Abstract
Ondartet glioblastom (GBM) er en svært aggressiv hjernesvulst med en sturen prognose og begrensede behandlingsalternativer. Genomisk profilering av GBM prøvene har identifisert fire molekylære undergrupper (Proneural, Neural, klassisk og Mesenchymale), som kan oppstå fra forskjellige glioblastom stilk-lignende celle (GSC) populasjoner. Vi har tidligere vist at heft kulturer av GSCs dyrket på laminin-belagte plater (Ad-GSCs) og sfæroide kulturer av GSCs (Sp-GSCs) hadde høyt uttrykk for stamcellemarkører (CD133, Sox2 og nestin), men lav uttrykk for differensiering markører (SIII-tubulin og glial fibrillary syre protein). I denne studien, preget vi GBM svulster produsert av subkutan og intrakraniell injeksjon av Ad-GSCs og Sp-GSCs isolert fra en pasient-avledet xenoline. Selv om de dannede tumorer med identiske histologiske egenskaper, genekspresjon analyse viste at xenotransplantater av Sp-GSCs hadde en klassisk molekyl subtype sammenlignes med bulk tumorceller. I kontrast xenografter av Ad-GSCs uttrykt Mesenchymale gen signatur. Heft GSC-avledet xenografter hadde høy STAT3 og ANGPTL4 uttrykk, og berikelse for stamcellemarkører, transkripsjons nettverk og pro-angiogene markører karakteristiske for Mesenchymale subtype. Undersøkelse av kliniske prøver fra GBM pasienter viste at STAT3 uttrykk var direkte korrelert med ANGPTL4 uttrykk, og at økt uttrykk av disse genene korrelerte med dårlig pasient overlevelse og ytelse. En farmakologisk STAT3 inhibitor avskaffet STAT3 binding til ANGPTL4 arrangøren og utstilt anticancer aktivitet
in vivo
. Derfor Ad-GSCs og Sp-GSCs produsert histologisk identiske svulster med forskjellige genuttrykksmønster og STAT3 /ANGPTL4 veien er identifisert i glioblastom som kan tjene som et mål for terapeutisk intervensjon
Citation. Garner JM, Ellison DW, Finkelstein D, Ganguly D, Du Z, Sims M, et al. (2015) Molekylær heterogenitet i en pasient-Avledet Glioblastoma Xenoline reguleres i ulike Cancer Stem Cell pasientgrupper. PLoS ONE 10 (5): e0125838. doi: 10,1371 /journal.pone.0125838
Academic Redaktør: Ilya Ulasov, svensk Neuroscience Institute, UNITED STATES
mottatt: 18 desember 2014; Godkjent: 25 mars 2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Garner et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Alle microarray-filer er tilgjengelig fra GEO databasen (tiltredelse nummer~~POS=HEADCOMP: GSE65576).
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Institutes of Health CA133322 (LMP og AMD), det amerikanske forsvarsdepartementet W81XWH-11- 1-0533 (LMP), den Cancer Center Support Grant 21766 fra National Cancer Institute og Foundation Assisi av Memphis (AMD), ved Muirhead Chair legat (LMP) av UTHSC og av de amerikanske libanesiske syriske Associated Charities (DWE, AMD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hjernesvulster svulster~~POS=HEADCOMP er en viktig årsak til kreft-relaterte sykelighet og dødelighet i USA, med maligne gliomer å være blant de mest aggressive og vanskelige å behandle [1]. Selv om de sjelden metastaserer, ondartet hjernesvulst er lokalt invasive, svært vaskulære svulster med store områder med nekrose og hypoksi. Prognosen for pasienter med glioma er dårlig. De fleste pasienter med glioblastoma multiforme (GBM), den mest alvorlige karakteren av gliom (WHO grad IV) og den vanligste glioma subtype hos voksne, dør innen 2 år etter diagnose, og pasientoverlevelse har vært bedrøvelig lav i flere tiår [1]. Kirurgisk reseksjon av GBM fortsatt den primære behandlingsform. Present adjuvant behandling, inkludert kjemoterapi og strålebehandling, bare gi svak bedring i sykdomsforløpet og utfallet [2]. Pasienter med residiverende GBM har en enda dystrere prognose [3].
