Abstract
Canine inflammatorisk mammary kreft (IMC) aksjer epidemiologiske, histopatologiske og kliniske karakteristika med de sykdommer hos mennesker og har blitt foreslått som en naturlig modell for human inflammatorisk brystkreft (IBC). Hensikten med denne studien var å karakterisere en ny cellelinje fra IMC (IPC-366) for den sammenlignende studie av både IMC og IBC. Svulster celler fra en kvinnelig hund med kliniske IMC ble samlet. Cellene ble dyrket under adherente betingelser. Vekst, cytologiske, ultra og immunhistokjemisk (IHC) egenskaper ved IPC-366 ble evaluert. Ti kvinnelige Balb /SCID mus ble inokulert med IPC-366 celler til å vurdere sin tumorigenicity og metastatisk potensial. Kromosomaberrasjonstest og Karyotype avslørte tilstedeværelsen av strukturelle avvik, numeriske og nøytrale rearrangements, viser en kromosomal instabilitet. Mikroskopisk undersøkelse av tumor viste en epitelial morfologi med markert anysocytosis. Cytologisk og histologisk undersøkelse av utstryk og supertynne seksjoner ved elektronmikroskopi viste at IPC-366 er dannet av svært ondartet stor rund eller mangekantet celler preget av markant atypia og fremtredende nucleoli og hyppige multinucleated celler. Noen celler hadde cytoplasmatiske tomrommene som omfattes av cytoplasmamembranen likner kapillære endotelceller, et fenomen som har vært knyttet til s vaskulær mimikk. IHC karakterisering av IPC-366 var basal-like: epitelceller (AE1 /AE3 +, CK14 +, vimentin +, actin-, p63-, ER-, PR-, HER-2, E-cadherin, overexpressed COX-2 og høy ki- 67 spredningsindeks (87,15%). Ved 2 uker etter inokulering IPC-366-celler, ble en tumormasse som finnes i 100% av musene. Ved 4 ukers metastaser i lungene og lymfeknuter ble funnet. Xenograph tumorer opprettholdt den opprinnelige IHC karakteristika . kvinnelige hund tumor Oppsummert cellelinjen IPC-366 er en raskt voksende ondartet trippel negativ cellelinje-modellen av inflammatorisk brystkreft som kan brukes for den sammenlignende studie av både IMC og IBC
Citation.: Caceres S, Peña L, de Andres PJ, Illera MJ, Lopez MS, Woodward WA, et al (2015) Etablering og karakterisering av en ny mobil line of Canine inflammatorisk melke Cancer:.. IPC-366 PLoS ONE 10 (3): e0122277 doi: 10,1371 /journal.pone.0122277
Academic redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES
mottatt:. 28 november 2014; Godkjent: 17 februar 2015; Publisert: 25 mars 2015
Copyright: © 2015 Caceres et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. det ble gitt av det spanske departementet for vitenskap og utdanning (forskningsprosjekt ingen SAF 2009-10572.) til SC, LP, PJA, MJI, og JCI. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Inflammatory mammary kreft (IMC) er den mest aggressive melke neoplasi som påvirker kvinnelige hunder [1, 2]. Dens motstykke sykdom hos mennesker som er kjent som inflammatorisk brystkreft (IBC) og utgjør mindre enn 6% av humane brystcancerdiagnoser med en dårlig overlevelse hos kvinner [3, 4]. I begge arter, denne typen kreft er svært angiogen og angioinvasive [5-8]. Den viktigste histologiske kjennetegn ved sykdommen i begge arter er massiv invasjon av dermal lymfekar av neoplastiske celler som blokkerer lymfedrenasje forårsaker den karakteristiske ødem [1, 9].
Det er betydelig epidemiologiske, kliniske og histopatologiske likheter som deles av IBC og IMC, derfor den sistnevnte er ansett som en god spontan modell for å studere den humane sykdommen [2, 8]. Bruken av cellelinjer i kreftforskning gir fordeler i undersøkelse av cellevekst og progresjon [10-12]. Mer enn 33 humane brystcancercellelinjer fra primærtumorer, metastatiske tumorer og pleural effusjon har blitt etablert [10, 11, 13]. Men for å utføre studier på IBC, blir cellelinjer tilgjengeligheten begrenset til SUM149, SUM 190 og MDA-IBC-3, FC-IBC02 [12, 14, 15].
