Abstract
Icaritin, et sammensatt fra
Epimedium Genus
, har selektiv østrogen reseptor (ER) moduler aktiviteter, og besitter anti-tumor aktivitet. Her undersøkte vi icaritin effekt på cellevekst av menneskelige endometrial kreft Hec1A celler og funnet ut at icaritin potente hemmet spredning av Hec1A celler. Icaritin-hemmet cellevekst var assosiert med økte nivåer av p21 og p27 uttrykk og redusert cyclinD1 og CDK fire uttrykk. Icaritin også indusert celle apoptose fulgt av aktivering av kaspaser som vist ved spalting av endogent substrat Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og cytokrom c frigivelse, som ble opphevet ved forbehandling med pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK. Icaritin behandling også indusert uttrykk for pro-apoptotiske proteiner Bax med en samtidig reduksjon av BCL-2 uttrykk. Videre icaritin indusert vedvarende fosforylering av ekstracellulære signalregulerte kinase1 /2 (MAPK /ERK1 /2) i Hec1A celler og U0126, en spesifikk MAP-kinase kinase (MEK1 /2) inhibitor, blokkerte ERK1 /2-aktivering av icaritin og avskaffet den icaritin-indusert veksthemming og apoptose. Våre resultater viser at icaritin indusert vedvarende ERK 1/2 aktivering og hemmet vekst av livmorkreft Hec1A celler, og gitt en rasjonell for preklinisk og klinisk evaluering av icaritin for livmorkreft terapi
Citation. Tong JS, Zhang QH Huang X, Fu XQ, Qi ST, Wang YP, et al. (2011) Icaritin Årsaker Vedvarende ERK1 /2 Aktivering og induserer apoptose i Human Livmorkreftceller. PLoS ONE 6 (3): e16781. doi: 10,1371 /journal.pone.0016781
Redaktør: Syed Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 08.12.2010; Godkjent: 14 januar 2011; Publisert: 08.03.2011
Copyright: © 2011 Tong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den store stats Basic Research Program i Kina for å QY Sun (2011CB94451). Dette arbeidet ble også støttet av NIH bevilgning DK070016 til Z.Y. Wang og Nebraska Tobakk Settlement Biomedical Research Program Awards (LB-595 og LB692) til Z.Y. Wang. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorkreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste kvinnelige bekken malignitet, og er den fjerde vanligste typen kreft i nordamerikanske kvinner bak lunge, bryst og tykktarm kreft, med 42,160 nye tilfeller og 7,780 dødsfall anslått for 2009 [ ,,,0],1], [2], [3]. Om 81 500 kvinner blir rammet hvert år i EU og forekomsten er økende. Median alder for forekomst er 63 år, mens 90% av kvinnene er eldre enn 50 [4]. Selv om pasienter diagnostisert med og behandlet for tidlig stadium-sykdom i endometrioid histologi nyte relativt god overlevelse priser, pasienter med avansert (stadium III eller IV, i henhold til den nylig reviderte system av International Federation of gynekologi og fødselshjelp [FIGO]) eller tilbakevendende livmorkreft har en dårlig prognose [5]. For de kvinner med tidlig stadium sykdom, kirurgi med individualisert bruk av volum rettet strålebehandling er kurativ [6]. For de kvinner med avansert stadium sykdommen, er det ingen reell standard for omsorg og tradisjonelt disse kvinnene blir behandlet med kirurgi, cellegift og stråling, i en eller flere kombinasjoner. I innstillingen av avansert eller tilbakevendende sykdom, spesielt når det ikke er mottagelig for kirurgisk reseksjon, har kjennetegnet av terapien vært kjemoterapi [7]. Selv om mange pasienter i utgangspunktet svare på kjemoterapi, motstand og tumor tilbakefall etter hvert utvikle [5]. Dermed er det haster med å utvikle nye terapeutiske midler for å effektivt behandle denne dødelige sykdommen.