glioblastom svulster er en heterogen blanding av cellulære og molekylære undergrupper, som kan ligger til grunn for manglende evne til konvensjonelle og målrettet terapi for å ha betydelig innvirkning pasientens utfall. Genomisk profilering har identifisert fire molekylære undergrupper av glioblastom: Proneural, Neural, klassisk og Mesenchymale [4]. Den Proneural subtype er forbundet med PDGFRA abnormiteter, IDH1 og TP53 mutasjoner, og er vanligvis funnet i yngre pasienter. De fleste gliomer er klassifisert som Proneural på grunn av deres oligodrendrocytic signatur [5-7]. Genuttrykket av Neural klasse av gliom ligner nærmest normalt hjernevev, og har en sterk berikelse for genene forskjellig uttrykt av nerveceller. The Classical glioma subtype har en astrocytic signatur; EGFR forsterkning er ofte observert i denne svulsttypen samt høy uttrykk for nestin (a neural forløper og stamcelle markør), og Notch og Sonic pinnsvinet signalveier. Gliomer klassifisert som Mesenchymale utviser høyere ekspresjon av mesenchymale markører, MET og CHI3L1, og genene i NF-kB reaksjonsvei, som for eksempel Tradd, relB og TNFSF1A, samt delesjon av NF1 [8, 9]. Svulster med Mesenchymale gen signatur tendens til å være mer aggressive, svært motstandsdyktig mot terapi, føre til en høyere rate av tilbakefall og har dårligere samlede resultater enn svulster i klassisk, Proneural og Neural subtype [8]. Derfor er en mer detaljert molekylær forståelse av Mesenchymale subtype i GBM avgjørende for å bedre terapeutisk design og pasientenes prognose.
tumorigent prosessen i glioblastom er tilsynelatende initiert og opprettholdes av en sjelden undergruppe av GBM stilk-lignende celler ( GSCs) [10-12]. Som tilfellet er med normale stamceller, kan GSCs fornye seg selv og gjennomgå differensiering, men de har høy tumor-initiering kapasitet og motstand terapeutisk [13]. Disse stilk-lignende celler er vanligvis isolert basert på deres evne til å vokse som multicellulære, ikke-tilfestede kuler fra en enkelt cellesuspensjon [14, 15], som vi betegner som sfæroide GBM stilk-lignende celler (Sp-GSCs). Imidlertid er utvidelse av Sp-GSCs teknisk utfordrende, og som kuler forstørre differensiert avkom vises og døende celler akkumuleres innenfor sfæren kjerne. Som et alternativ tilnærming, heft GSCs isolert fra GBM (Ad-GSCs) og dyrket i kjemisk definert medium på laminin-belagt vevsdyrkingskolber vise stamcelleegenskaper og initiere høy klasse hjernesvulst etter xenotransplantasjon [16].
