Abstract
Bakgrunn
mikroRNA-21 er oppregulert i en rekke kreftformer som, bryst, colorectal, lunge, hode og nakke etc. Men reguleringen av MIR-21 nyrecellekreft (RCC) har ennå ikke undersøkt systematisk.
Metoder og resultater
Vi målte MIR-21 nivåer i 54 par av nyrekreft og deres normale matchet vev ved sanntid PCR. Uttrykket nivået av MIR-21 ble korrelert med fem års overlevelse og patologisk stadium. Funksjonelle studier ble gjort etter å hemme MIR-21 i RCC cellelinjer. Vi studerte
in vitro Hotell og
in vivo
effekter av chemo forebyggende middel genistein på MIR-21 uttrykk. I 48 tilfeller (90%), ble Mir-21 økt. Alle pasienter med lav MIR-21 uttrykk som overlevde 5 år, mens med høy MIR-21 uttrykk, overlevde bare 50%. Høyere ekspresjon av MIR-21 er forbundet med en økning i den fasen av nyrekreft. Funksjonelle studier etter hemme miRNA-21 i RCC cellelinjer viser cellesyklus arrest, induksjon av apoptose og redusert invasive og trekkmuligheter. Western blot-analyse viste en økning i ekspresjonen av p21 og p38 MAP kinase-gener og en reduksjon i cyclin E2. Genistein hemmet uttrykket av MIR-21 i A-498 celler og i svulstene dannet etter injisering genistein behandlet A-498 celler i nakne mus foruten å hemme tumordannelse.
Konklusjoner
Den aktuelle studien viser en klar sammenheng mellom MIR-21 uttrykk og kliniske kjennetegn ved nyrekreft. Følgelig tror vi at MIR-21 kan anvendes som en tumormarkør og dens inhibering kan vise seg å være anvendelige ved kontroll av cancer med oppregulert MIR-21
relasjon:. Zaman MS, Shahryari V, G Deng, Thamminana S, Saini S, Majid S, et al. (2012) oppregulering av mikroRNA-21 korrelerer med lavere nyrekreft overlevelse. PLoS ONE 7 (2): e31060. doi: 10,1371 /journal.pone.0031060
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 01.11.2011; Godkjent: 01.01.2012; Publisert: 08.02.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Veterans Association Merit Review, Veterans Association Forskning Enhancement Award Program og National Institutes of Health Grant RO1CA130860 (til rektor etterforsker, Dr. R. Dahiya). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs er små ikke-kodende RNA som spiller viktige roller i en rekke cellulære prosesser, inkludert utvikling, spredning og apoptose [1]. Siden mirnas er involvert i kritiske cellulære prosesser, har nylige studier vist at de er også involvert i patogenesen av forskjellige sykdommer, inkludert de av nyrene. Karakteristiske miRNA signaturer for flere epiteliale kreftformer, inkludert bryst, lunge, bukspyttkjertel, mage og nyrekreftformer, har blitt rapportert [2], [3], [4], [5]. Histologisk bevis viser at det finnes flere varianter av ondartet nyrecellekreft,
nemlig.
Klart celle, papillær, chromophobe og samlekanal karsinom [6], [7], [8], [9]. Flere studier har vist differensial ekspresjon av miRNA i disse varianter av nyrecellekarsinom [10], [11], [12]. MikroRNA-21 er oppregulert i en rekke kreftformer, som brystkreft, tykktarms, lunge, hode og nakke, etc. Men reguleringen og funksjonell rolle MIR-21 i nyrekreft har ennå ikke blitt systematisk undersøkt. I denne studien målte vi Mir-21 nivåer i 54 par med menneskelige nyrekreft og deres normale matchet vev ved real-time PCR. Ekspresjonsnivået av MIR-21 ble korrelert med 5 års overlevelse og fasen av pasientene. For å bestemme rollen til mir-21 i nyrecellekarsinom (RCC) funksjonelle analyser slik som cellesyklus, apoptose, invasjon, og migrasjon, ble utført etter banket ned MIR-21 ekspresjon i A-498-celler. Software analyse og PCR rekke analyse viste en økning i ekspresjonen av p21 og p38 MAP-kinaser etter inhibering av MIR-21 og redusert ekspresjon av cykliner og cyklinavhengige kinaser. Disse resultatene ble bekreftet ved Western-analyse. Videre vurderte vi også effekten av et kosttilskudd chemoprevention middel, genistein (et produkt soya), på ekspresjon av MIR-21 i mus-svulster. Genistein redusert ekspresjon av MIR-21 i mus injisert med genistein behandlede celler sammenlignet med bærerkontroller. Dette er den første studien som viser korrelasjonen av MIR-21 uttrykk med kliniske parametre og den er funksjonell rolle i RCC. I konklusjonen, oppregulert MIR-21 i nyrekreft kan være en god svulst markør for nyrekreftdiagnose.
