32 år, interkvartile området 0,31 til 4,26) .
effekten av myc status på CRC total overlevelse vises i Figur 1. CRC med mYC overuttrykk viste signifikant bedre overlevelse sammenlignet med mYC negative saker (Logg Rank test p 0,01), med en rå effekt (univariable modell) hasardratio på 0,67 [(95% CI = 0,54 til 0,83), p 0,01]. Dette rå effekt på total overlevelse forble signifikant selv når stratifisert etter MMR /BRAF IHC fenotype [hasardratio = 0,68 (96% CI = 0,54 til 0,84), p 0,01].
I full multivariat modell, justerte effekten av MYC over-uttrykk på total overlevelse ble ubetydelig [hasardratio = 0,91 (95% CI = 0,69 til 1,20), p = 0,52] på grunn av den dominerende effekten av alder ved diagnose, tumorstadium og lymphovascular plass invasjon status og MMR mangelfull /BRAFV600E mutant fenotype IHC på overlevelse (tabell 3). Tabell 4 viser den fulle modellen herunder samspillet mellom myc IHC og MMR /BRAF status
Det var betydelig avtale mellom TMA og hele avsnittet myc IHC score. (Kappa = 0,742, p 0,01) . Alle positive TMA tilfellene var positive på hele seksjoner. Det var 11 uharmoniske tilfeller (negativ på TMA, positive på hel del), alle på grunn av usammenhengende flekker. Univariable Cox regresjon ble også utført på hele seksjoner, bekrefter forbedret total overlevelse av CRC viser MYC over-uttrykk (figur 2)
Panel A:. Kaplan Meier-kurver som viser overlegen total overlevelse av CRC med MYC over-uttrykk sammenlignet med mYC negative CRC (Log Rank test p 0,01); Panel B:. Univariable Cox regresjonsanalyse som viser MYC over-uttrykk signifikant korrelert med forbedret total overlevelse [hasardratio = 0,30 (95% CI = 0,15 til 0,60), p 0,01]
Diskusjoner
Tidligere studier på MYC-ekspresjon i CRC har vært entydige og motstridende antagelig på grunn av anvendelsen av små kullene (n varierer fra 38 til 310) og bruk av en rekke deteksjonsmetoder, inkludert IHC, fluorescerende in situ hybridisering ( FISH), RNA-baserte analyse og DNA kopiere nummer. [5], [13] – [17]. Eldre studier ved hjelp av IHC har vært begrenset ved bruk av antistoffer som viste avvikende (cytoplasmatisk) immuno-lokalisering antagelig på grunn av dårlig spesifisitet. [18].
utvikling og validering av en svært spesifikk kanin monoklonalt antistoff for myc har gjort en stor innvirkning på lymfom diagnose der kombinasjonen av MYC og BCL2 overekspresjon som bestemt ved immunohistokjemi alene er blitt brukt for å definere en dårlig prognose gruppe B-celle non Hodgkin lymfom kjent som Dobbeltreff lymfomer. [6], [7] Det er interessant i disse Lymfekreft studier hvor myc IHC og FISH vurdering har resultert i motstridende resultater, MYC uttrykk som bestemmes av IHC har vært en bedre prediktor for utfall enn den forrige gullstandarden FISH. Sannsynligvis skyldes dette at MYC overekspresjon kan være forårsaket av en rekke forskjellige cellulære prosesser snarere enn bare enkel forsterkning.
I denne sammenheng er vår studie, som er basert på en meget stor og uselektert kohort på 1421 CRC kullene ved hjelp av denne neste generasjon av spesifikk kanin monoklonalt antistoff, viser høy forekomst av mYC over-uttrykk i CRC, og enda viktigere, den potensielle rolle myc som en kraftig prognostisk biomarkør i CRC. Det faktum at MYC over-uttrykk er signifikant assosiert med bedre total overlevelse i univariable analyse er kanskje overraskende gitt dagens forståelse av karsinogent potensial av MYC dysregulation [1] – [4]. Kun én tidligere studie har vist denne effekten i CRC [5]. Mens det er ikke nok data til å postulere at det underliggende mekanisme, sammenhengen mellom karsinogent potensial (onkogenese) og overlevelse, i hvert fall for MYC, er som å være mer komplisert enn først antatt.
I denne studien har vi valgt å undersøke MYC over-uttrykk i sammenheng med CRC gruppert etter deres MMR og BRAF status, snarere enn MMR og BRAF status individuelt. Det er nå vel etablert at MMR og BRAF samhandle på komplekse måter i forhold til deres effekt på overlevelse. For eksempel, i MMR dyktige CRC, nærværet av BRAFV600E mutasjonen medfører en dårligere overlevelsen, mens i MMR mangelfulle CRC, er BRAFV600E en markør av den methylator fenotype, en gruppe av CRC som viser utmerket prognose [12], [19].
det er interessant, selv om MYC overuttrykk var sterkt assosiert med MMRd /BRAFV66E fenotype, viser deres mangel på samhandling i hele multivariat modell som MYC effekt på overlevelse ikke kan forklares fullstendig bare ved sin tilknytning til MMR /BRAF status . Dette tyder på at den prediktive effekten av MYC over-uttrykk på overlevelse er mediert delvis ved mekanismer uavhengig av MMR /BRAF status.
En av de store ulempene med vår studie er over-forenkling der MYC løpet -ekspresjon blir bestemt. Den semi-kvantitativ natur IHC er slik at endringer i IHC intensitet må være betydelig (i logaritmisk skala, ellers kjent som Weber-Fechners lov) slik at det menneskelige øyet kunne sette pris på en endring. Denne metoden for IHC anledninger har imidlertid egner seg til mer ukomplisert korrelerende analyse, for eksempel binær logistisk regresjon, og er den dominerende metoden ved hvilken de IHC er scoret i den diagnostiske klinisk miljø. Betydelig, til tross for denne ulempen vi var i stand til å demonstrere signifikante total overlevelse forskjeller på univariable analyse av myc IHC status.
En annen betydelig ulempe er mangel på sykdomsspesifikke resultater og kreftspesifikk dødelighet i vår studie kohort. Fremtidige studier som benytter disse endepunktene vil gi viktig informasjon som kan betydelig informere om klinisk praksis.
I sammendraget, viser vår studie at myc status, som bestemmes av IHC hjelp av en enkel semi-kvantitativ scoring metodikken lett utplassert i klinisk innstillingen kan brukes som en prediktor for prognose i CRC. Avgrensningen av dette prediktiv verktøyet venter ytterligere forklaring i kohorter med sykdoms konkrete resultater.