i den foreliggende rapporten, ble Ad-GSCs og Sp-GSCs isolert fra en GBM pasient-avledet xenoline (PDX) som har den klassiske genet signatur. Når injisert subkutant i kantene eller orthotopically inn i hjernen til immunsupprimerte mus ble Ad-GSCs og Sp-GSCs funnet å ha markert forbedret tumor igangsetting av virksomhet (TIA) i forhold til bulk tumorceller og skjema svulster som viser identiske histologiske funksjoner . Av notatet, mens begge GSC populasjoner
in vitro
ha en mesenchymale gen signatur, Sp-GSCs produsere svulster med en klassisk gen signatur; dermed de recapitulate de molekylære egenskaper av det opprinnelige GBM PDX. I kontrast, Ad-GSCs produsere svulster med en mesenchymale gen signatur. Foruten oppregulert uttrykk for mange gener som er typiske for mesenchymale underklasse, svulster produsert fra Ad-GSCs viste oppregulert uttrykk for STAT3 og Angiopoietin like-4 (ANGPTL4). STAT3 er en viktig transkripsjon faktor som spiller en betydelig rolle i onkogenese. ANGPTL4 har blitt rapportert å virke ikke bare som en tumor suppressor [17], men også som en enhancer av tumormetastase og angiogenese [18]. Mest interessant, en farmakologisk STAT3 inhibitor blokkert STAT3 binding til ANGPTL4 promoter, og
in vivo
antitumoraktivitet i Ad-GSC xenografter.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige GBM6 pasient-avledet xenograft (PDX) av voksen glioblastom vev ble gitt av Dr. C. David James, (Department of Neurological Surgery, University of California, San Francisco) [19], og kontinuerlig vedlikeholdes som subkutane transplantater i fem uker gammel mannlig NOD.Cg
Prkdc
SCID
Il2rg
tm1Wjl Twitter /SzJ NSG ( ) mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Cellekulturer av GBM6 PDX ble avledet fra kjøttdeig, nyhøstet svulstvev. Kortsiktige GBM6 kulturer av differensierte bulk tumorceller ble dyrket som heft monolag for 2 til 5 passasjer i DMEM (Cellgro, Herndon, Virginia) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (Hyclon Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) , 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Ad-GSCs og Sp-GSCs ble opprettholdt i Neurobasal-A-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) inneholdende 2% B27 supplement, 2 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, EGF (20 ng /ml) og basisk FGF (40 ng /ml). For isolering av Ad-GSCs, ble kulturflasker belagt med 100 mikrogram /ml poly-D-lysin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 1 time, etterfulgt av belegning med 10 ug /ml laminin (Gibco, Life Technologies Inc. , Grand Island, NY) i 2 timer før bruk. Ad-GSCs ble sådd ut i 75 cm
2 kolber, vokst til samløpet, skilt med HyQTase (Thermo Scientific, Scientific, Rockford, IL), og delt på en 1: 3-. For isolering av Sp-GSCs ble glioma celler dissosiert med HyQtase og belagt i ultralave vedheft kolber.
underhudssykdommer xenografter
Dyreforsøk ble utført i samsvar med en studieprotokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Tennessee Health Science Center. Glioblastom xenografter ble etablert i fem uker gammel mannlig NOD.Cg-
Prkdc
SCID
Il2rg
tm1Wjl Twitter /SzJ (NSG) mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ved direkte flanke injeksjon av celler (1 x 10
6) transduced med luciferase lentivirus konstruerer [20]. Svulster ble målt to ganger ukentlig med håndholdt caliper. For bioluminesens imaging, ble musene injisert intraperitonealt med d-luciferin (luciferase substrat), avbildes på IVIS
in vivo
bildesystem (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), og fotoniske utslipp vurderes ved hjelp av levende bilde programvare . For å bestemme virkningen av STAT3 inhibering, ble en gang detekterbare tumorer bestemt ved kalibermåling (vanligvis innen 2 uker av celleinjeksjon), WP1066 (40 mg /kg) i DMSO /Polyetylenglykol ble levert annen hver dag ved intratumoral injeksjon. Denne dosen av WP1066 har vært brukt tidligere i prekliniske
in vivo
studier [21-23].
ortotopiske injeksjoner
Dyrestudier ble utført i samsvar med fastsatte retningslinjer og veiledning av Institutional Animal Care og bruk komité St. Jude Children Research Hospital sin, slik det kreves i USA dyrevernloven og National Institutes of Health har som policy å sikre forsvarlig omsorg og bruk av forsøksdyr i forskning. Bedøvd (ketamin /xylazin) CB17 SCID mus ble plassert på stereoutstyr der hodebunnen ble preparert ved bruk av alkohol og jod spinner og kunstig tåre gel brukes på øynene. Etter hodebunnen eksisjon, ble en rektangulær kranial vindu skåret ut og dura ble fullstendig fjernet fra overflaten av hjernen, og 1×10
6-celler suspendert i 10 ul medium ble injisert ca. 2,5 mm dypt i den høyre motor cortex. Eksisjon området ble stengt med hud lim, og alle dyrene ble overvåket nøye 24 timer etter operasjonen. Tumorvev ble høstet ved grov inspeksjon av injeksjonsstedet, som var lett visualisert ved bruk av en cranial vindu. Når dette området ble identifisert, forsiktig disseksjon tillatt delsum fjerning av svulstvev alene; imidlertid, ble ytterligere forsøk utført for å sikre at ikke noen museceller ble inkludert i prøven.