Resultater
MIR-21 er opp regulert hos nyrekreft vevsprøver og nyrekreft cellelinjer
for å forstå den kliniske relevansen av MIR-21 i nyrekreft vi målt MIR-21 nivåer i 54 par av nyrekreft og deres matchet normalt vev ved real-time PCR. I 48 tilfeller (89%), ble MIR-21 funnet å være økt (T /N [Tumor /Normal] var større enn 1,2). Uttrykk av MIR-21 ble også målt hos nyrekreft cellelinjer, A-498, Caki-1, Caki-2 og normal HK-2 celler. MIR-21 uttrykk i A-498 celler var omtrent 7,3 × at HK-2 celler mens det av Caki-en var 1,6 ×, og Caki-2, 3 ×.
korrelasjon mellom MIR-21 uttrykk med scenen og overlevelse hos nyrekreft
uttrykket nivået av MIR-21 korrelert med fem års overlevelse og stadium av pasientene. For pasienter med lav MIR-21 uttrykk (figur S1), alle overlevde 5 år etter operasjonen, mens for de med høy MIR-21 uttrykk (figur S2), bare 50% overlevde (figur 1). Overlevelseskurven var basert på antall pasienter (36) som vi hadde overlevelse informasjon ut av i alt 54 pasienter. I grupper av pasienter som har lav MIR-21 uttrykket (T /N 1,2), høy ekspresjon (T /N = 1,2 til 10), og meget høy ekspresjon (T /N 10), den prosent av de i tidlig stadium (Trinn I) ble redusert med 80%, 51,5% og 37,5%, respektivt. Dette innebærer at økt ekspresjon av MIR-21 korrelerer med en øket stadium av nyrekreft. Denne informasjonen er basert på antall pasienter som vi hadde på scenen informasjon (46 av 54 pasienter). Det ble ikke observert noen korrelasjon mellom svulst klasse og miRNA-21 nivåer.
Uttrykk av MIR-21 i ulike former for nyrecellekreft
uttrykk for MIR-21 ble gradert som enten lav (T /N 1,2), høy (T /N = 1,2-10) og meget høy (T /N 10). De forskjellige former for kreft, hvor ekspresjonen av MIR-21 ble analysert var klar karsinom, papillær karsinom og rørformet karsinom. Av totalt 54 prøver, 45 prøver var klare cellekreft, åtte var papillær og en var rørformet karsinom. I begge klar celle (71,1%) og papillær karsinom (75%) majoriteten av prøver hadde høy ekspresjon av MIR-21 (T /N = 1,2-10). 17,7% av klarcellet karsinom hadde svært høy uttrykk. Singelen rørformet nyrecellekarsinom prøven hadde svært høy MIR-21 uttrykk.
Funksjonell rolle MIR-21 i A-498 celler
For å belyse den funksjonelle rollen MIR-21 i nyrekreft vi hemmet ekspresjon av MIR-21 i A-498 nyrecancerceller med et kommersielt tilgjengelig MIR-21-inhibitor. Anti-MIR-Negativ kontroll # 1 ble anvendt som standard negativ kontroll for disse eksperimentene. MIR-21 nivået ble redusert med mer enn 99%, sammenlignet med den negative kontroll (figur S3). I tilfellet med anti-MIR-21 transfeksjon inn i Caki-2-celler på samme grad av reduksjon av MIR-21-ekspresjon ble observert (figur S4).
