Abstract
Målrettet terapi har blitt brukt til å bekjempe mange krefttyper; Men få har effektivt forbedret total overlevelse hos kvinner med ovarialcancer, tigge for en bedre forståelse av denne dødelige sykdommen og identifikasjon av viktige drivere av tumordannelse som kan være målrettet effektivt. Derfor brukte vi et tap-av-funksjon screening tilnærming for å identifisere molekylære sårbarheter som kan representere viktige punkter av terapeutisk intervensjon. Vi benyttet en objektiv høy gjennomstrømming dødelighet skjermen ved hjelp av en 24 088 siRNA bibliotek targeting over 6000 druggable gener og studert deres effekter på vekst og /eller overlevelse av ovarialcancer (EOC) cellelinjer. De øverste 300 «treff» som påvirker levedyktigheten til A1847 celler ble screenet på nytt over flere EOC cellelinjer og ikke-tumorigent, menneske foreviget på eggstokkene epiteliale cellelinjer. Femti-tre genet kandidater ble funnet å vise effekter i alle tumorigene cellelinjer som ble testet. Omfattende validering av disse treff raffinert listen til fire kandidater av høy kvalitet (
HSPA5
,
NDC80
,
NUF2
, og
PTN
). Mekanistiske studier viser at å kneble av tre gener fører til økt apoptose, mens
HSPA5
lyddemping ser ut til å endre cellevekst gjennom G1 cellesyklus arrest. Videre to uavhengige genuttrykk studier viser at
NDC80
,
NUF2 Hotell og
PTN
ble betydelig abnormt overexpressed i serøs adenokarsinomer. Totalt sett, våre funksjonell genomikk resultater integrert med genomikk data gir et viktig objektiv avenue mot identifisering av potensielle terapeutiske mål for medisiner, som er et presserende og udekket klinisk behov for eggstokkreft
Citation. Sethi G, Pathak HB, Zhang H, Zhou Y, Einarson MB, Vathipadiekal V, et al. (2012) En RNA interferens fra dødelighets Screen of Human Druggable Genome å identifisere Molecular Problemer i ovarialcancer. PLoS ONE 7 (10): e47086. doi: 10,1371 /journal.pone.0047086
Redaktør: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center i San Antonio, USA
mottatt: 13. juni 2012; Godkjent: 07.09.2012; Publisert: 09.10.2012
Copyright: © Sethi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet delvis av et program prosjektstøtte fra Ovarian Cancer Research Fund (https://www.ocrf.org) og et stipend fra NCI (CA140323) til AKG. Forfatterne erkjenner støtte fra University of Kansas Cancer Center og Kansas Biovitenskap Tilsynet Eminent Scholar Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer er den nest vanligste gynekologisk kreft, og en av de dødeligste blant kvinner, med anslagsvis 22,280 nye tilfeller og 15.500 dødsfall for 2012. [1] blant de forskjellige typer epitelial eggstokkreft, som inkluderer serøs, mucinous, klarcellet og livmor [2], [3], de fleste dødsfall fra kreft i eggstokkene forekomme hos pasienter med avansert stadium, høy grad av serøs eggstokkreft. [4] Som sådan, er det et stort behov for nye terapeutiske tilnærminger for å bekjempe denne dødelige sykdommen.
Utvikling av nye behandlingsformer, spesielt i en tid med målrettede behandlinger og personlig medisin, er vanligvis drevet ved å forstå den underliggende biologi, molekylærbiologi og biokjemi av kreftceller og deres omkringliggende microenvironments rettet mot genetiske endringer. [5] Dette er et felles tema i medisiner og kan gi spesifisitet, men kan ikke generelt gi bredde i målretting. Kreftceller kan utvikle seg som mangler målrettede genetiske forandringer eller som er motstandsdyktig og kan føre til progressiv sykdom. [5] Derfor er det viktig å utvide vår bevæpning av behandlinger, men enda viktigere vårt konsept viktige narkotika mål. Den evolusjonære natur kreft innebærer, i motsetning til konvensjonell visdom, at de grunnleggende funksjonene i noen terapi for konsekvent kur eller kontroll av kreft skal være uavhengig av de spesielle veier av tumorcelle evolusjon, og uavhengig av noen spesielle genetiske eller epigenetiske forandringer. Selv om den genetiske og epigenetisk kompleksiteten av kreft er nesten ubegrenset, er tumorcelle evolusjon begrenset. [6], [7] En ondartet celle vil resultere, hvis og bare hvis, de forandringer føre til normal cellemaskineriet for å utføre prosesser av spredning og invasivitet.