Genekspresjon analyse
Total RNA ble isolert ved behandling av vevshomogenater med Trizol etterfulgt av isolering med RNeasy Mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Prøvene ble sendt inn for fullstendig mRNA uttrykk profilering til UTHSC Center of Genomics og bioinformatikk (Memphis, Tennessee) for merking og hybridisering til menneske-HT12 BeadChips (Illumina Inc.). Microarray data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE65576 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65576). Genekspresjon ble også målt på NCounter Analysis System (Nanostring Technologies, Seattle, WA) ved hjelp av et panel av 230 humane kreft-relaterte gener. I korte trekk, ble totalt RNA blandet med par av fangst og reporter sonder, hybridisert på NCounter Prep Station, og rensede komplekser ble målt på NCounter digital analysator. For å ta hensyn til forskjeller i hybridisering og rensing, ble data normalisert til gjennomsnittstall for alle kontroll toppene i hver prøve og analysert med nSolver programvare. Genuttrykksmønster var kvalitetssikret av Principal Component Analysis (PCA). Gener ble statistisk testet av ulike varians t-tester. Den falske funnrate (FDR) ble beregnet til å kontrollere for multiple sammenligninger ved hjelp Partek Genomics Suite 6.6. Resultatene ble visualisert ved hjelp av Stata /MP 11.2. I tillegg ble 3-5 (10 um) krøller kuttet fra 24 glioblastom pasient biopsiprøver (UTHSC Tissue Services Core), RNA isolert ved hjelp av RecoverAll Total nukleinsyre Isolation Kit (Ambion), og genekspresjon ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR .
Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA)
IPA (Qiagen Inc., Valencia, CA) ble brukt til å identifisere kanoniske signalveier og funksjonelle veier samt å produsere nettverk av beslektede gener som stammer fra gener endret i de analyserte sammenligninger. Her ble de rang-produkt generert genet lister ved hjelp av en 5% FDR lastet inn i IPA-serveren som inngangsdata. IPA bruker pathway biblioteker som stammer fra den vitenskapelige litteraturen. Statistikk for funksjonell analyse ble utført av Fischer eksakte test.
Histopatologi
svulstvev produsert ved injeksjon av bulk tumorceller, Ad-GSCs og Sp-GSCs (fire separate svulster for hver tilstand) ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin i 24 timer, innstøpt i parafin voks, og i snitt på 5 um tykkelse. For hver prøve ble seksjonene farget ved anvendelse av en standard hematoxylin og eosin (H CHI31 5′-GTGAAGGCGTCTCAAACAGG-3 «(fremover), 5′-GAAGCGGTCAAGGGCATCT-3′ (bakover); Tradd 5»-GCTGTTTGAGTTGCATCCTAGC-3 «(fremover), 5′-CCGCACTTCAGATTTCGCA-3′ (bakover); NF1 5»-AGATGAAACGATGCTGGTCAAA-3 «(fremover), 5-CCTGTAACCTGGTAGAAATGCGA-3′ (bakover); RelB 5»-CAGCCTCGTGGGGAAAGAC-3 «(fremover), 5′-GCCCAGGTTGTTAAAACTGTGC-3′ (bakover); CASP4 5»-TTTCTGCTCTTCAACGCCACA-3 «(fremover), 5′-AGCTTTGGCCCTTGGAGTTTC-3′ (bakover); FGFR3 5»-TGCGTCGTGGAGAACAAGTTT-3 «(fremover), 5′-GCACGGTAACGTAGGGTGTG-3′ (bakover); PDGFA 5»-GCAAGACCAGGACGGTCATTT-3 «(fremover), 5′-GGCACTTGACACTGCTCGT-3′ (bakover); EGFR 5»-CTACGGGCCAGGAAATGAGAG-3 «(fremover), 5′-TGACGGCAGAAGAGAAGGGA-3′ (bakover); Akt2 5»-ACCACAGTCATCGAGAGGACC-3 «(fremover), 5′-GGAGCCACACTTGTAGTCCA-3′ (bakover); Nestin 5»-GGCGCACCTCAAGATGTCC-3 «(fremover), 5’CTTGGGGTCCTGAAAGCTG-3» (bakover).