Icaritin (Fig. 1A) er et hydrolytisk produkt av icariin fra
Epimedium
, en tradisjonell kinesisk urtemedisin. Icaritin oppviser mange farmakologiske og biologiske aktiviteter, for eksempel stimulering av neuronal og hjerte differensiering [8], [9], forbedring av osteoblastisk og undertrykket osteoklastisk differensiering og aktivitet [10], forhindring av steroid-forbindelse osteonekrose [11], hemningen av human prostatakarsinom PC-3 cellevekst [12], induksjon av human prostata glattmuskelceller apoptose via ERK1 /2 pathway [13], og nevrobeskyttende effekter [14]. Tidligere ble det rapportert at icaritin oppviser østrogenlignende aktivitet i østrogen-reseptor-positive brystkreft MCF-7-celler ved sub-mikromolare konsentrasjoner [15]. Ved mikromolområde imidlertid icaritin hemmet veksten av prostata cancer PC-3-celler [12]. Disse resultatene indikerte at icaritin har både agonist- og antagonist-aktiviteter avhengig av konsentrasjon og kan virke som en østrogenreseptor modulator for å regulere cellevekst. Men det er ingen rapporter om aktiviteten icaritin mot livmorkreft.
(A) Den kjemiske strukturen til icaritin. (B) Effekten av icaritin på vekstinhibering i Hec1A celler. Celler ble opprettholdt i fenolrødt-fritt media med 2,5% trekull-strippet føtalt serum i 24 timer, og deretter behandlet med den angitte konsentrasjon av icaritin. Cellene ble høstet ved forskjellige tidspunkter som den indikerte og proliferasjon potensial ble bestemt ved MTT-analyse. Resultater av åtte uavhengige eksperimenter ble gjennomsnitt og gjennomsnitt ± SEM. *,
P
. 0,05 sammenlignet med kontrollceller
Mitogen-aktivert protein (MAP) kinaser delta i ulike cellulære funksjoner som celleproliferasjon, celledifferensiering, cellemotilitet, og celledød [16]. Det er tre hoved MAPK familie undergrupper: ekstracellulære signalregulerte kinase1 /2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal stress-aktiverte protein kinases1 /2 (JNK1 /2) og p38 proteinkinaser. Signaleringskaskader som involverer JNK og p38, aktivert av ekstracellulære spenningssignaler, er involvert i celle-differensiering og apoptose [17], [18]. Tidligere studier har vist at forbigående aktivering av ERK1 /2 spiller en sentral rolle i celleproliferasjon og som vedvarende ERK1 /2-aktivering induserer cellesyklus-stans og differensiering [19], [20]. I denne studien har vi demonstrert her at aktivering av ERK1 /2 signalveien formidler icaritin-indusert apoptose av Hec1A celler.
I denne studien fant vi at icaritin utløste en mitokondrie-mediert Hec1A celler apoptose og vedvarende aktivering av MAPK /ERK1 /2 pathway. Våre resultater antydet at icaritin kan være nyttig som et anticancermiddel i livmorkreft terapi.
Resultater
Icaritin hemmer vekst av livmorkreft Hec1A celler
Tidligere ble det rapportert icaritin potent hemmet veksten av prostata kreft PC-3-celler, bryst-kreftceller og hepatoma HepG2 celler [12], [15], [21]. Vi bestemte oss for å undersøke effekten av icaritin på vekst av endometrial Hec1A celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av icaritin i 12 timer, 24 timer og 48 timer, og celleveksten ble målt ved MTT-analyse. Vi fant at det var en doseavhengig og tidsavhengig reduksjon av veksten av Hec1A celler behandlet med icaritin (Fig. 1B), som indikerer at icaritin inhiberer proliferasjon av celler Hec1A.
For å undersøke mekanismen bak icaritin indusert cellesyklus arrest, ble store G1 fase regulatorer, for eksempel cyclin D1 /CDK4 og cyclin-avhengig kinase hemmere WAF1 /p21 og KIP1 /p27 undersøkt. Som vist på fig. 2A, icaritin behandling resulterte i en markert nedgang av uttrykket nivåer av cyklin D1 og cdk4 og økning av WAF1 /p21 og KIP1 /p27 ekspresjon sammenlignet med celler behandlet med vehikkel (Fig. 2B). Disse data indikerte at icaritin var i stand til å indusere cellesyklus-stans og for å regulere syklusrelaterte effektorer.