I de siste årene flere canine melke carcinom cellelinjer er blitt utviklet [16-18], selv om, er ingen av dem en hund inflammatorisk cellelinje. Det er således ønskelig å utvikle og etablere en hund IMC cellelinje for å sammenligne den inflammatoriske brystkreft type i begge arter og for å lette ytterligere in vitro-studier. Målet med denne studien var å etablere det første IMC cellelinje (IPC-366) og for å karakterisere det i form av immunfenotypen og tumorigenicity.
Materialer og Metoder
Tumor prøven
en IMC-cellelinje (IPC-366) etablert fra en hund primær IMC prøve oppnådd umiddelbart etter avliving av en kvinnelig hund klinisk og histopathologically diagnostisert med IMC, i henhold til de tidligere IMC diagnostiske egenskaper som er publisert for denne arten [1, 19] : raskt voksende sykdom i melkekjertlene og overliggende huden, med erytem, fasthet, varme, ødem, jevning, og tegn til smerte, i henhold til den henvisende veterinær kliniker. Den opprinnelige hunden brysttumor ble diagnostisert som et fast stoff karsinom med flere tumor emboli i overfladisk dermale lymfekar (fig. 1), noe som bekrefter diagnostisering av IMC [2, 20]. Etter eutanasi ble tumorprøver hurtig oppnådd ved obduksjon og behandlet for histopatologisk bekreftelse av IMC og cellekultur. Tumorfragmenter (1,5 cm) ble plassert i Modified Eagle «s Medium (MEM) med penicillin-streptomycin-løsning (Sigma Aldrich, Madrid)
tumorparafinsnitt, H . E. A (10X) y B (20X). Neoplastisk emboli i overfladiske dermis. Tumorceller utviser markert anisocitosis og anisokaryosis, og tydelig stor nucleoli. Infiltrere tumorceller (pil).
histopatologi og obduksjon ble utført ved patologi Service av Complutense Veterinary Clinical Hospital (Complutense-universitetet i Madrid). Institutional Animal Care og bruk komité ved Universitetet Complutense i Madrid, godkjent Spania de kliniske og eksperimentelle protokoller for denne studien (nummer: 115). Alle prosedyrer ble gjennomført i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og likedannet med relevant EU-direktivet.
Etablering av cellelinjen
svulstvev var fragmentert og vasket (3 ganger) med Hanks Balanced Salt Solution med 1% penicillin-streptomycin-løsning (Sigma Aldrich). Deretter ble de tumorfragmenter disaggregert med kollagenase type 1A (Sigma Aldrich) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% karbondioksyd i 2 timer med kontinuerlig omrøring. Deretter ble skilt ut vev suspensjonen sentrifugert ved 1000 rpm, 20 ° C i 5 minutter, og de pelleterte cellene resuspendert i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium Nutrient Blanding F-12 Ham (DMEM /F12) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma Aldrich), 1% penicillin-streptomycin-løsning og 1% L-glutamin (Sigma Aldrich). Cellesuspensjonen ble plassert i 25-cm
2 kulturflasker (Controltecnica Instruments, Madrid) og holdt i en fuktet atmosfære av 5% karbondioksyd ved 37 ° C. Cellekultur ble observert daglig med et fasekontrastmikroskopi.
Når de dyrkede cellene nådde 90% konfluens ble de vasket med Hanks balanserte saltoppløsning supplert med peninicilin-streptomicin løsning og dispergert i 0,25% trypsin (Sigma Aldrich) med PBS inneholdende EDTA. Underkulturer ble fremstilt fra dispergerte celler ved reseeding i nye 25 cm
2 kolber i en konsentrasjon på 1×10
5 celler /ml. Andre dispergerte Cellene ble suspendert i DMEM /F12 inneholdende 20% FBS og 10% dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma Aldrich) og oppbevart ved -80 ° C. Etableringen av IPC-366 ble ansett på passering 30
th.