TCGA dataanalyse
For å undersøke forholdet mellom STAT3 og ANGPTL4 uttrykk i menneskelig GBM hjernevev, spørres vi TCGA data portal for all lavgradig gliom og GBM prøver med genuttrykk (BI_HT_HG-U113A Array datasett) data samt tilhørende kliniske data. Datasettet ble filtrert for prøver med uttrykk data for STAT3, ANGPTL4 og kliniske data, som gir et endelig sett av 466 individuelle lavgradige glioma prøver og 328 uavhengige GBM pasientprøver. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Graphpad Prism.
apoptose analysen
induksjon av apoptose ble overvåket av flowcytometri (Accuri Model 6C) ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit (BD Pharmingen, San Diego, California), i henhold til produsentens instruksjoner.
Chromatin immunoprecipitation
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) ble utført ved bruk av chip-i Express Enzymatisk kit (Active Motif, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, kromatin fra celler som var tverrbundet med 1% formaldehyd (10 min ved 22 ° C), skåret til en gjennomsnittlig størrelse på ~ 200 bp, og deretter immunopresipitert med anti-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology). ChIP-PCR primere ble designet for å forsterke en proksimal promoter område som inneholder en antatt STAT3 (-1369 til -1348) bindingssetet i ANPTL4 promoter. Primerne som ble brukt var 5’CATTAAAGACCCTGGCGGTA -3 «(fremover), 5’GGATCACAGTCGTGTGAGGA -3» (bakover).
Statistisk analyse
Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført i to eksemplarer, og data er presentert som gjennomsnitt ± sD. ANOVA og post-hoc minst signifikant forskjell analyse eller Student
t
testene ble utført.
p
verdier 0,05 (*) ble vurdert som statistisk signifikant.
Resultater
Forskjeller i de molekylære signaturer av GSCs vokst
in vitro Hotell og som subkutane xenografter
Glioblastoma er kjennetegnet ved omfattende heterogenitet ved de cellulære og molekylære nivåer [24], noe som kan gjenspeile tilstedeværelsen av forskjellige kreftstamcellepopulasjoner. I en tidligere studie, isolert vi Ad-GSCs og Sp-GSCs fra GBM6 PDX, og viste at begge populasjonene hadde høyt uttrykk for stamcellemarkører, for eksempel CD133, Sox2 og nestin, men lav uttrykk for differensiering markører som βIII- tubulin og glial fibrillært syre-protein sammenlignet med bulktumorceller [25]. Begge bestandene opprettholde høy CD133 uttrykk ( 85%) av flowcytometrisk analyse selv når de ble opprettholdt i serumholdig medium for en uke, noe som gir sterke bevis for at disse GSCs representerer en «ekte» stamcelle befolkningen og at «stemness» er ikke et produkt av media (serum versus vekstfaktorer). Begge populasjoner hadde høy konstitutiv STAT3 og NF-kB-aktivering, noe som resulterte i oppregulering av Notch pathway. For å karakterisere de molekylære signaturer av disse GSC populasjoner mer fullstendig, ble RNA fremstilt fra biologiske replikater av GBM6 celler dyrket som enten kortsiktige kulturer av differensierte bulk tumorceller, ble Ad-GSCs, eller Sp-GSCs, og hele genomet uttrykk profilering utføres på HT-12 uttrykk Bead-Chips ved UTHSC Center of Genomics og bioinformatikk. Hierarkisk clustering ble brukt til å vurdere differensial uttrykk for ~ 840 GBM subtype Predictor genene [4]. Som vist i figur 1A, en heatmap av variasjonen i ekspresjonen av disse genene prediktor viste at celler dyrket