Effekt på A-498 cellesyklus og apoptose.
virkningene av MIR-21 inhibering av cellesyklus og apoptose ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Cellecyklusen viste en signifikant økning (9,1%) i G0 /G1 fase, med en samtidig reduksjon (6,8%) i G2 /M-fasen, noe som indikerer at reduksjon av MIR-21 ekspresjon i A-498-celler inhiberte celle vekst og forårsaket G0 /G1 arrest (figur 2a). Apoptose analyse ved bruk av strømningscytometri viste en marginal økning i det totale antallet apoptotiske celler (tidlig apoptotiske pluss apoptotiske) (5,17%) i MIR-21 anti-miRNA inhibitor transfekterte celler sammenlignet med den negative kontroll (1,79%) og mock ( 2,49%) (figur 2b). I tilfelle av Caki-2-celler inhibering av MIR-21 resulterte i en signifikant økning i apoptose uten noen forandring i cellesyklus (data ikke vist)
(a) Virkning på cellesyklusen. Strømningscytometri-analyse av cellesyklusen viste en signifikant økning i G0 /G1 fase (9,1%), med en ledsagende reduksjon i G2 /M fasen (6,8%), noe som indikerer at de tvangs reduksjon av MIR-21 ekspresjon i A-498-celler kan inhibere celle vekst og årsaken G0 /G1 arrest (p-verdi 0,010). (B) Effekt på apoptose: Apoptose-analyse viste en marginal økning i det totale antallet apoptotiske celler (5,17%) i MIR-21 anti-miRNA inhibitor transfekterte celler sammenlignet med den negative kontroll (1,79%) og mock (2,49% ) (p-verdi 0,017).
Effekt på celle invasjon og migrasjons egenskaper.
For å finne ut om Mir-21 påvirker nyrekreft celle migrasjon og invasjon et cytoselect 24-brønn celle migrasjon og invasjon kit ble anvendt. A-498-celler ble transfektert med anti-MIR-21-inhibitor og anti-MIR-Negativ kontroll. Både A-498 celle invasjon og migrering ble redusert sammenlignet med negativ kontroll. Mindre absorbans ble observert ved 560 nm med anti-MIR-21 transfekterte celler enn den negative kontroll i både invasjonen og migrasjons analysene (Figurene 3a og 3b). Inhibering av MIR-21 ekspresjon hadde en mer uttalt effekt på invasjon i forhold til migrasjon, (reduksjon på 50% mot 25%). Lignende effekter ble observert i tilfellet av Caki-2-celler i både invasjon og migrasjons assays (data ikke vist)
(a) Virkning på celle invasjon. Invasive egenskaper av A-498-celler ble redusert etter inhibering av MIR-21 i forhold til den negative kontrollen, Farget A-498 celler (Forstørrelse-40 ×); Absorbans ved 560 nm (p-verdi 0,026). (B) Virkning på cellemigrering: trekkende egenskaper av A-498-celler ble også redusert etter inhibering av MIR-21 sammenlignet med den negative kontroll, Farget A-498-celler (forstørrelse-40 x); Absorbans ved 560 nm (p-verdi 0,016).
MIR-21 øker uttrykk for cyclin avhengig kinase inhibitor CDKN1A (p21).
For å se effekten av MIR-21 uttrykk på forskjellige gener som er involvert i cellesyklusen og apoptose vi brukte PCR-matriser. Siden vi så en betydelig effekt på cellesyklus ved å hemme MIR-21 i A-498 celler, vi først bestemte oss for å bruke PCR arrays knyttet til cellesyklus gener. Cellecyklus basert PCR-arrays viste forandringer i ekspresjon av et antall gener. Ett av genene opp regulert i PCR matrise etter hemming av MIR-21 var den cyclin avhengig kinase inhibitor, CDKN1A også kjent som Cip1 eller p21. Andre PCR-arrays viste en endring i ekspresjonen av genet p38 MAP-kinase. Deretter vi bekreftet dette resultatet ved hjelp av MAP kinase basert PCR arrays og fått samme resultat (data ikke vist). Begge resultatene ble validert ved Western blotting (figur 4). Western blotting eksperimenter viser tydelig oppregulering av både p21 og p38 MAP kinase-gener med MIR-21-hemming sammenlignet med den negative kontroll. Vi har også kontrollert ekspresjon av andre gener relatert til cellesyklus og apoptose og funnet nedregulering av cyclin E2. Vi så også på mRNA uttrykk for cyclin avhengige kinaser, CDK2, CDK4, CDKE1 og CDKE2 og funnet sitt uttrykk for å bli betydelig redusert etter hemming av MIR-21 (data ikke vist). I Western blot eksperimenter sjekket CDK4, E1 og E2 som CDK2 er allerede kjent for å bli påvirket av p21-genet [13], [14]. Vi har observert en forandring i protein ekspresjon for bare CDKE2.