Omløps drug discovery innsats en tendens til å fokusere på vanlig mutert signaltransduksjonsveiene, for eksempel, har en rekke vekstfaktor reseptorer og nedstrøms modulatorer (Fosfatase og kinaser) som arbeider sammen for å fremme vekst, men er ikke det sentrale maskiner. Derfor utførte vi ikke-partisk høy gjennomstrømming dødelighet skjermer (HTS) av små interfererende RNA (siRNAs) for å identifisere gener som er avgjørende for ovarian tumor cellevekst og overlevelse. Den øverste treff i utstrakt grad ble validert og deres kliniske verdi vurderes. Total, vi fant
NDC80
,
NUF2 Hotell og
PTN
som viktige molekylære sårbarheter, som representerer potensielt viktige terapeutiske mål i eggstokkreft.
Resultater
HTS av Druggable Genome
den primære høy gjennomstrømming RNAi skjermen ble utført (som vist i figur S1 A) ved hjelp av menneskelig Druggable Genome Library (Dharmacon) (tabell S1) som består av 24,088 sirnas målretting 6022 gener ved hjelp av A1847 celler, en epitelial ovarialcancer (EOC) cellelinje, som konsekvent overgitt reproduserbare transfeksjonsteknologier data under HTS forhold. Positive og negative kontroll interne referansebrønnene ble inkludert på hver plate for å tillate beregning av transfeksjon effektivitet (se analytiker S1 for ytterligere detaljer). A1847 celler ble transfektert bruker HTS betingelser som beskrevet i Materialer og Metoder delen. De normaliserte levedyktighet score (definert som (fluorescens intensitet
prøve) /(median fluorescensintensitet
referanse)) oppnås gjennom HTS vises en Gauss-fordeling (figur S1B). Etter statistisk dataanalyse (se analytiker S1), ble totalt 300 gener som representerer ~ 5% av genene målrettet av dette biblioteket valgt for inkludering i den neste runden av screening.
HTS av et panel av EOC celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP Bruke en undergruppe av Druggable Genome
Deretter fant vi ut hvilke av de 300 genene identifisert som hits fra den primære skjermen gjensidig påvirket cellevekst og overlevelse over flere EOC cellelinjer ved hjelp av en uavhengig siRNA bibliotek (tabell S2). Denne nye fokusert bibliotek ble utviklet ved hjelp av en helt ny pool av fire siRNA sekvenser rettet mot hvert gen for å minimalisere de potensielle falske-positive fra den primære skjermen på grunn av off-target effekter. Denne strategien med å bruke et annet sett av siRNA bassenger for de sekundære skjermer har blitt vedtatt som en forlengelse skritt i seg selv. [8] Transfeksjon forhold for ytterligere syv eggstokkene tumorigene cellelinjer (A2780, CP70, C30, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3 og UPN275) ble deretter optimalisert for HTS (Tabell S3). Disse syv nye EOC-cellelinjer og den A1847 cellelinje ble deretter underkastet HTS ved bruk av delmengde biblioteket rettet mot de 300 gener. En levedyktighet resultatet ble utledet for alle 300 siRNA bassenger i hver cellelinje (vist grafisk i figur 1A) som varierte 0,09 til 1,20 på tvers av cellelinjer. «treff» for hver av de åtte cellelinjer ble valgt på grunnlag av både statistisk signifikans (false funnrate (FDR) 0,05) og biologisk betydning (levedyktighet poengsum 0,85) (se Tilleggsinformasjon S1 for ytterligere detaljer). En varme kart av treffene på tvers av hver EOC cellelinje generert ved hjelp av MultiExperiment Viser [9], [10] og skjæringspunktet mellom treff mellom de cellelinjer er vist skjematisk i figur 2A. Totalt 53 treff ble betraktet som signifikant i alle åtte EOC cellelinjer (figur 2A og tabell S4). Den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienten (r) for de tekniske replikater på tvers av alle cellelinjene var 0,91 ± 0,03 (figur S2A).