in vitro
under begge GSC betingelser oppviste meget lignende uttrykk profiler, som var vesentlig forskjellig fra den ekspresjonsprofilen av den svært differensierte bulk tumorceller dyrket i serumholdig medium. I samsvar med våre tidligere funn [25], høy nestin ble Sox2 og CD133 uttrykk som finnes i begge GSC bestander, mens SIII-tubulin og glial fibrillary syre protein ble uttrykt ved relativt lave nivåer. Således, selv om de to GSC populasjoner ble dyrket under forskjellige dyrkningsbetingelser (vedheftende i forhold til suspensjonskultur), deres genekspresjonsprofiler var svært like. Vi deretter sammen den matematiske variansen blant de forskjellige datasampler ved PCA, som er en ukontrollert analytisk metode lik faktor analyse som er følsom for alle årsaker til variasjoner i dataene. Visualisering av de første tre komponentene gjør det mulig for kvalitetskontroll og den relative vurdering av variasjon av replikater. Dette PCA visualisering gjør det også vurderingen av kategoriske faktorer av interesse ved å demonstrere om dataene naturlig tilslag av disse faktorene eller av en ukjent eller systematisk faktor som batch. Når genuttrykk av GSC populasjoner og bulk kreftceller dyrket
in vitro
ble utsatt for PCA analyse, genuttrykk profiler i de to forskjellige GSC kulturer ble også funnet å være relativt like, mens det av bulk kreftceller vokst
in vitro
ble markert forskjellig (fig 1B).
RNA ble fremstilt fra GBM6 bulk tumorceller, Ad-GSC og Sp-GSC kulturer samt fra subkutane tumorxenotransplantater av disse injiserte celler. Biologiske duplikater ble utført for hver prøve og data ble samlet inn og analysert. A. Gene ekspresjon ble målt ved Illumina matrise og gener som er rapportert i TCGA databasen ble analysert. B. PCA plottet representerer sammenligning av genet underskrifter fra hver tilstand.
Vi utførte hele genomet uttrykk analyse på svulster produsert fra ulike GBM celle populasjoner. I korte, bulk tumorceller, Ad-GSCs og Sp-GSCs (1 x 10
6 celler) ble injisert i flankene av immunsupprimerte NSG mus, og en gang nådde et volum på ~ 200 mm
3, svulster var eksisert, RNA ble fremstilt og underkastet mikromatriseanalyse. I motsetning til
in vitro
funn, svulster produsert fra Ad-GSCs og Sp-GSCs hadde markert forskjellige uttrykk profiler som gjenspeiles av de heatmaps av genuttrykk profiler (figur 1A) samt PCA av gjennomsnittlig genekspresjon (figur 1B). De tumorxenografter av de differensierte bulk tumorceller og Sp-GSCs var svært like, noe som er konsistent med det funn at Sp-GSCs re-populere GBM tumorer med genekspresjonsprofiler nesten identisk med den i bulk tumorceller [26]. Derfor, mens genuttrykket av Sp-GSCs og Ad-GSCs vokst
in vitro
er svært like,
in vivo
molekylær signatur av svulstvev er ganske annerledes. Disse resultatene tyder på at distinkte stamcellepopulasjoner eksisterer i GBM og fremme svulst heterogenitet.