Vekst analysen
Celler på passering 30
th ble sådd på 1xl0
5 celler i 25- cm
2 kulturflasker og holdt i fullstendig DMEM /F12-medium ved 37 ° C i 7 dager. Hver 24 timer, tre replikative kolber ble trypsinert og cellene ble tellet med et hemocytometer. En vekstkurve ble etablert, og cellevekst dobling tid ble anslått fra sin eksponentiell vekstfase.
tumorigenitet analysen
Gitt de godt verdsatt argumenter av murine xenograft modeller, en suspensjon av 10
6 IPC-366 celler ble subkutant inokulert i ventrale regionen ti 8 uker gamle Balb /SCID-mus. Musene ble inspisert ukentlig for utvikling av svulster. Når svulster ble oppdaget, ble de ukentlig overvåket ved palpasjon og målt ved målepunktene. Musene ble avlivet etter 30 dager etter vaksinasjonen, og svulster og organer ble samlet ved obduksjon og plassert i 4% paraformaldehyde (pH = 7,4) for histologisk undersøkelse.
Cytologi, histopatologi og immunhistokjemi
Cellular flekker ble utarbeidet og farget ved hjelp av Diff-Quick for cytomorphological vurdering. IPC-366 immunfenotyping ble utført i canine opprinnelige svulsten og svulst pellets ved hjelp av følgende markører (tabell 1): pancytokeratin (AE1 /AE3), cytokeratin 14 (CK14), p63, vimentin (vim), α-glatt muskel aktin (SMA) , østrogen og progesteronreseptorer (ER og PR), human epidermal reseptor-2 (HER-2), cyclooxigenase-2 (COX-2), E-cadherin (E-Cad), og Ki-67 (merket proliferasjon). Parafinsnitt ble plassert i en PT-modul (Lab Vision) inneholdende et EDTA-buffer-løsning (pH 8,0) (Master Diagnostica, MAD-004072R /D), oppvarmet i 20 minutter ved 95 ° C og avkjølt til 60 ° C. Etter denne høye temperatur antigen gjenfinning protokollen, ble objektglass skyllet i varmt vann fra springen og plassert i en automatisert Immunostainer anordning (Lab Vision Corporation, Fremont, CA) i immunhistokjemi ved hjelp av et peroksidase deteksjonssystem (tabell 1). Etter farging lysbildene ble kontra med hematoksylin og permanent montert med Depex. Tilsvarende negative kontrollglass ble behandlet ved å erstatte det primære antistoff med ikke-reaktivt antistoff. Lysbilder fra menneskelige og hjørnetann brystsvulster med tidligere demonstrert reaktivitet til de primære antistoff og vev internkontroll ble brukt som positive kontroller.
Den primære canine brysttumor, cellelinjen og xenotransplanted svulster ble ansett som positivt for AE1 /AE3, CK-14, p63, vimentin, aktin, E-Cad og COX-2 når mer enn 10% av de neoplastiske cellene var positive [21]. Foruten dette, ble IPC-366 fenotype markører scoret i pellets deler av en dataassistert bilde analysator (bilde J), telle opp til 1000 celler. For HER-2 evaluering, 3+ positiv score følge de anbefalte retningslinjene for ASCO (American Society of Cancer Oncology, Her-2 3+) ble vurdert. Ki-67 proliferasjon indeks (PI) ble bestemt ved telling Ki-67 positive og negative kjerner i 1000 neoplastiske celler. Hver immunfarget kjernen ble ansett positiv uavhengig av intensiteten. PI, eller andel positive neoplastiske celler i hver prøve, ble beregnet [22].
Elektronmikros
IPC-366 celler ble høstet og festes med 2,5% glutaraldehyd (Panreac, Barcelona, Spania) og 4% paraformaldehyd (Panreac) løsning. Deretter ble cellene inkubert med 0,1 M cacodylat buffer ved 4 ° C over natten. De fikserte celler ble behandlet med 2% osmiumtetroksid (Panreac) og 3% ferrocyanid (Panreac) oppløsning (fortynnet i PBS) i 1 time. De ble deretter vasket i destillert vann og dehydrert i acetones med økende prosentandel (30, 50, 70, 80 og 100%). Prøvene ble gradvis infiltrert i en Müllenhauer blanding harpiks (Lowicryl harpiks, Sigma Aldrich), og størknet ved 60 8 ° C i 24 timer. De innebygde celler ble seksjonert ved National Elektronmikros senter (Madrid). Bilder ble oppnådd ved anvendelse av et JEOL JEM 3000F transmisjonselektronmikroskop.