skjermer på et panel av EOC og HiO cellelinjer. A. Åtte EOC cellelinjer ble omvendt tilført med siRNAs rettet mot 300 gener identifisert fra den primære screening av A1847 cellelinje ved hjelp transfeksjonsteknologier parametre optimalisert for hver cellelinje (se tabell S3). Hver sirkel representerer et gjennomsnitt levedyktighet score fra tekniske replikater følgende stanse av et bestemt gen. Den grå stiplede linje representerer den avskåret verdi for levedyktigheten score (0,85) for å velge treff. B. Tre HiO cellelinjer ble transfektert ved hjelp av parametre optimalisert for hver (se tabell S3).
A. En varme kart representasjon av levedyktighet score for åtte EOC og tre HIO cellelinjer oppnås fra sekundære skjermer av siRNA bibliotek targeting 300 gener. Alle levedyktighet rille verdier varierer mellom 0,12 og 1,53. Nyanser av grønt representerer redusert levedyktighet ( 0,80), representerer nyanser av rødt økt levedyktighet ( 0,80), og svart representerer en levedyktighet score på 0,80. Varmen kartet er generert ved hjelp MultiExperiment Viewer. Blomster diagrammer i gult og blått viser antall treff på tvers enten åtte EOC eller tre HiO cellelinjer, henholdsvis, og krysset av treff innenfor hver gruppe. B. En Venn-diagram viser antall treff i felles mellom hios og EOCs og antall treff unik for hver gruppe.
PANTHER biologiske klassifiseringssystemet [11] viste at «metabolske prosesser» ble den største kategorien (~43%) som disse 53 genene tilhørte (figur S3A). Nærmere bestemt, når funksjonell karakterisering av disse genene ble utført ved anvendelse av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare, ble det vist at 53 treff ble anriket for gener relatert til proteinsyntese som involverer ribosomale proteiner og forlengelsesfaktorer (fig S3b). Nylige rapporter har gitt bevis for at i tillegg til engasjement i proteinsyntese, ribosomale proteiner og forlengelsesfaktorer har en rolle i cellesyklusregulering og overlevelse. [12], [13], [14], [15] Legemidler rettet mot ulike molekylære komponentene som er involvert i proteinsyntesen maskiner allerede i kliniske studier for ulike krefttyper, inkludert bryst, tykktarm, og kolorektal kreft [16], [17], [18], som støtter den translatoriske potensialet i treff. Network karakterisering ved hjelp av IPA programvare viste at genene i nettverket med høyest poengsum utstilt sine nedstrøms effekter gjennom, ERK1 /2 og AKT, viktige overlevelse gener som har vært innblandet som formidlere av store onkogene trasé i eggstokkreft (figur S3C) [19 ], [20], [21], [22].
HTS av ikke-tumorigene HiO Lines
Deretter fant vi ut hvilke av hits hadde størst effekt på EOC cellelinjer og liten eller ingen virkning på den ikke-tumorigen human udødeliggjort eggstokk flate epitel (HIO) cellelinjer. Vi har derfor undersøkt de 53 treff for virkninger på levedyktigheten til tre Hio cellelinjer (HIO80, HIO120 og HIO117). Selv om vi var interessert i screening bare 53 treff, for å opprettholde samme screening format og minimere eventuelle tekniske forskjeller i hvordan siRNA skjermene ble utført for HiO cellelinjer, vi igjen brukt skikken siRNA bibliotek rettet mot alle 300 gener. En levedyktighet Poengsummen ble utledet følgende stanse av hvert gen (figur 1B). Den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienten mellom tekniske replikater for de tre HiO cellelinjer (figur S2B, gjennomsnittlig r = 0,90 ± 0,03) var lik som EOC cellelinjer.