Ad-GSC og Sp-GSC xenografter uttrykke forskjellige molekylære profiler
For å finne ut om de molekylære profiler av Ad-GSCs og Sp-GSCs tilsvarte en hvilken som helst av de fire molekylære subtyper av glioblastom vi sammenlignet ekspresjonen av de ~ 840 GBM prediktor gener i våre celle- og vevsprøver med den i 202 glioblastom tumorvev i TCGA databasen, som representerer Klassiske (hvite sfærer) , Neural (svarte kuler), Proneural (blå kuler) og Mesenchymale (grå kuler) underklasser. Figur 2A viser, som ventet, at GBM tumorprøver danne fire forholdsvis atskilte grupper som tidligere er vist [4], men det er en viss overlapping i uttrykk mønstre mellom disse fire underklasser. De genuttrykk profiler av Ad-GSCs (røde kuler) og Sp-GSCs (gule kuler) vokst
in vitro
ligne den Mesenchymale GBM underklasse. I motsetning uttrykket profilen til bulk GBM6 tumorceller dyrket
in vitro plakater (oransje kuler) er assosiert med klassisk GBM subtype, som er konsistent med det som tidligere ble funnet (Y. Gillespie, personlig meddelelse). Vi undersøkte neste mønster av genekspresjon i flanke svulster i disse cellene. Mest interessant, svulster som oppsto fra Ad-GSCs uttrykt Mesenchymale gen signatur, som minner om Ad-GSCs vokst
in vitro
. I kontrast, svulster som oppsto i mus injisert med Sp-GSCs hadde en klassisk subtype signatur, som ligner gensignaturen av svulster som stammer fra bulktumorceller. Dermed Sp-GSCs og Ad-GSCs har lignende molekylære egenskaper (Mesenchymale subklasse)
in vitro
, som er forskjellig fra bulktumorceller dyrket (Classical underklasse)
in vitro
. Når det injiseres i mus, er disse GSCs danne molekylært forskjellige tumorer. Ad-GSCs opprettholde en Mesenchymale gen signatur
in vitro Hotell og
in vivo
, mens Sp-GSCs repopulate svulsten med en klassisk gen signatur, lik som bulk tumorceller.
A. Array analyse ble utført og sammenlignet med glioblastom molekylære undergrupper; PCA kartet viser klassisk, mesenchymale, nevrale, og proneural gen signaturer og genet signaturen GBM6 celler og svulstvev som stammer fra bulktumorceller, Ad-GSCs og Sp-GSCs. B. og C. RNA ble isolert fra tre individuelle svulster avledet fra GBM6 bulk tumorceller, Ad-GSCs og Sp-GSCs (B), og fra disse cellene dyrket
in vitro product: (C) for å finne genet ekspresjon av molekylære markører for Mesenchymale (CHI3L1, Tradd, NF1, relB og CASP4) og Classical (FGFR3, PDGFA, EGFR, akt2 og nestin) underklasse av glioblastom med qPCR og normalisert til aktin uttrykket (n = 3). Feil barer, S.D. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.
For ytterligere å karakterisere genuttrykk i Ad-GSCs og Sp-GSCs tumorxenotransplantater, undersøkte vi uttrykket av gener som tidligere definert til å være karakteristisk for den klassiske (FGFR3, PDFA, EGFR, AKT -2 og nestin) og Mesenchymale (CHI3L1, Tradd, NF1, relB og CASP4) glioblastom subtyper [4]. RNA ble ekstrahert og samlet fra tre individuelle subkutane xenografter avledet fra bulk tumorceller, Ad-GSCs eller Sp-GSCs, og uttrykket av disse markørgener ble bestemt av qPCR. Fig 2B viser at uttrykket av Mesenchymale markører CHI3L1, Tradd og relB er signifikant forhøyet i Ad-GSCs xenografter i forhold til tumorxenotransplantater bulk tumorceller og Sp-GSCs. I motsetning til dette tumor suppressor NF1, som er nedregulert i Mesenchymale glioblastom, er uttrykt ved relativt lave nivåer i tumorvev fra Ad-GSCs sammenlignet med tumorer avledet fra Sp-GSCs bulktumorceller. Den Mesenchymale markør, CHI3L1, i kombinasjon med astrocytic markører er indikativ for en epitelial-til-mesenchymale overgang som har vært knyttet til aggressive, dedifferensierte tumorer [27]. Gener i TNF og NF-kB reaksjonsveier, slik som Tradd og relB, er sterkt uttrykt i Mesenchymale undertype, så vel som en mulig en konsekvens av økt