cytogenetisk analyser
Kromosomavvik forberedelse for avvik Kromosom (AC) og G banding, ble oppnådd fra korttidscellekultur med Dulbeccos modifiserte Eagle Medium , DMEM-F12 (Lonza, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Atlanta Biologicals, USA), 1% penicillin-streptomycin-løsning og 1% L-glutamin (Gibco- liv Technology, USA). Cellesuspensjonen ble plassert i 75 cm
2 kulturflasker (Corning, USA) og ble holdt i en fuktet atmosfære av 5% karbondioksyd ved 37 ° C i 54h. Colcemid (Gibco- Liv Thecnology, USA) ble tilsatt i 2 timer før cellesuspensjonen høstet. Fremstillingen fulgte fremgangsmåter for hypoton behandling (KCL) (Sigma Aldrich, USA) og fiksering med 3: 1 metanol: iseddik (Sigma Aldrich, USA). Lysbilder fikk lov til alder før farging med Giemsa og G banding [23]. Resultatene ble behandlet med Applied Spectral Imaging, versjon 6.0 for gjennomgangen av meta og karyotypering.
Resultater
Mikroskopisk morfologi av IPC-366 og vekstanalyse
IPC- 366 celler festet til kultur flaks presenterte epitel-lignende morfologi og egenskaper (fig. 2A). Histologisk observasjon av IPC-366 celler i utstryk og H E farget parafinsnitt fra pellets avdekket store eller svært store runde celler (gjennomsnittlig diameter = 18.01μm, minimum = 7.35μm-maksimum 583.33μm). Cytoplasms var litt basophilic og ofte inneholdt basofile aggregater. Kjernen var veldig store (minimum = 5,25 mikrometer-maks = 13,38 nm) med tydelig store og mange nucleoli (minimum = 3,74 mikrometer-maks = og 8,24 mikrometer). Anisocytosis og anisokaryosis ble merket. Ofte IPC-366 celler viste flere coalescent cytoplasmatiske klare vakuoler og langstrakt eksentrisk kjerne. Enkelte store celler presentert morfologiske trekk av endotelceller: en langstrakt kant av omkranset cytoplasma inneholdende langstrakte eksentriske kjerner (endothelial-lignende celler, ELCs, som tyder på vaskulær etterligning) (figurene 2B, 3A og 3B.). Meget maligne multinucleated celler ble ofte sett (8,72% av flerkjernede ce4lls i en 20X mikroskopisk felt).
A) IPC-366 celler i kultur på invertert mikroskopi (40X). B) IPC-366 pellet; parafin delen, H E (40X). Meget ondartede kreftceller med epitelial morfologi; markert anisocytosis og anisokaryosis og tydelig nucleoli. Endotelial-lignende celle (ELC) viser cytoplasma klar plass (pil). IPC-366 ultrastrukturelle egenskaper ble undersøkt ved elektronmikroskopi. Cellene hadde rikelig cytoplasma anslag, mange organeller og protein sekretoriske produkter. Ved elektronmikroskopi, klare cytoplasmatiske vakuoler sett av optisk mikroskopi, resulterte tomme plasser omgitt av cytoplasmatiske membraner som tidvis sammen for å danne et innvendig hulrom (ELCs, vaskulær mimikk). (Fig. 3C-H)
A og B) Semithin seksjoner farget med toluidin blå (40X).; noen endotel-lignende celler observeres (piler). C til H) Ultraestructure i supertynne seksjoner. C) Celler med store kjerner og tydelig nucleoli. Mitose (pil). D) Enkelt celle med langstrakt kjerne, veldig tydelig kjerne og en rekke organeller, vakuoler og proteinutskillelse. E) Tumor utartet celle med krympet kjernen og rikelig proteinutskillelse. F) Cytoplasma av en tumorcelle som inneholder en rekke organeller (mitokondrier, endoplasmatiske retikulum) og en sekretorisk vacuole. G) Tumor celle med tre cytoplasmatiske tomrommene (stjernetegn) omfattes av cytoplasmamembranen; progresjon til et cytoplasmatisk «lumen» karakteristisk for endoteliale-lignende celler. Tydelig nucleolus. H) binucleate svulst celle med en cytoplasma sentral tomrom ( «lumen», asterisk) (ELC) likner en kapillær fartøy (vaskulær mimikk). Fig. E og G viser ulike felt fra samme rutenettet. Ved 25
th passasje, ble cellene kryogen lagring (-180 ° C). Re-kultivert tinte celler presenteres tilsvarende vekst og morfologiske egenskaper med en levedyktigheten til 95-99%. Den doble tiden av IPC-366 celler ved 30
th passasjen var omtrent 24 timer og cellene nådde et platå på dag 6 (Fig. 4).