(A) Hec1A-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av icaritin i 24 timer. Nivåene av cyclin D1 og cdk4 ble bestemt ved western blot. Proteinnivåer av β-actin ble også målt som kontroller. (B) Hec1A-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av icaritin i 24 timer. Nivåene av p21 og p27 ble bestemt ved western blot. Protein nivåer av β-actin ble også målt som kontroller.
Icaritin induserer Hec1A celler apoptose
neste test om icaritin også induserer apoptotisk celledød i menneskelige livmorkreft Hec1A celler. Hec1A celler ble behandlet med icaritin og apoptose ble bestemt ved to forskjellige metoder. Som vist på fig. 3A, antallet TUNEL-positive celler økes med økt konsentrasjon av icaritin. Nucleosome fragmentering, en indikator på apoptose, bestemt med celledød Detection ELISA bekreftet videre at icaritin indusert celle apoptose ved en dose- og tidsavhengig måte (fig. 3B). I tillegg er en annexin V-flekker viste også at icaritin indusert apoptotisk celledød, men ikke nekrose i Hec1A celler (Fig. 3C).
(A) Visualisering av apoptotiske celler ved TUNEL assay på Hec1A celler. (B) DNA-fragmentering ble evaluert ved hjelp av en mobiltelefon Død Detection ELISA kit. Dataene er uttrykt som middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter. *,
P
0,05 sammenlignet med kontrollceller. (C) Den apoptotiske status ble bestemt ved Annexin V /PI fargemetoden. Prosenter av negativ (levedyktige) celler, Annexin V-positive (tidlig apoptotiske) celler, PI-positive (nekrotiske celler), eller annexin V og PI dobbel-positive (slutten av apoptotiske celler) ble vist (middel av tre uavhengige eksperimenter) ved en flowcytometri analyse.
dose- og tidsavhengige effekter av icaritin på proteolytisk aktivering av caspase-3 og caspase-9 ble også undersøkt. Som vist på fig. 4A, icaritin behandling resulterte i en betydelig økning i den aktive formen av kaspase-3 og kaspase-9 i Hec1A celler. Aktivering av kaspaser i icaritin behandlede Hec1A-celler ble ytterligere bekreftet ved å påvise spalting av PARP, et endogent substrat av aktivert kaspase-3 og et kjennetegn på apoptose. Som vist på fig. 4B, behandling av Hec1A celler med icaritin resulterte i spaltning av PARP til en 85 kDa-fragment. I tillegg, undersøkte vi den subcellulære lokalisering av cytokrom c for å bestemme hvorvidt mitokondriene reaksjonsveien er involvert i icaritin-indusert apoptose. Immunfluorescens av cytokrom c ble visualisert med en confocal lasermikroskop. Etter at cellene ble behandlet med 10 uM icaritin i 24 timer, det fargemønsteret av cytokrom c ble diffust og uklart (fig. 4C) i motsetning til kompakte, plaque-lignende utseende av cytokrom c i kontrollcellene som ble behandlet med bærer, noe som indikerer frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene inn i cytosol i icaritin-behandlede celler.
(A) Hec1A-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon icaritin eller de angitte tidspunkter, totale cellulære ekstrakter ble fremstilt og underkastet Western blot analyse for å måle nivåer av spaltede-kaspase-3 og spaltet-caspase-9. Proteinnivåer av β-actin ble også målt som kontroller. (B) Hec1A-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon icaritin eller de angitte tidspunkter ble det totale cellulære ekstrakter fremstilt og utsatt for Western blot-analyse ved bruk av antistoffer mot PARP. Proteinnivåer av β-actin ble også målt som kontroller. (C) Hec1A celler ble fiksert og merket for cytokrom c (rød) og DNA (blå). (D) Hec1A-celler ble forbehandlet med 10 pM Z-VAD-FMK i 1 time, etterfulgt med 10 uM icaritin i 24 timer, og DNA-fragmentering og caspase-3 aktivitet ble bestemt. Dataene er uttrykt som middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter. *,
P
0,05 sammenlignet med kontrollceller. (E) Hec1A-celler ble forbehandlet med 10 pM Z-VAD-FMK i 1 time, etterfulgt med 10 uM icaritin i 24 timer. Proteinekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse ved bruk av antistoff mot PARP. Protein nivåer av β-actin ble også målt som kontroller.