nekrose og assosierte inflammatoriske infiltrater [28]. I tillegg er den klassiske markørgener FGFR3, PDGFA, EGFR og nestin alle uttrykt ved relativt høye nivåer i tumorxenografter av bulktumorceller og Sp-GSCs, sammenlignet med xenotransplantater av Ad-GSCs, noe som er konsistent med den PCA-analyse klassifiseringen av svulstene som den klassiske undertype. I kontrast er EGFR og nestin uttrykt ved ekstremt lave nivåer i Ad-GSC tumorxenotransplantater, som er i samsvar med deres klassifisering som Mesenchymale svulster. Betydelig EGFR forsterkning er observert i 97% av Classical glioblastomas i TCGA databasen, men sjelden i andre undergrupper. Den GBM6 xenograft er avledet fra en pasient med overekspresjon av VIII mutant av EGFR, og vårt funn av høy EGFR-ekspresjon i bulk tumorceller og i tumorer avledet fra dem er i overensstemmelse med EGFR overekspresjon. Men det er svært interessant at svulstene fra Ad-GSCs uttrykke relativt lave EGFR nivåer som gir ytterligere bevis på at Ad-GSCs er et tydelig GSC befolkning. Basert på disse funnene på differensial markør genuttrykk i GSC xenografter, vi deretter undersøkt uttrykk for Mesenchymale og klassiske markørgener i bulk tumorceller, Ad-GSCs og Sp-GSCs vokst
in vitro
. Som vist i figur 2C, er et uttrykk for den klassiske markørgener FGF3, PDGFA, EGFR og akt2 markert nedregulert i begge GSC populasjoner i forhold til bulk tumorceller dyrket
in vitro
. I tillegg er det forhøyet uttrykk av Mesenchymale markørgener Tradd, NF1 og relB i både Ad-GSC og Sp-GSC populasjoner vokst
in vitro
. Samlet våre studier indikerer at Ad-GSCs er et molekylært distinkt GSC undergruppe seg fra Sp-GSCs. Ad-GSCs utstillingen en Mesenchymale gen signatur
in vitro
, og fremme dannelsen av mesenchymale svulster
in vivo
.
Histopatologi av Sp-GSC og Ad-GSC xenografter
en viktig egenskap ved GBM er markert morfologisk heterogenitet innenfor selve svulsten, så vel som mellom forskjellige GBM tumorer. Den molekylære heterogenitet observert i våre glioblastom xenografter av bulk tumorceller, Ad-GSCs og Sp-GSCs ledet oss til å undersøke histopatologi av disse svulstene. Fire individuelle subkutane svulster avledet fra hver cellekultur tilstand var formalinfiksert, parafininnebygd, og seksjonert. Hver prøve ble H E farget, og immunhistokjemi ble utført for å måle immunoreaktivitets med antistoffer for følgende nevrale markører: GFAP, S100, OLIG2, MAP2 og synaptophysin. Som vist i figur 3A, den klassiske GBM svulster i bulk tumorceller og Sp-GSCs xenograftene og Mesenchymale svulster i Ad-GSC xenografter var fast bestemt på å være høy klasse hjernesvulst og var morfologisk utvisket. Tumorceller med høy atom: cytoplasma ratio og liten atom pleomorphism viste morfologi relativt udifferensierte høy klasse hjernesvulst. Immunohistokjemi av tumorvevet vist et enhetlig fenotype mellom de forskjellige tumorxenografter (figur 3B). Det var sterk immunoreaktivitet for GFAP og OLIG2 i mange kreftceller, mens alle kreftceller uttrykt S-100 og MAP-2. Det var ingen immunoreaktivitets for synaptophysin. Across området nevrale tumorer, GFAP, OLIG-2 og MAP-2 er generelt uttrykt av hjernesvulst, mens neuronal markør synaptophysin er ikke [29-32]. Disse funnene viser likheten på mikroskopisk nivå mellom molekylært distinkte xenografter av bulk tumorceller, Sp-GSCs og Ad-GSCs.
GBM6 bulk tumorceller, Ad-GSCs, og Sp-GSCs ble injisert subkutant og fikk vokse til en diameter på 400 mm ~
3. Svulster ble høstet og parafin innebygd for histologi. A. H E farging og B. immunreaktivitet for GFAP, S100, OLIG2 og MAP2. (Alle photomicrographs tatt på 200x).
Adherent GSCs fremme dannelsen av intrakranielle svulster med en Mesenchymale signatur
For å undersøke hvilken rolle svulsten mikromiljøet på genuttrykk i GBM * P * P * P * P * P