tumorigenitet
Støpt IPC-366 celler i ventrale siden av Balb /SCID mus stammer svulster etter 2 uker med vaksinasjon (100% av inokulert mus, n = 10, lengde: 0,6 og 0,9 cm
3, bredde: 0,2 og 0,4 cm
3). To uker etter observasjon av xenotransplanted svulster deres størrelse var opp til 1,5 cm
3 og musene ble avlivet (lengde: mellom 1,3 og 1,7 cm
3, og bredde: mellom 0,8 og 1,2) (Fig. 5A) . Histologisk undersøkelse viste en kraftig infiltrerende, dårlig avgrenset, ikke-innkapslet tett celle neoplastisk vekst, som strekker seg til dermis og tverrstripet muskel. Neoplastiske celler arrangert i faste masser med snaut stromal og hadde lignende morfologi og malignitet som er beskrevet for IPC- · 66. Mitotisk indeks var svært høy og atypiske mitoser ble ofte observert. (Fig. 5B-C). Tilstedeværelsen av embolier på dermis kapillærer (fig. 5D) bekreftet histologisk karakteristisk for inflammatorisk mammary carcinoma. Tilstedeværelsen av vaskulogen etterligning (svært maligne tumorceller som ligner endotelceller og omgivende vaskulære rom (vaskulær etterligning) (fig. 5E), ble en hyppig bivirkning.
A) IPC-366 muse xenotransplantater på fire uker (pil ). B til E: svulst parafinsnitt H E. B) Solid tumor infiltrerer dermis (10x). C) Neoplastisk embolus i en overfladisk dermal lymfekar (pil) og fast tumor; markert ødem i dermis (4X). D) Sterkt ondartede kreftceller med markert anisocytosis og anisokaryosis; tydelig nucleoli (40X) .E) mikrovaskulære kanaler stilt opp ved neoplastiske celler (vaskulær mimikk, piler) (20X).
Immunhistokjemisk karakterisering av IPC-366 fenotype
Primær canine betennelses mammary karsinom og IPC-366 celler presenteres lignende immunologiske reaksjon til immunfenotypen markører som brukes. De var positive til en generell epitel cellemarkør (pancytokeratin, AE1 /AE3), og en basal-cellemarkør (CK14), med en 95,11% og 92,58% av positive celler i pelleten, henholdsvis (fig. 6A-B). Alle prøvene hadde også en positiv reaksjon på vimentin, viser IPC-366 en 81,14% av positive celler i pellets. (Fig. 6C). Korgcellemarkører p63 og aktin var negative (Fig. 6D-E), samt hormonelle reseptorer (ER, PR), og HER-2. (Fig. 6F-H). Mer enn 90% av IPC-366 overexpressed E-Cad (fig. 6I) og COX-2 (fig. 6J-K). COX-2-immunomerking var meget sterk i 10% av cellene. Alle prøvene hadde en høy spredning hastighet målt med Ki-67. Gjennomsnittlig Ki-67 spredning indeks av IPC-366 i pellets var 87,15% (Fig 6L.)