Treff for HiO cellelinjer ble valgt som som er beskrevet ovenfor (normalisert levedyktighet stillingen 0,85 og FDR mindre enn 5%). Totalt 74 treff ble identifisert felles for alle tre HiO cellelinjer (figur 2A). En Venn-diagram viser skjæringspunktet mellom slagene mellom EOC og HiO cellelinjer i figur 2B. Førti-syv treff var felles mellom de to gruppene. Men det var seks treff unike for EOC cellelinjer (gener som påvirket levedyktigheten til alle åtte av EOC cellelinjer, men ikke alle de tre HiO cellelinjer) som vi har valgt for ytterligere validering. Vi har også valgt en ekstra gen,
NUF2
, for videre valideringsstudier.
NUF2
, selv om det ikke er et unikt hit til EOC-cellelinjer, viste den laveste poengsum overlevelsesindeks, er definert som forholdet mellom den gjennomsnittlige normaliserte levedyktighet EOC-cellelinjer til den gjennomsnittlige normaliserte levedyktighet av Hio cellelinjer (tabell S4). Disse sju gener (
BCAR3
,
HSPA5
,
NAMPT
,
NDC80
,
NUF2
,
PTN
og
RPS19
) ble videre analysert for potensielle off-target effekter.
Deconvolution av siRNA Pools
for å utelukke off-target effekter, vi individuelt evaluert fire sirnas fra siRNA bassenger som brukes i de sekundære skjermer rettet mot de sju gener. De 28 individuelle sirnas i deconvolution skjermen (tabell S5) ble evaluert i panelet av EOC cellelinjer. For å kunne ta imot en hvilken som helst av de syv gener som å ha de gyldige on-target effekt på levedyktigheten av EOC cellelinjer, kreves vi at minst to av de fire individuelle sirnas målrettet mot hvert gen resulterte i en levedyktighet poengsum på 0,85 eller mindre med en FDR på mindre enn 5% på tvers av alle åtte av de EOC cellelinjer. [23], [24] Basert på disse strenge kriterier, fire gener,
HSPA5
,
NDC80
,
NUF2
, og
PTN
, var ansett for å være på målet, validerte treff (figur 3A og tabell 1). Deretter samlet vi de to mest effektive siRNA arter (uthevet i grønt, tabell S5) målrettet mot hver av de fire genene og kvantifisert graden av reduksjon i cellelevedyktighet for hver cellelinje. Disse optimale siRNA bassenger resulterte i mer enn 30% reduksjon i cellelevedyktighet på tvers av et flertall av EOC-cellelinjer (figur 3B).
A. De syv treff valgt for videre studier ble validert ved å utføre dekonvolvering skjermer der enkelte sirnas som opprinnelig var en del av en pool av fire siRNAs i de sekundære skjermene ble vurdert for deres effekter på celle levedyktighet. For hvert treff blir validert, er den gjennomsnittlige normalis levedyktighet score (± SD) etter genet Slå med hvert av de fire arter av sirnas evaluert i de åtte EOC cellelinjer vist. Treff ble vurdert på målet om levedyktighet score på mindre enn 0,85 ble observert for alle åtte EOC cellelinjer i minst to uavhengige siRNA arter rettet mot et gen. De søylediagrammer representerer de åtte EOC cellelinjer i følgende rekkefølge: A1847, A2780, C30, CP70, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3, og UPN275. B. De to mest effektive sirnas målrettet mot hvert gen ble slått sammen (12,5 nM hver siRNA arter) og virkningen på cellelevedyktigheten ble kvantifisert. Stolpene representerer de åtte EOC cellelinjer som beskrevet i panel AC QRT-PCR ble utført på alle de åtte EOC cellelinjene følgende gen tie i 72 timer ved anvendelse av en pool av de to mest effektive sirnas identifisert fra antifoldings studiene fra panel A for de fire treff som ble bestemt til å være i rute. Stjernen representerer
PTN
mRNA nivåer som er under nivået for påvisning følgende siRNA behandling (dvs. komplett knockdown av mRNA). D. Western blot analyse ble utført etter genet Slå for enten 72 timer (
HSPA5
,
NDC80
, og
PTN
) eller 120 h (
NUF2
) for å bestemme nivået av knockdown på proteinnivået i A1847 celler. Immuno blotter ble kvantifisert ved hjelp AlphaView programvare, versjon 3.3 (Cell biovitenskap).