Ekspresjon av p21, p38MAP kinase og cyklin E2 etter at inhibering av MIR-21 i A-498-celler, sammenlignet med negativ kontroll. GAPDH ble anvendt som en normaliseringskontroll. p21 og p38 MAP kinase ble opp regulert, mens cyclin E2 uttrykk ble funnet å være nedregulert.
In vitro
og
In vivo
effekter av genistein på nyrekreftceller
Genistein reduserer ekspresjon av MIR-21 i musetumorer.
Som nevnt tidligere sjekket vi effekten av en chemoprevention middel, genistein (et produkt soya), på ekspresjon av MIR-21 i naken mus svulster. For det første A-498 nyrecancerceller ble behandlet med 25 uM genistein i 4 dager og etter at RNA ekstraksjon MIR-21-ekspresjon ble kontrollert. Uttrykket ble observert å være redusert med 30% i genistein behandlede celler sammenlignet med ubehandlede de (figur 5a). For å se effekten av genistein behandling på mus svulster og MIR-21 expression A-498 celler ble igjen behandlet med genistein (25 mm) og etter 96 timers behandling ble injisert subkutant i nakne mus. To sett med tre mus hver ble anvendt. I DMSO kontrolltumorer de tre musene utviklet seg betydelig stor størrelse tumorer, ca 800 mm
3 i volum (figur 5b, venstre panel), mens med de genistein behandlede celler med liten størrelse tumoren ble observert i en av tre mus ca 25 mm
3 i volum (figur 5b panel rett,). I de to andre musene en av dem hadde en meget liten tumor på injeksjonsstedet (figur 5b høyre panel), mens den tredje mus hadde ingen svulst. Etter dannelsen av palpable tumorer med kontrollceller, spaltet vi tumorene og målte ekspresjon av MIR-21 etter at tumoren homogenisering med Qiazol og RNA-ekstraksjon. Ekspresjonen av MIR-21 ble funnet å bli redusert med ~40% i genistein behandlede prøvene sammenlignet med ubehandlede de (data ikke vist).
(a) Virkning av genistein (25 uM) på ekspresjon av MIR-21 i A-498-celler: Mir-21 ekspresjon ble funnet å bli redusert med ~ 30% i behandlet genistein A-498 celler sammenlignet med ubehandlede celler. (B)
In vivo
effekten av genistein på tumorstørrelse i naken mus. Genistein var i stand til å redusere svulstdannelse signifikant (svarte piler, høyre panel)
Diskusjoner
i denne studien gir vi bevis for at opp regulering av MIR-21 i nyrecellekreft er relatert til lavere overlevelse av nyrekreftpasienter. Ekspresjonen av MIR-21 i begge nyrecancercellelinjer og vevsprøver humane nyrecancer ble funnet å være høyere i forhold til det normale, noe som er i overensstemmelse med tidligere studier på nyrecellekreft og også andre typer av kreft [15]. Vår studie viser for første gang at pasienter med et høyere uttrykk av MIR-21 i nyrekreft har en lavere sannsynlighet for å overleve. Også lavere uttrykk for MIR-21 fører til en høyere overlevelse. Vi har også korrelert uttrykk for MIR-21 med stadium av kreft for de pasientene som vi hadde fullstendig informasjon om scenen (34/39). Analysen viste at meget høy ekspresjon av MIR-21 i pasientprøver førte til en økning i stadium av sykdommen. For å belyse betydningen av MIR-21 i nyrecellekarsinom funksjonelle analyser ble utført. Celleviabilitet analyser viste en anti-proliferativ effekt på A-498 celler etter hemming av MIR-21. Den viktigste endringen ble observert i cellesyklusen hvor den G0 /G1 fasen ble økt dramatisk (9,1%) med en samtidig reduksjon i G2 /M fasen (6,8%). Dette førte oss til å søke etter potensielle cellesyklus gener påvirkes av hemming av MIR-21 i A-498 celler. Cellesyklus PCR