A) Pancytokeratin (AE1 /AE3) (10X).; intens immunolabeling og mange positive celler. B) CK14; intens immunolabeling og mange positive celler (10X). C) vimentin; moderat immunolabeling og mange positive celler (10X). D) p63; negativ (20X). E) α-glatt muskulatur aktin, negative celler (10x). F) Østrogen reseptor; negative celler (20X). G) Progesteron reseptor; negative celler (20X). H) HER-2; negative celler (20X). I) E-cadherin; intens membran immunolabeling i mange celler (20X). J) COX-2; De fleste cellene er moderat positiv; noen celler er intenst positive (10X). K) COX-2; noen celler sterkt positiv viser detaljer av malignitet (binucleated celle, pil) (40X). L) markør Ki-67 spredning; mange kjerner er positive (10X).
Cytogenetisk analyserer
Analysen ble gjort etter to cellesykluser, Cellene ble delt for kromosomavvik (AC) test og Karyotype. Fire hundre celler ble undersøkt, og 69% av cellene viste normal karyotype (2n = 78). På den annen side, undersøkt meta detektert i det minste en eller flere av abnormaliteter i 31% av cellene (tabell 2). Autosomer kromosomer har lignende morfologi, antallet og alle av dem er Acrocentric, og kromosom X-metasenter. 2% av de observerte cellene har tall aberrasjon som involverer kromosomer X, 12 og 17 ved hjelp av ideogrammet for G banding analysen i Dog [24, 25]. AC test viser at 30% av cellen sett har pauser:. 15% kromatisk, 8% chromosomic avvik og 6% hull
Diskusjoner
IMC og IBC er en undertype av aggressiv mammary kreft som påvirker kvinnelige hunder og mennesker, henholdsvis [1, 2, 26].
In vitro studier ved bruk av etablerte
kreftcellelinjer gir kunnskap om utviklingen og veksten av brystkreft generelt og IBC spesielt [11, 12]. Det er få modeller tilgjengelig for studiet av biologi IBC [10, 12, 15]. De fleste studier er utført ved hjelp av cellelinjer som SUM190 og SUM149. SUM149 er en trippel negativ cellelinje mens SUM190 er ER /PR negativ og HER-2 positive. Andre mindre studert IBC cellelinjer er: MDA-IBC3, KPL4 og WIBC-9 (alt ER /PR negativ og HER-2 positiv). I det siste året har det blitt beskrevet og karakterisert den nye FC-IBC02 cellelinje [15]. Canine IMC deler mange kliniske, biologiske og patologiske egenskaper med sykdom hos mennesker, og derfor har det vært foreslått som en god spontan dyremodell for å studere den humane sykdommen [2]. Likevel, til det beste av vår kunnskap, er IPC-366 den første canine IMC cellelinje etablert.
IPC-366 cellelinje reproduseres histologiske trekk ved hjørnetann primærtumor. Det er en veldig aggressiv, svært ondartet cellelinje som inokulert til Balb /SCID mus kan stamme svulster som reproduserer de histologiske trekk ved den primære canine IMC: en veldig infiltrerende svulst komponert av anaplastiske celler med lymfatisk invasjon av den overfladiske dermal lymfekjertlene, blir dette Sistnevnte egenskap den histologiske kjennetegn for både IBC og IMC histologiske diagnoser [2, 5, 26]. IPC-366 også bevart den opprinnelige canine melke IMC immunfenotype. Ifølge immunhistokjemiske resultater, er IPC-366 positive for panCK, CK14 og vimentin, og negativ for aktin, p63, ER, PR, HER-2, noe som indikerer at denne cellelinjen er en basal epiteliale cellelinje.
Multimodal behandling for pasienter med IBC omfatter kjemoterapi, etterfulgt av aggressiv strålebehandling og kirurgi. Som i andre ikke-IBC brystkreft, er anti-HER-2 eller anti-hormonell målrettet terapi anvendes i positive pasienter til disse molekylene [4]. Til tross for dette, er overlevelse av pasienter med IBC meget kort [4]. Survival er enda kortere i trippel negative IBC tilfeller (TN IBC, negative svulster til ER, PR og HER-2) som er spesielt motstandsdyktig mot terapi [27].
Triple negative brystkreft (TNBC) står for ca 10-15% av brystkrefttilfeller og har en dårligere prognose enn positive hormon reseptor pasienter [28-30]. Denne type brystkreft også et resultat karakteristisk for aggressivitet, invasivitet, tidlig metastaser og ikke svarer til terapeutiske mål [28], og behandles stort sett med kjemoterapi [30].