For å finne ut hvilken rolle caspaseaktivering i icaritin-indusert apoptose videre, vi behandlet Hec1A celler med pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK (10 mm) før icaritin behandling. Pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK forbehandling opphevet caspase-3 aktivitet og redusert icaritin-indusert apoptose målt ved nucleosome fragmentering i Hec1A-celler (figur 4 D . E). Disse resultatene tyder sterkt på at aktivering av caspase kaskade var avgjørende for icaritin-indusert apoptose i Hec1A celler.
Icaritin regulerer uttrykket av Bcl-2 familien proteiner i Hec1A celler
Den anti-apoptotiske Bcl-2 er en potent antagonist av mitokondriell vei av apoptose initiert av en rekke ekstra- og intracellulære påkjenninger. Vi bestemte oss for å teste effekten av icaritin for ekspresjon av anti-apoptotiske protein Bcl-2 og de pro-apoptotiske proteiner Bax i Hec1A celler med Western blot-analyse. Som vist på fig. 5, icaritin økning i nivåene av ekspresjon Bax mens redusert Bcl-2-ekspresjon i en dose- og tidsavhengig måte, noe som indikerer at icaritin regulerer også ekspresjonsnivåer av Bcl-2-familieproteiner for å lette apoptotisk celledød indusert av icaritin.
(A) Hec1A-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av icaritin, totale cellulære ekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å måle nivåer av BCL-2 og Bax. Proteinnivåer av β-actin ble også målt som kontroller. (B) Hec1A celler ble behandlet med de angitte icaritin tidspunkter av icaritin, ble de totale cellulære ekstrakter fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å måle nivåer av BCL-2 og Bax. Protein nivåer av β-actin ble også målt som kontroller.
Icaritin induserer vedvarende ERK1 /2 aktivering i Hec1A celler
Cellular spenninger og stimuli indusere celle apoptose via vedvarende aktivering av MAPK signalveier [22], [23]. Vi undersøkte derfor aktiveringen av MAPK ERK1 /2, JNK og p38 etter icaritin behandling. Som vist på fig. 6A, ble fosforylering nivåene av ERK1 /2 økt etter icaritin behandling, som varer tjuefire timer. Imidlertid ble det ikke observert noen signifikante endringer i uttrykk og fosforylering nivåer av p38 og JNK etter icaritin behandling (fig 6B . C). Disse resultatene antydet at vedvarende aktivering av MAPK /ERK er involvert i icaritin-indusert veksthemming og apoptose i celler HecA1.
Hec1A-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon eller icaritin den angitte intervall, totale cellulære ekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å måle nivåer av fosforylerte former av ERK1 /2 (A), JNK (B) og p38 (C). Membraner ble reprobed med antistoffer mot total ERK1 /2, JNK og p38 for normalisering.
Den ERK1 /2 signalveien er involvert i icaritin-indusert apoptose i Hec1A
enn undersøkt hvorvidt den icaritin-indusert vedvarende aktivering av ERK1 /2-signalveien spiller en rolle i veksthemming og apoptose. Som vist på fig. 7A B, icaritin indusert celle apoptose ble effektivt opphevet ved U0126, en potent inhibitor av MEK1 /2, men den p38-inhibitor SB203580 og JNK-inhibitor SP600125 hadde ingen virkning, noe som antyder at aktiveringen av ERK1 /2-signalering er involvert i icaritin-indusert apoptose. På samme måte kan ERK1 /2 inhibering av dets spesifikke inhibitor effektivt antagoniserer icaritin-indusert caspase-3 aktivitet (Fig. 7C). I tillegg, Western blot-analyse avslørte at U0126 hemmet vedvarende ERK1 /2-aktivering og spaltning av PARP i icaritin behandlede (fig. 7D), mens kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK hadde ingen virkning på icaritin-indusert aktivering av ERK1 /2 (Fig . 7E). Disse resultatene viste at den pro-apoptotiske virkninger av icaritin i Hec1A celler blir mediert av vedvarende aktivering av ERK1 /to signalveien.