array-eksperimenter viste at cDKN1A (p21) ble opp regulert etter hemming av MIR-21 i A-498 celler. Tidligere studier med mikromatriser tyder på at p21 uttrykk positivt korrelerer med undertrykkelse av gener som er viktige for cellesyklusprogresjon [16]. p21 reagerer på en rekke stimuli som fremmer vekst-hemmende aktiviteter, avhengig av dets evne til å inhibere aktiviteten av cyklin-avhengig kinase, CDK2. Tallrike studier har rapportert at p21-genet har flere roller i cellesyklusregulering som er uavhengig av CDK2. Noen eksempler er dens assosiasjon med transkripsjonsfaktor E2F1 og undertrykkelse av dens transkripsjonelle aktivitet [17]. Videre p21 også undertrykker transkripsjon faktorer STAT3 [18] og MYC [19]. I tillegg p21 også fremmer cellesyklusen hemming gjennom formidling av p53-avhengig undertrykkelse av gener som CDC25C, CDC2, CCNB1 og BIRC5 også kjent som survivin [20], [21], [22]. Selv om p21 undertrykker gener som er involvert i cellesyklusprogresjon det inhiberer også apoptose [23]. Når cellene møte gentoksiske fornærmelser eller mikrotubulidynamikk-destabiliserende midler, beskytter p21 dem fra apoptose som en aktiv cellesyklus er nødvendig for å oppfatte disse agentene og utløse apoptose. Dette kan forklare den ikke så dramatiske økningen i antallet celler som gjennomgår apoptose etter inhibering av MIR-21 i A-498-celler sammenlignet med endringer i cellesyklusprogresjon Figur 2b. Imidlertid er virkningen av p21 motvirkes ved flere mekanismer som innbefatter svitsje fra cellesyklus-stans til apoptose ved selektiv transcriptional undertrykkelse av p21, den selektive aktivering av pro-apoptotiske gener eller defekter i p21 ekspresjon nedstrøms av p53 [24], [25 ], [26]. I visse tilfeller p21 også fremmer apoptose gjennom begge p53-avhengige og uavhengige mekanismer i henhold til cellulært stress, men virkningsmekanismen er fortsatt ukjent [27]. Dermed prøvde vi å se om p21 var et direkte mål på MIR-21 med 3 «luciferase assay, men vi kunne ikke finne en direkte interaksjon. Dermed har vi sjekket protein uttrykk for noe annet cyclin avhengige kinaser CDK4, E1 og E2 og kunne finne en forskjell i bare cyclinE2 (figur 4).
Genistein, en av de viktigste soya isoflavoner, har et bredt utvalg av chemopreventive handlinger. De kreft effekter av genistein har blitt tilskrevet flere signalveier og mekanismer som påvirker cellesyklus arrest, apoptose, invasjon, metastase og angiogenese, attributter som potensielt kan hindre svulsten initiering og progresjon [28], [29]. Genistein (40,5,7- Trihydroxyflavone) er rik på soyaprodukter og har blitt identifisert som hemmer av protein tyrosin kinaser og dermed kan spille en nøkkelrolle i cellevekst og apoptose [30], [31]. Det har blitt rapportert å ha østrogen egenskaper og anti-neoplastisk aktivitet i flere tumortyper [32]. Det har også blitt funnet å ha epigenetiske virkninger i mus prostata [33]. I en tidligere studie Hillman
et. al.
har vist at kombinasjonen av genistein med primære svulst bestrålings fungerer mer effektivt som en terapeutisk tilnærming, i etablerte nyre svulster, på grunn av tumorvekst blir hemmet i både primær- og metastaser. I deres studie genistein alene viste en tendens til å stimulere veksten av primære nyretumor og øke metastase [34]. I vår studie tar vi en enklere tilnærming og har vist at A-498 celler behandlet med genistein bare dannet redusert svulster i forhold til kjøretøykontroller.