In vitro undersøkelser på TN-IBC er gjennomført hovedsakelig på trippel negative cellelinje SUM149. Denne cellelinje har blitt brukt for å identifisere genetiske faktorer av IBC fenotype [10]. Immunhistokjemiske Resultatene viste at IPC-366 manglet ER, PR og HER-2 uttrykk, blir en annen roman trippel negativ cellelinje som kan brukes til forskning på nye terapeutiske mål.
Den cellelinje IPC-366 er presentert som en basal epitel cellelinje med mesenchymale egenskaper: positiv immunoexpression til pancytokeratins (AE1 /AE3) (generell epitelcelledifferensiering markør), cytokeratin 14 (for basal epitelceller) og vimentin (generell mesenchymale markør). Samtidig uttrykk for cytokeratins og vimentin har blitt beskrevet i brystsvulster knyttet til malignitet [31, 32]. Vimentin uttrykket er også forbundet med en økning av malignitet av cellene i kultur [31]. Således immunoexpression profil avslørte at IPC-366 inneholdt i en basal-lignende subtype cellelinje med epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [33]. Den basale lignende undertypen er karakterisert ved en negativ ekspresjon av ER, PR og HER2 avsluttet med en CK14 og vimentin positiv [28]. SUM149, et veletablert IBC cellelinje, er også av basal som subtype [12]. Det faktum at canine IPC-366 cellelinje aksjer fenotypiske egenskaper med den menneskelige SUM149 cellelinje vil tillate komparative pre-kliniske studier i en fremtid. Negativ immunoexpresion til korgcellemarkører p63 og aktin indikerer at IPC-366 er ikke fra korg opprinnelse. I kontrast med human brystcancer, har hjørnetann mammary kreft hyppige korg proliferations fører til kompliserte og blandede tumorer [20]. Fraværet av en korg celle avstamning i IPC-366 vil ytterligere lette riktig komparative studier. Disse resultatene viste epitelisk opprinnelse IPC-366 og dens anskaffelse av mesenchymale karakteristika, så vel som fravær av korgcellene i denne cellelinje. Dermed IPC-366 celler er et eksempel på epitelial-mesenchymale overgang. EMT er en prosess involvert i tumorprogresjon ledende epitelceller blir til mesenchymale celler [34, 35]. Kjøpet av mesenchymale fenotype involvert tapet i epiteliale markører uttrykk samt få cellemotilitet og tumorinvasjon økt [36]. IPC-366 overexpressed COX-2 i 90% av cellene. Nylig har overekspresjon av COX-2 vært knyttet til EMT og invasivitet i brystkreftcellelinjer [37].
E-cadherin overekspresjon i IPC-366 har også demonstrert. E-cadherin er en celle-celle adhesjon protein i epitelvev kodet av tumorsuppressorgen CDH1. Det er kjent at mutasjoner i CDH1 øket proliferasjon og tumorinvasjon og metastase [38-40]. Således spiller det tap av funksjon av E-cadherin en meget viktig rolle i EMT og tumor overlevelse [40, 41]. Det er kjent at i IBC E-cadherin er overexpressed og lokalisert rundt svulsten cellemembranen, som står for dannelsen av lymphovascular embolus [42, 43].