(A) Hec1A celler ble behandlet med icaritin i nærvær eller fravær av 10 uM U0126, 10 uM SP600125, eller 40 uM SB203580 i 24 timer Celleveksten veksten~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved MTT. Stolpene representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter. *,
P
0,05 sammenlignet for icaritin-behandlede gruppen. (B) Hec1A celler ble behandlet med icaritin i nærvær eller fravær av 10 uM U0126, 10 uM SP600125, eller 40 uM SB203580 i 24 timer, og DNA-fragmentering ble bestemt. Dataene er uttrykt som middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter. *,
P
0,05 sammenlignet med icaritin-behandlede celler. (C) Hec1A-celler ble behandlet med icaritin i nærvær eller fravær av 10 uM U0126, 10 uM SP600125, eller 40 uM SB203580 i 24 timer, og caspase-3 aktivitet ble bestemt ved caspase-Glo analysen. Dataene er uttrykt som middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter. *,
P
0,05 sammenlignet med icaritin-behandlede celler. (D) Hec1A-celler ble forbehandlet eller ikke forbehandlet med 10 uM U0126 deretter tilsatt DMSO (kjøretøy) eller 10 pM icaritin i 12 timer henholdsvis 24 timer. Proteinekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å måle nivået av fosforylert ERK1 /2. Proteinnivåer av ERK1 /2 ble også målt som kontroller. (E) Hec1A-celler ble forbehandlet eller ikke forbehandlet med 10 uM U0126 deretter tilsatt DMSO (kjøretøy) eller 10 pM icaritin i 12 timer henholdsvis 24 timer. Proteinekstrakter ble fremstilt og spaltingen av PARP ble analysert med Western bolt. Proteinnivåer av β-actin ble også målt som kontroller. (F) Hec1A Celler ble forbehandlet med eller uten z-VAD-FMK (10 uM) ble videre inkubert med 10 pM icaritin i 24 timer. Proteinekstrakter ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å måle nivået av fosforylert ERK1 /2. Protein nivåer av ERK1 /2 ble også målt som kontroller.
Diskusjoner
Her har vi vist at icaritin, et sammensatt renset fra medisinsk urt Epimedium, induserer veksthemming og apoptotisk celledød i human endometrial cancer Hec1A celler ved en dose- og tidsavhengig måte.
det er vel etablert at cellesyklusprogresjon er dynamisk og er strengt regulert av komplekser inneholdende cdks og cykliner som alle er kritisk for den normale progresjon av celle syklus og inaktivering av disse proteinene fører til cellesyklus-stans [24], [25], [26]. De observerte inhiberende virkninger av icaritin på ekspresjon av cyclin D1 og cdk4 i Hec1A celler antydet at icaritin kan stanse cellesyklus ved en bestemt fase. CDK aktivitet er også regulert av CDK-hemmere som WAF1 /p21 og KIP1 /P27 familier av proteiner. Her viste vi også at icaritin induserte uttrykket nivåer av WAF1 /P21 og KIP1 /p27.
I mange celletyper, blir apoptose karakterisert ved generering av DNA-fragmenter ved virkningen av endogene endonukleaser [27] , [28]. DNA av apoptotiske celler blir spaltet til multimerer av 180-200 bp-fragmenter, som svarer til den oligonucleosomal størrelse. Derfor DNA av apoptotiske celler migrerer typisk som en stige av 180-200 bp multimerer på en agarosegel. The Terminal deoxynucleotidy Transferase Biotin-dUTP Nick End Merking (TUNEL) metoden identifiserer apoptotiske celler in situ ved hjelp av terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) til å overføre biotin-dUTP til disse trådbrudd av kløyvde DNA [29]. ELISA-analysen bestemmelse av de cytoplasmiske histon-assosierte DNA-fragmenter (mono- og oligonucleosomes) etter indusert celledød [30]. Annexin V blir brukt til å kvantitativt bestemme prosentandelen av celler i en populasjon som er aktivt som gjennomgår apoptose. Det er avhengig av eiendommen av celler til å miste membran asymmetri i de tidlige fasene av apoptose. I apoptotiske celler, er membranen fosfolipid fosfatidylserin (PS) translokaliseres fra den indre paknings av plasmamembranen til den ytre paknings, for derved å eksponere PS til det ytre miljø. Annexin V er et kalsiumavhengig fosfolipid-bindende protein som har en høy affinitet for PS, og er nyttig for identifisering apoptotiske celler med eksponert PS. Propidiumjodid (PI) er en standard strømningscytometrisk levedyktighet sonde og blir brukt til å skille levedyktig fra ikke-levedyktige celler. Levedyktige celler med intakt membraner utelukke PI, mens membraner av døde og skadede celler er gjennomtrengelig for PI. Celler som anses levedyktig er annexin V og PI negative; celler som er i begynnelsen av apoptose er annexin V positive og PI negative; celler som er i slutten av apoptose er både annexin V og PI positive; og celler som er i nekrotisk er annexin V negativ og PI negativ [31]. Den annexin V /PI farging metoden skiller apoptose celler og nekrose celler. I den foreliggende studien ble Hec1A celler behandlet med icaritin og apoptose ble analysert ved hjelp av TUNEL og ELISA-analysen. Videre er et annexin V-bindingsanalysen viste at icaritin behandling indusert apoptose, men ikke nekrose i Hec1A celler.