Som en ekstra sjekk på evnen til siRNAs til riktig målrette sine mRNA, brukte vi den optimale pool av de to mest effektive sirnas (figur 3B) og utført kvantitativ RT-PCR for å bestemme nivået av mRNA knockdown etter transfeksjon av de sammenslåtte sirnas for hver cellelinje (figur 3C). Messenger RNA nivåer av
HSPA5
,
NDC80
,
NUF2
, og
PTN
tvers av alle de åtte EOC cellelinjer ble vist å bli redusert med en gjennomsnitt på 67%, 87%, 77% og 96%, respektivt. Western blot-analyse etter transfeksjon av en cellelinje EOC, A1847, ble gjennomført som et ekstra middel for å demonstrere spesifisiteten av siRNA bassengene ved å evaluere de cellulære nivåer av de respektive proteiner for mRNAer som blir målrettet. Alle fire siRNA bassenger nedregulert proteinnivå for sine respektive mRNA mål ved -50% eller mer i denne cellelinjen (figur 3D).
Påvirkning av apoptose og cellecyklusprogresjonen
endepunkt parameter av celle levedyktighet som vi pleide å identifisere treff i HTS studiene gir begrenset informasjon om mekanismen av redusert celle levedyktighet /vekst indusert av genet demping. Vi har derfor undersøkt de funksjonelle virkningene av målretting hver av de fire validerte treff på apoptose og cellesyklusprogresjon ved hjelp av to EOC cellelinjer, A1847 og A2780. Vi transfektert disse cellelinjene med en pool av de to mest effektive siRNA-sekvenser (12,5 nM hver siRNA, den samme siRNA bassenget brukt for kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og Western blot-analyse) for hver av de fire validerte treff (
HSPA5, NDC80, NUF2
og
PTN
) og målte effektene på apoptose og cellesyklusprogresjon 72 timer etter transfeksjon i 96-brønners plater. I A2780-celler, knockdown av alle fire gener som resulterte i en økning i apoptotiske celler som målt ved hjelp av positiv annexin V-farging ved hjelp av et Guava flowcytometer i forhold til celler transfektert med
GL2
for målretting for kontroll siRNA (figur 4A). I gjennomsnitt var det en 2,5 ganger økning i apoptotiske celler. Men i disse cellene, var det ingen signifikant effekt på cellesyklus etter knockdown av disse fire treff (figur 4B).
A1847 og A2780 celler ble transfektert med
HSPA5
,
NDC80
,
NUF2
,
PTN
eller
GL2
sirnas. Syttito timer etter transfeksjon ble cellene høstet og behandlet for analyse av apoptose eller cellesyklusprogresjon. A. C. Den fraksjon av apoptotiske celler ble målt ved hjelp av annexin V-farging fulgt av telling ved hjelp av en Guava flowcytometer (Millipore). Den sammenleggbare endringen i apoptotiske celler er vist (gjennomsnitt ± SD, n = 3). B D. Den fraksjon av cellene i hver fase av cellesyklusen ble målt ved propidiumjodidfarging fulgt av oppregning hjelp av Guava instrumentet. Den fold-endring for hver celle syklus fase er vist (gjennomsnitt ± SD, n = 3).