mirnas regulere genuttrykket ved å målrette gener som inneholder utfyllende mRNA sekvenser [35]. Mange mobilnettet veier er påvirket av regulerende funksjon av miRNAs og den mest fremtredende av disse banene styre utviklings- og onkogene prosesser [36]. MIR-21 var en av de første mirnas detektert i det humane genom [37] og har blitt funnet å være overuttrykt i en rekke forskjellige krefttyper [38]. Det finnes noen studier som dokumenterer den funksjonelle relevansen av MIR-21 ved å vise årsak og virkning forholdet mellom MIR-21 og neoplastisk transformasjon. Disse studiene har vært gjort på glioblastom [39], brystkreft [40], leverkreft [41], tykktarmskreft [42] og i myelomaceller [43]. En fersk rapport om rollen til MIR-21 i nyrekreft, viser at det modulerer apoptose gjennom målretting flere gener av Zhang
et.al product: [44]. Men til dags dato er det ingen data som gjelder klinisk korrelasjon av MIR-21 uttrykk med scenen og overlevelse av nyrekreftpasienter. Videre viser vi chemo forebyggende rolle genistein i å hemme tumordannelse
in vivo
ved å redusere MIR-21 uttrykk i mus svulster. Som konklusjon er dette den første rapporten til å korrelere MIR-21 nivåer med overlevelse og stadium av nyrekreftpasienter og dokumenterer onkogene rollen MIR-21 gjennom ulike cellulære trasé.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Formalin fiksert, ble parafininnstøpte (FFPE) nyrekreftprøver hentet fra San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av UCSF komité for menneskeforskning (Godkjenningsnummer: H9058-35751-01). Alle dyr omsorg var i samsvar med retningslinjene i San Francisco Veterans Affairs Medical Center og studien ble godkjent av San Francisco VA IACUC (Protocol Nummer: 08-003-01).
Cellelinjer og cellekultur
humane renale kreftcellelinjer A-498, Caki-1, Caki-2, og normal nyrecellelinje HK-2 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellelinjene ble kontrollert ved ATCC gjennom DNA (STR) profilering. Normale nyre HK-2-celler ble dyrket som et monolag i keratinocytt Serum Free Medium (K-SFM) supplementert med 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (BPE), 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF) (Life Technologies /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA), 50 mg /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Den nyrekreft cellelinje A-498 var dyrket som et monolag i Eagles Minimum Essential Medium, (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Caki-en og Caki-2 ble dyrket på samme måte i McCoy’s5A media (UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA, USA). Alle cellelinjer ble holdt i en inkubator med en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO2 ved 37 ° C. Subkonfluente A-498cells (60-70% konfluent) ble behandlet med Genistein (25 mm). Genistein (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) ble oppløst i DMSO, og celler behandlet bare med bærer (DMSO) tjente som kontroll. Frisk genistein ble administrert hver dag sammen med en endring av medium, og cellene inkubert i 4 dager.
kvantitativ real-time PCR
Første cDNA ble fremstilt fra total RNA (1 mikrogram) ved hjelp av en omvendt transkripsjon system (Promega, Madison, WI, USA). Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av en RNeasy mini kit fra Qiagen (Valencia, CA, USA). For real-time polymerase chain reaction (PCR), ble komplementær DNA forsterket med inventoried Gene Analyse Produkter som inneholder to gen-spesifikke primere og en TaqMan MGB probe (6-FAM dye-merket) med en TaqMan Universal Fast PCR Master Mix i en 7500 Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Termisk sykling tilstander inkludert 95 ° C i 20 sekunder (s), 40 sykluser av 95 ° C i 3 sekunder og 60 ° C i 30 sek i henhold til TaqMan Fast Universal PCR protokoll. GAPDH ble anvendt som en endogen kontroll. For miRNA sanntid eksperimenter cDNA tråd ble syntetisert ved bruk av Applied Biosystems Taqman mikroRNA Reverse Transcription Kit, med 200 ng av totalt hentet miRNA. RNU48 ble anvendt som en endogen kontroll. For real-time PCR eksperimenter, hvor mirnas ble isolert fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) nyreprøver, ble let7-f brukes som en endogen kontroll. Total miRNA ble hentet fra FFPE-prøver ved hjelp av en miRNA FFPE kit fra Qiagen.