IPC-366 er også preget av en høy spredning målt ved en vekstanalyse og en Ki-67 indeks (87,15%), som sørger for in vitro-studier. Ki-67 uttrykket har vært assosiert med dårlig prognose i maligne svulster på melkekjertler både hos kvinner og hunder [22, 44]. IPC-366 hadde høyere spredning indeks enn den opprinnelige svulsten, noe som tyder på en økning på proliferativ kapasitet, sannsynligvis ved valg av de mest ondartede celler. Den cytogenetisk analyse viser tilstedeværelse av strukturelle avvik, numeriske og nøytrale rearrangementer, viser en kromosomal ustabilitet. Disse dataene kan være korrelert med resultatene hos pasienter med inflammatorisk brystkreft og bruk av mer sensitive og spesifikke metoder som SKY, CGH Southern blot analyser og studier av uttrykk mønster med cDNA microarray sjetonger ville øke kunnskapen om genetiske avvik og bevart segmenter hvem som kan åpne vinduet for å funnet genetiske markører. Histologiske trekk ved malignitet i primær canine brysttumor og cellelinjen var lik med markert anisokaryosis og anisocytosis. Den typiske morfologi av endoteliale-lignende celler, som har vært knyttet til den vaskulær Ligningen (VM) fenomen [7, 8] ble observert på samme måte i den primære svulsten og den avledede cellelinje. Tilstedeværelsen av ELCs bør betraktes som en interessant første resultat som fortjener mer spesifikk forskning. I de utledede mus-svulster, foruten observasjon av ELCs, var det mulig å finne store kanaler med VM. Jo høyere andel av høyt ondartede multinucleated celler som finnes i IPC-366 og i det transplanterte svulst i mus kan representere også tidlige stadiene av VM i svært udifferensierte ELCs, men videre studier er nødvendig for å bekrefte denne aksept. Dette fenomenet er definert som vaskulær Ligningen ble først beskrevet i human melanoma og [45] består i generering av vaskulære kanaler av maligne tumorceller som erverver endotel-egenskaper og gir de blodtilførsel som kreves for tumorvekst og metastase. Den generasjonen av funksjonelle vaskulære kanaler ved svulsten er en markør for malignitet tumor celle fenotype [45, 46]. Vaskulær mimikk ikke vises i alle typer kreft, men det forekommer ofte i IBC [47] og IMC [7]. Nylig ble det også identifisert i xenografter fra IMC [48].
Nitti prosent av IPC-366 celler var positive for COX-2. Noen celler, inkludert ELCs, var intenst positive for COX-2. COX-2 har en rolle i den angiogene og invasive fenotype av IBC [49], og det har vært knyttet til lymphangiogenic pathway stimulering i IMC [8]. Forholdet av COX-2 med tumor ekstravasasjon, tumorcelleoverlevelse og fjernmetastaser gjenopptak er blitt beskrevet [50]. COX-2 er blitt angitt å være en markør for ELCs involvert i VM [7, 8, 51]. Selv om flere studier er nødvendig for å karakterisere de angiogene egenskapene til IPC-366, kan denne cellelinjen representerer en meget interessant modell for studiet av VM og andre angiogene egenskaper av IMC.
En rolle for COX-2 som en stamcelle markør er blitt postulert nylig [52]. Stamcelleegenskaper av IPC-366, som undersøkes, er ikke formålet med den foreliggende studien, men den høye andelen av COX-2-positive celler og tilstedeværelsen av mange ELCs synes å indikere at frekvensen av stamceller kan være høy. Fullfør fremtidige studier på stamcelle-fenotypen blir dilucidate dette aspekt av IPC-366-cellelinjen.
Fast tumorgenisitet er en annen meget viktig egenskap ved IPC-366. Denne cellelinje er i stand til å reprodusere tumorer
in vivo
meget hurtig, uten å miste sine opprinnelige egenskaper, noe som tillater å studere neoplastisk vekst i et biologisk miljø dyr. Selv om det er en mye verdsatt egenskap, ikke alle de etablerte cellelinjer er i stand til å reprodusere svulster
in vivo
. MCF7 ikke vokser i mus, selv om andre tumorigen IBC cellelinjer så som SUM149 eller SUM190 frembringe svulster hos SCID-muse-xenotransplantater etter 6-8 uker etter injeksjon av celler i brystfettpute [53]. Xenotransplantater fra IPC-366 i Balb /SCID-mus ble i 3 uker med en frekvens på 100%, som viser at denne cellelinjen hadde en hurtigere vekst
in vivo
. IBC og IMC har en sterk tendens til å metastasere, og invadere lymfekar [1, 5, 42]. IPC-366 transplantater på mus viste spontane metastaser i lunge og lymfeknuter med en frekvens på 100% (alle injisert dyr lider metastaser). Derfor IPC-366 kan anses som en god modell for studiet av metastatiske mekanismer
in vitro Hotell og
in vivo
. Det er ingen IBC eller brystkreftcellelinjer med denne høye kapasiteten metastaser i de tilsvarende xenotransplanted mus;