I A1847 celler, knockdown av tre gener (
NDC80
,
NUF2 Hotell og
PTN
) resulterte i en 1,7 ganger økning i apoptotiske celler i forhold til celler transfektert med
GL2
for målretting for kontroll siRNA (Figur 4C). Knockdown av
HSPA5
resulterte ikke i noen betydelig økning i apoptose (figur 4C). Vi har imidlertid observere at dens knockdown resultere i en to-gangers økning i populasjonen av celler i G1 fasen av cellesyklusen, og en tilsvarende 2-gangers reduksjon i G2 /M-fasen (Figur 4D). Knockdown av
NDC80
,
NUF2
, og
PTN
i A1847-celler resulterte i en svak økning i antallet av celler i S-fasen (Figur 4D). Dette var imidlertid økningen i gjennomsnitt mindre enn 1,5 ganger og synes ikke å være svært statistisk signifikant. Knockdown av disse fire genene ikke har en målbar effekt på overlevelse av de ikke-tumorigene HIO80 celler (figur S4).
Vurdering av Validert Treff i kliniske prøver
Serous adenokarsinom er den viktigste subtypen av epitelial eggstokkreft. For å måle den potensielle kliniske betydningen av de fire validerte treff, undersøkte vi Kreft Genome Atlas (TCGA) eggstokk serøs adenokarsinom database. [25] genuttrykk data på de fire validerte hits fra 494 serøse adenokarsinomer ble innhentet fra TCGA portal (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp). Uttrykk for
NDC80
,
NUF2
, og
PTN
er oppregulert ved ≥1.5 ganger i 98%, 99% og 37% av tumorprøver, henholdsvis (figur 5); imidlertid bare 1% av prøvene viste ≥1.5-gangers overekspresjon for
HSPA5
med ca. 87% av prøvene viser redusert ekspresjon i forhold til normalen (figur 5). Ingen av disse genene er mutert i mer enn 1% av prøvene (data ikke vist). Vi neste analysert kopi nummer variasjon (CNV) og DNA metylering for
NDC80
,
NUF2 Hotell og
PTN
bruker TCGA database. CNV analyse viste lavt nivå kopitall gevinster ( 1,2 ganger) i 12%, 39% og 36% av prøvene for
NDC80 henholdsvis NUF2 og PTN, etter, og en kopi nummer tap i 41% av prøvene for
HSPA5
genet. Det var en svak, men statistisk signifikant sammenheng mellom genekspresjon og kopiantall for de tre gener på tvers av 494 prøver (figur S5a). Videre, for disse tre gener fant vi at i gjennomsnitt prøvene med kopi nummer gevinst viste en 1,6 ganger økning i genuttrykk i forhold til prøvene uten kopiantall gevinst (p-verdi 0,0001, 0,0001, og 0,25). i ≥94% av tumorprøver Men vi fant ingen statistisk signifikant sammenheng mellom uttrykk og formidler metylering for noen av disse genene i TCGA datasett (data ikke vist).
TCGA datasett på 494 eggstokkene serøs adenokarsinomer ble forespurt å bestemme mRNA uttrykk nivåer (log
2 (tumor /normal ratio)) av
NDC80
,
NUF2
,
PTN, etter og
HSPA5
. Disse dataene er vist som søylediagrammer med grå stiplede linjene indikerer hvor mange prosent av prøvene med 1,5 ganger, tre ganger, fem ganger og 10 ganger overuttrykk sammenlignet med uovertruffen normale prøver i TCGA datasettet.
Validering av klinisk betydning hos en uavhengig Cohort
for ytterligere å etablere potensialet tilknytning til patogenesen av denne sykdommen, undersøkte vi uttrykket av de fire beste validerte treff på en selvstendig genet profilering datasett av primær eggstokktumorprøver . [26] genuttrykk profiler av microdissected, sent stadium, høy klasse på eggstokkene serøs karsinom (n = 53) og microdissected menneskelig eggstokkreft overflaten epithelial (HOSE) prøver (n = 10) ble evaluert. Normaliserte ekspresjonsnivåene for alle tumorprøver er vist i figur 6A. Vi fant at 48/53 (90%) av tumorprøver ble overekspresjon
NDC80
av 1,5 ganger eller større. Likeledes 53/53 prøver (100%) for
NUF2 Hotell og 24/53 prøver (42%) for
PTN
ble funnet å være overuttrykt ved ≥1.5-fold. Disse dataene korrelerer godt med TCGA data om uttrykk i eggstokkene tumorprøver.