PCR arrays gjennom real-time PCR
For å studere uttrykket profilen av gener som er involvert i ulike cellulære pathways, sti-spesifikke PCR arrays (cellesyklus array, apoptose matrise, MAP kinase matrise, SABioscience) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Data ble analysert med produsentens programvare.
Micro disseksjon av nyrekreft vev og RNA ekstraksjon fra FFPE menneskelige nyrekreftprøver
Tilstøtende normale og kreftnyrevevet, ble hentet fra 39 representative FFPE vevsblokker av radikale nephrectomy prøvene fra patologi Department of Veterans Affairs (VA) Medical Center of San Francisco. Blokkene var fra nyre kreftpasienter som ble operert på ved VA Medical Center mellom 1980-2009. Seksjoner (4 mikrometer) av blokkene ble utarbeidet, H E farget, og lysbilder ble gjennomgått av et styre sertifisert patolog for å markere de normale og kreftområder. Deretter ble 12 um glass laget av blokkene og mikrodisseksjon ble utført ved anvendelse av merket H 50 mmol l-1 Tris (pH 8,0), 150 mmol l-1 NaCl, 0,5% deoksykolat, 0,1% SDS og 1,0% NP-40) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Switzerland). Proteinanalyser ble utført ved bruk av en BCA proteinanalysesett (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Totalt protein (40 ug) ble elektroforisert i 12% SDS-PAGE-geler og Western blotting ble utført ved anvendelse av standard protokoller og detektert ved kjemiluminescens. Alle antistoffer, som omfattet p21 (kat. Nr. 2552), p38 MAPkinase (kat. Nr. 9212) og cyclinE2 (kat. Nr. 4132) ble anskaffet fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA), mens GAPDH (kat. no. sc-32233) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California).
Genistein behandling av A-498 celler og subkutan injeksjon i nakne mus
Som nevnt ovenfor, A -498-celler ble behandlet med 25 uM genistein i 96 timer. DMSO (kjøretøy) behandlede celler tjente som kontroll. Etter 96 timer ble cellene pelletert og ~ 2 millioner celler ble injisert subkutant (100 ul) i den høyre flanken til nakne mus (4 til 5 uker gamle; Charles River Laboratories). To sett med mus, med tre mus hver, ble anvendt for dette forsøk. Ett sett representerte bilen (DMSO) kontroller og andre genistein behandlede celler. Svulster fra kontroll og genistein behandlede celler ble skåret ut etter 8 uker når DMSO-behandlede kontrollmusene utviklet tumorer omtrent 800 mm
3 i volum (lengde og 16 mm, bredde-10 mm). Total RNA ble ekstrahert ved homogenisering av tumorer hos Qiazol og ekstrahere RNA ved bruk av produsentens protokoll (Qiagen). Uttrykk av MIR-21 ble målt med real-time PCR.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med Statview versjon 5.0 for Windows. T-test ble brukt til å sammenligne de ulike gruppene. p-verdier på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
MIR-21 nivåer hos pasienter med lav uttrykk ( 1,2): Lave nivåer av MIR-21 hos pasienter med 100% overlevelse
doi: 10,1371 /journal.pone.0031060.s001
(TIF. )
Figur S2.
MIR-21 nivåer hos pasienter med høyt uttrykk ( 1.2): Høye nivåer av MIR-21 pasienter med 50% overlevelse
doi: 10,1371 /journal.pone.0031060.s002 plakater (TIF. )
Figur S3.
Expression nivåer av MIR-21 etter knockdown i A-498 celler: Mir-21 nivået ble redusert med mer enn 99% (1,0 til 0,030), sammenlignet med den negative kontrollen
doi:. 10,1371 /journal .pone.0031060.s003 product: (TIF)
Figur S4.
Expression nivåer av MIR-21 etter knockdown i Caki-2 celler: Mir-21 nivået ble redusert med mer enn 99% (1,0 til 0,011), sammenlignet med den negative kontrollen
doi:. 10,1371 /journal .pone.0031060.s004 product: (TIF)
takk
Vi takker Dr Roger Erickson for støtte og hjelp med utarbeidelse av artikkelen.