Mitokondrier spiller en sentral rolle i signaloverføring av apoptose [32]. Observasjonen av icaritin-mediert aktivering av kaspase-9, caspase-3, påfølgende spaltning av PARP og frigjøring av cytokrom c, i tillegg til det resultat at den pan-kaspaseinhibitor z-VED-FMK nesten fullstendig blokkert icaritin-indusert apoptose i Hec1A celler, hvilket antyder at mitokondrie-mediert caspase kaskade reaksjonsvei spiller en meget viktig rolle i icaritin-indusert apoptose [33].
Bcl-2-familien av proteiner, omfattende Bcl-2 og Bcl-2-beslektede familiemedlemmer slik som BCL-XL, Bad og Bax, spiller en viktig rolle i reguleringen av apoptose. De kan aktivere eller hemme frigjøring av nedstrøms faktorer slik som cytokrom c som fører til aktivering av kaspase-3 og PARP i utførelsen av apoptose [34]. Bax utøver pro-apoptotiske aktivitet ved translokasjon fra cytosol til mitokondriene, hvor det induserer cytokrom c frigivelse, mens Bcl-2 utøver sin anti-apoptotisk aktivitet, i det minste delvis, ved å inhibere translokasjon av Bax til mitokondriene [35] . Selvfølgelig, forholdet mellom pro- og anti-apoptotiske proteinekspresjon, slik som Bax /Bcl-2, er kritisk for induksjon av apoptose, og den bestemmer i hvilken grad cellene å gjennomgå apoptose [36]. I foreliggende studie viste vi at behandling av cellene med Hec1A icaritin resulterte i signifikant reduksjon i Bcl-2-protein og økning i Bax protein, og dermed forskyve forholdet Bax /Bcl-2 i favør av apoptose. Til sammen våre resultater indikerte at icaritin regulerer uttrykket nivåer av BCL-2-familien, induserer cytokrom c release og trig caspase-avhengige celle apoptotisk død.
Familien til MAPKs, ERK, SAPK /JNK1 /2 og p38, spiller sentrale roller i celledeling, differensiering, overlevelse, og apoptose, inkludert ekstracellulære regulerte kinase1 /2 [37], [38]. Generelt, forbigående ERK1 /2-aktivering skjer raskt og tilbakegang med 30-45 minutter, noe som anses å føre til celle-proliferasjon og overlevelse [39], men vedvarende eller forsinket ERK1 /2-aktivering som varer mer enn 12 timer er involvert i celle differensiering og død [40], [41], [42], [43]. Den doble aktivitetene til ERK1 /2 i både celleproliferasjon og celledød kan forklares med flere nylige funn som viser at fosforylert ERK kan gi forskjellige resultater, avhengig av varigheten av ERK opphopning i kjernen [44], [45]. Nylig har det blitt rapportert at vedvarende ERK-aktivering var involvert i kalsium-indusert apoptose av epitelceller linse [46]. Flere studier har vist at icaritin induserer aktivering av ERK og p38 kinase i embryonale stamceller og nerveceller, [8], [14]. Chen et al. rapporterte at icaritin induserer veksthemming og apoptose av humane prostatakreft PC-3-celler via ERK1 /2-signalveien [13]. Her fant vi også at icaritin indusert vedvarende aktivering av ERK1 /2, men ikke JNK og p38 i Hec1A celler. U0126, en spesifikk inhibitor av MEK (MAPK /ERK-kinase), effektivt blokkert icaritin-indusert ERK1 /2-aktivering og svekkede icaritin-indusert apoptose, noe som tyder på at vedvarende aktivering av ERK1 /2-signalveien er en av mekanismene.