HSPA5
ble overuttrykt i 8/53 (15%) av prøvene. Økningen i gjennomsnittlig mRNA-nivåer på tvers av tumorprøver i forhold til de normale HOSE prøvene var statistisk signifikant for alle fire gener (p 0,005) (figur 6b). Vi vurderte også den prognostiske verdi av disse genene ved å utføre Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse av intensitetsmålingene fra mikroarray data til de fire genene med de tilsvarende kliniske data fra hver pasient. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse for
NUF2
antydet at et høyt nivå av mRNA uttrykk var relatert til dårlig prognose hos disse pasientene (Figur S6a). Analyse for de andre tre gener var ikke statistisk signifikant. (Data ikke vist). En tilsvarende prognostisk verdi av
NUF2
mRNA nivåer ble funnet fra overlevelsesanalyse av TCGA data (figur S6b).
A. Vist er de genuttrykk nivåer for 53 serøse adenokarsinomer normalisert til gjennomsnitts genuttrykk nivåer målt i normal eggstokkvev (n = 10). B. Vist er de midlere genuttrykk nivåer over de serøse adenokarsinomer for
NDC80
,
NUF2, PTN Hotell og
HSPA5., En to-tailed t-test viser at økning av genekspresjon i tumorprøver er statistisk signifikant i forhold til normalt vev. *** = P 0,0005; ** = P 0,005; * = P. 0,05
Diskusjoner
De høye frafallsrater av narkotika utviklingsprosjekter for målrettet terapi [27], nødvendiggjør identifisering og validering av nye druggable molekylære mål, med sin rolle in ovarian cancer klart definert for å minimalisere svikt av legemidlet under utviklingen rørledningen. Ved hjelp av en integrert RNAi screening tilnærming for å målrette over 6000 druggable gener vi identifisert 53 som var nødvendig for vekst og overlevelse over et panel av EOC cellelinjer; syv av disse var hovedsakelig aktiv i tumorigene celler og ble ansett for ytterligere dekonvolvering og valideringsstudier. Fire kandidater ut av de syv (
HSPA5
,
NDC80
,
NUF2
, og
PTN
) til slutt viste seg å være gyldige treff for EOC celler med minimale effekter på ikke-tumorigene HiO celler.
tap-av-funksjon screeningstudier rapportert i denne artikkelen har gitt oss en funksjonell genomikk øyeblikksbilde av nye molekylære sårbarheter i ovarialcancer utenfor riket av vanlige målrettet molekylære signalveier. Vi har studert de fire validerte mål (
HSPA5
,
NDC80
,
NUF2 Hotell og
PTN
), alle med en rolle i vekst eller overlevelse av EOC celler, ved hjelp av
in vitro
cellebaserte analyser. Resultatene viser at eggstokkene tumorigene celler i gjennomsnitt er relativt mer utsatt for kandidat mål sammenlignet med ikke-tumorigene celler som tyder på en mulig terapeutisk vindu for sensibilisering. Alle fire gener har tidligere blitt rapportert som treffer i RNA interferens skjermer. [28], [29], [30] Alle fire mål koder for proteiner mottagelig for terapeutisk intervensjon og har tidligere blitt rapportert til å delta i cellesyklus trasé eller overlevelses baner i andre krefttyper. [31], [32], [33] genomikkdata data fra TCGA og Birrer lab ytterligere støtte ideen om at minst tre av målene (
NDC80
,
NUF2
,
PTN
) det bør være selektiv sårbarhet for legemiddel i tumorceller i forhold til normale celler gitt betydelig oppregulering i serøs adenokarsinomer. [34] For tiden er de mest lovende hemmere rettet mot disse kandidatene har INH11 [35] som retter seg mot den NDC80 /NUF2 vei, de nøytraliserende anti-PTN-antistoffer [36] som funksjonelt hemme tumorvekst fremme virksomheten til PTN, og epigallocatechin gallate som hemmer HSPA5. [37] I tillegg har siRNA-baserte legemidler også vist seg å være gjennomførbare alternativer for
in vivo
terapi [38], [39], [40] gir oss muligheter til å gå videre med prekliniske studier for å måle effektiviteten målretting våre fire treff hjelp ortotopiske, xenograft musemodeller av eggstokkreft.