i konklusjonen, vi fant ut at icaritin hemmet cellevekst og indusert celle apoptose i Hec1A celler. Vi studerte også de underliggende mekanismene som er involvert i icaritin-indusert apoptose. Våre resultater indikerer at icaritin-indusert hemming av cellevekst innebærer reduksjon av cyclin D1 og cdk4 protein uttrykk og induksjoner av p21 og p27 protein uttrykk. Våre resultater viste også at icaritin-indusert apoptose involverer aktivering av kaspase-3 og kaspase-9 og frigjøring av cytokrom c. Vi har funnet at forlenget ERK1 /2-aktivering var nødvendig for icaritin-indusert apoptose. Våre resultater gitt en rasjonell som icaritin kunne utvikles som en potensiell kreft middel mot human livmorkreft.
Materialer og metoder
Materialer og reagenser
Icaritin med en renhet på opptil til 99,5% var fra Dr. Kun Meng (shenogen Pharma Co Beijing, Kina). En stamløsning (10 mM) ble fremstilt ved å oppløse icaritin i DMSO (Sigma, St Louis, MO, USA) og lagret ved -20 ° C. MTT, DAPI, U0126, SP600125, SB203580, og pan-caspase inhibitor (z-VAD-FMK) ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California). Antistoff for spaltede caspase-3 ble kjøpt fra Cell Signaling (Beverly, MA). Antistoffer mot ERK1 /2, fosfo-ERK1 /2, p38, fosfo-p38, JNK, fosfo-JNK, p21, p27, cytokrom c, Bcl-2, Bax, spaltet caspase-9, cyclin D1, CDK4, PARP og β aktin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). FITC Annexin V apoptose Detection Kit jeg ble kjøpt fra Becton Dickinson (PharMingen).
Celler kultur og celleproliferasjon essay
Den menneskelige livmorkreft cellelinje Hec1A ble hentet fra Dr. Li-Hui Wei (Peking University Folks Hospital, Beijing) og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Gibco-BRL, USA) medium med 10% føtalt kalveserum (Hyclone, Utah), 5 ug /ml insulin, og holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Media blir endret i fenolrødt-fritt media med 2,5% trekull-strippet føtalt kalveserum i 24 timer før eksperimentene er nødvendige.
Cellene ble sådd i en 96-brønners skål til en sluttkonsentrasjon på 1 x 10
4 celler /brønn og inkubert i DMEM medium inneholdende 10% FCS i 24 timer. Deretter ble cellene dyrket i fenol-rød-fritt DMEM (Gibco-BRL, USA) med 2,5% trekull-strippet føtalt kalveserum (Biochrom AG, Tyskland) etterfulgt av behandling med varierende konsentrasjoner av icaritin i 12 timer, 24 timer og 48 h. Mediet ble fjernet og friskt medium ble tilsatt til hver brønn sammen med 20 ul av MTT-løsning (5 mg /ml). Etter 4 timers inkubering ble 150 ul DMSO tilsatt til hver brønn. Platene ble avlest ved bølgelengde på 490 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Bioteck POWERWAVE
TM, USA). Åtte reduplicate brønner ble anvendt for hver behandling, og eksperimentene ble gjentatt tre ganger.
Western Blot analyse
Western blot ble utført som beskrevet tidligere [47], [48]. Celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av icaritin for den angitte tid i fenol-rød-fritt DMEM (Gibco-BRL, USA) med 2,5% trekull-strippet føtalt kalveserum (Biochrom AG, Tyskland). Cellene ble oppsamlet i iskald PBS, og celleekstrakter ble fremstilt i RIPA-buffer med proteinase inhibitor cocktail fra Sigma (St.Louis, MO). Proteinkonsentrasjonene av cellelysatene ble bestemt og kokt med gel-ladningsbuffer i 10 minutter ved 100 ° C. Prøver inneholdende 30 ug totalt protein ble underkastet elektroforese på 10% SDS-polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membran (Millipore, Temecula, CA). Etter overføring, ble membranen blokkert i TBST (TBS inneholdende 0,1% Tween 20) inneholdende 5% skummet melk i 2 timer, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 ° C med passende primære antistoffer. Etter vasking tre ganger i TBST, ble membranene inkubert i 1 time ved 37 ° C med 1:2000 pepperrotperoksydase-konjugert egnede sekundære antistoffer. Til slutt ble membranene visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence deteksjon system (Amersham, Piscataway, NJ).
TUNEL analysen
Potential DNA-fragmentering ble undersøkt med fluorescens farging av tunel (Terminal Transferase dUTP Nick End Merking) apoptose deteksjon kit (Beyotime Biotech, Kina) etter produsentens anvisninger. I korthet ble celler dyrket på sterile glass coverlips fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter, og deretter permeabilisert med 0,4% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur. Celler ble inkubert med en reaksjonsblanding inneholdende biotin-dUTP og terminal deoksynukleotidyl transferase (TdT) i 60 minutter og deretter med avidin-FITC-løsning i 30 min i mørket. DAPI ble deretter lagt for nukleær farging. Mikroskopisk analyse ble utført ved hjelp av en konfokal laser-scanning mikroskop (Zeiss LSM 710 META, Tyskland).
Apoptose Påvisning av celledød Enzyme-Linked immunoabsorbans måling Metode
For ELISA, cellene sådd i 96-brønners plater (1 × 10
4 celler /brønn) ble behandlet med icaritin, så apoptotiske celler ble undersøkt ved hjelp av celledød Detection ELISA kit (Roche Diagnostics, Mannhein, Tyskland) i henhold til produsentens anvisninger. Fotometrisk enzym immunoassay ble anvendt for kvantitativt å bestemme dannelsen av cytoplasmiske histon-assosiert DNA-fragmenter i form av mononucleosomes etter apoptose av cellene. Absorbans ved 405 nm ble målt som indikator for apoptotiske celler. Referanse bølgelengde var 490 nm. Den anrikningsfaktor (total mengde av apoptose) ble beregnet ved å dividere absorbansen til prøven (A405 nm) ved absorbansen av kontrollene uten behandling (A490 nm).
Annexin V /PI-analyser for apoptose
for Annexin V /PI-analyser ble cellene farget med Annexin V-FITC og PI, og evaluert for apoptose ved flowcytometri i henhold til produsentens protokoll (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). I korthet, en x 10
6-celler ble vasket to ganger med PBS, og farget med 5 mL av Annexin V-FITC og 10 ul av PI (5 ug /ml) i 1 ml bindingsbuffer i 15 min ved værelsestemperatur i mørk. De apoptotiske celler ble bestemt ved hjelp av et Becton Dickinson FACScan cytoflurometer (Mansfield, MA, USA).
immunfluorescens farging
immunfluorescens farging ble brukt til å analysere subcellular distribusjon av cytokrom c i Hec1A celler indusert av Icaritin. Celler dyrket på sterile glass coverlips ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min. Etter permeabilisert med 0,4% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur, ble cellene blokkert i 4% BSA-PBS tilsatt i 1 time og inkubert over natten ved 4 ° C med anti-cytokrom c antistoff. Etter vasking tre ganger i PBS, ble cellene merket med TRITC-konjugert sekundært antistoff. DAPI ble deretter lagt for nukleær farging. Mikroskopisk analyse ble utført ved hjelp av en konfokal laser-scanning mikroskop (Zeiss LSM 710 META, Tyskland).
Måling av caspase-3-aktivitet
Celler ble behandlet med icaritin i fravær og nærvær av forskjellige kinase hemmere, og caspase-3-aktivitet i de ryddet lysatene ble målt ved hjelp av caspase-3 aktivitet Assay Kit (Beyotime Biotech, Kina) i henhold til produsentens anvisninger. Luminescence ble kvantifisert ved hjelp av en ELISA-leser. Blanke verdier ble trukket fra, og økning i caspase-3 aktiviteter ble uttrykt som dobling og beregnes på grunnlag av aktiviteter målt fra ubehandlede celler.