HSPA5 plakater (tabell 1) er et gen hvis produkt er en sentral regulator for endoplasmatiske retikulum homeostase som er avgjørende for overlevelse av eukaryote celler. [41] HSPA5 er en stress-induserbar ER anstand som er sterkt indusert i et bredt spekter av tumorer gjennom faktorer som hypoksi og acidose i mikromiljøet av dårlig perfuserte tumorer. [41] I en tidligere studie, antistoffer rettet mot celleoverflaten HSPA5 indusert apoptose i SKOV3 celler. [42] I den aktuelle studien, stanse av HSPA5 indusert betydelig apoptose i A2780 celler og viste en signifikant cellesyklus arrest av A1847 celler i G1 fasen. Genuttrykk data fra TCGA tyder på at redusert uttrykk er mer vanlig for dette genet, som er i strid med våre screening resultater. CNV analyse viser at
HSPA5
er tapt i 41% av prøvene og mutasjonsanalyse av TCGA data viser at
HSPA5
er mutert i mindre enn 1% av prøvene. Gitt redusert uttrykk, genet sletting, og mangel på mutasjoner i tumorprøver fra ovarian kreftpasienter, er flere studier er nødvendig for å få en bedre forståelse av virkningsmekanismen og den kliniske betydningen av dette treffet for eggstokkreft.
i tråd med våre screening data,
NDC80 Hotell og
NUF2
er overexpressed i nesten 100% av prøvene og
PTN
er overuttrykt i ~40% av prøver for to uavhengige kohorter av pasientprøver. Protein produkter av
NDC80 product: (
HEC1
,
KNTC2
) og
NUF2 product: (
CDCA1
) er en del av en mitotisk komplekset involvert i kinetochore interaksjoner og spindelenheten sjekkpunkt i mitose. [43] Mitosis feilregulering er en vanlig årsak i kreftutvikling. [44] I en tidligere studie har siRNA mediert knockdown mot
NDC80 Hotell og
NUF2
vist seg å føre til unormal mitotisk exit og indusere apoptose i tykktarmskreft og magekreft cellelinjer. [32] I en annen studie stanse av
NDC80
i en EOC cellelinje, SKOV3.ip1, foreslått at en økning i apoptose-relaterte celledød. [45] Både
NDC80 Hotell og
NUF2
har vist seg å være opp regulert i hjerne, lever, og brystkreft. [46] Over-uttrykk for
NDC80 Hotell og
NUF2
har vært knyttet til dårlig klinisk prognose hos pasienter med brystkreft og ikke-småcellet lungekreft [43], [47]. Forstyrrelse av NDC80 og NUF2 kompleksdannelse ved hjelp av et lite molekyl-inhibitor, INH1, har vist seg å redusere spredning i brystcancerceller og redusere tumorvekst i en xenograft musemodell. [35] kinetochore komponenter, spesielt NDC80 og NUF2, er foreslått som potensielle mål for kreftbehandling. [48] Vår studie er den første rapporten om NDC80 og NUF2 som potensielle narkotika mål for behandling av eggstokkreft.
PTN plakater (pleiotrofinprotein,
HARP
) er en annen interessant gen identifisert hvis produkt er en vekstfaktor kjent for å lokke fram nedstrøms overlevelse signalveier gjennom flere reseptorer nemlig ALK, SDC3, SDC1 og PTPRb /z. [49] Det har blitt vist å spille en sentral rolle i tumorgenese i bukspyttkjertel, hjerne og brysttumormodeller. [50] Det er involvert i celle transformasjon, vekst, overlevelse, migrasjon og angiogenese.
PTN
genet uttrykkes sterkt under embryogenesen men viser svært begrenset uttrykk i voksen vev, hvor det er begrenset til hjernen. [51], [52], [53], [54] Vi har vist ved hjelp av ELISA-analyser som PTN signifikant forhøyet i kondisjonert medium av eggstokkreft cellelinjer undersøkt (G. Sethi og A.K. Godwin, upubliserte data).
