Abstract
Bakgrunn
Det er vist at selen-bindende protein 1 (SBP1) er betydelig nedregulert i ulike kreft hos mennesker. Regulering og funksjon er ennå ikke klarlagt.
Metodikk og hovedfunnene
Vi viser at SBP1 promoteren hypermethylated i tykktarm kreft vev og menneskelige tykktarmskreftceller. Behandling med 5′-aza-2′-deoksycytidin fører til demetylering av SBP1 promoteren og til en økning av SBP1 promoteraktivitet, redder SBP1 mRNA og protein ekspresjon i humane tarmkreftceller. I tillegg overekspresjon av SBP1 sensitizes tykktarmskreftceller til H
2o
2-indusert apoptose, hemmer kreft celle migrasjon in vitro og hemmer tumorvekst i nakne mus.
Konklusjon og betydning
Disse dataene viser at SBP1 har tumorsupressorproteinene funksjoner som er hemmet i tykk- og endetarmskreft gjennom epigenetisk lyddemping
Citation. Pohl NM, Tong C, Fang W, Bi X, Li T, Yang W (2009) Transkripsjonell regulering og biologiske funksjoner av selen-Binding Protein 1 i Colorectal Cancer in vitro og i naken mus xenografter. PLoS ONE 4 (11): e7774. doi: 10,1371 /journal.pone.0007774
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 21 juli 2009; Godkjent: 16 oktober 2009; Publisert: 16.11.2009
Copyright: © 2009 Pohl et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Cancer Institute stipend (CA112081) og American Institute for Cancer Research stipend (05A121). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
selen-bindende protein 1 (SBP1) er et 56-kDa-protein som uttrykkes i en rekke celletyper, inkludert hjerte, lever, nyre, lunge og tarm. Humant SBP1 ble først klonet i 1997 [1], og har blitt foreslått å formidle den intracellulære transport av selen [2]. SBP1 har også vært foreslått å tjene som en markør i colonic celledifferensiering og nylig har SBP1 blitt vist å være et mål av den hypoksi-induserbar faktor-1 alfa (HIF1α) [3] og til direkte kontakt med von Hippel-Lindau-proteinet (pVHL) som kan spille en rolle i nedbrytning proteasomal banen i en selenavhengig måte [4]. Det er vist SBP1 til å bli redusert i forskjellige epiteliale kreftformer, inkludert prostata [5], mage [6], eggstokker [7], lunger [8] og kolorektal kreft [9], [10]. Videre ble lave nivåer av SBP1 i kolorektal cancer assosiert med dårlig prognose [9], [10]. Lignende resultater har blitt observert i lunge adenokarsinomer [8] og pleural mesotheliomas [11]. Basert på disse studier er det blitt foreslått at SBP1 kan spille en viktig rolle i regulering av kreftvekst og progresjon. Imidlertid er rollen til SBP1 i disse banene ikke er klarlagt.
epigenetisk forandringer årsak genet Slå, noe som fører til tap av genekspresjon og funksjon. To vanlige mekanismer er observert: histone modifikasjon og DNA metylering. Sistnevnte skjer på cytosinrester i cytosin-guanin (CpG) sekvenser. Metylering av CpG øyer i promoter er ofte en tidlig hendelse i tumor progresjon og er en felles mekanisme av genet Slå i kreft, forekommer hos mer enn 60% av tumordempere [12] -. [14]
SBP1 har blitt identifisert til å ha 2 CpG øyer i sin 5′-utranslaterte område, hvorav den ene er nær nok til å ha en innvirkning på SBP1 arrangøren regulering (-402 til -613). Det er derfor mulig at den SBP1 promoter, i tumorer med lave nivåer av SBP1, kan være metylert. Ja, våre data indikerer at SBP1 promoteren hypermethylated i menneskelige tykktarm kreft vev og i menneskelig tykktarmskreft cellelinje HCT116, men en generell demethylating middel 5′-Aza-2′-Deoxycytidine (eller 5′-aza-decitabine, DAC) gjenoppretter SBP1 mRNA og protein uttrykk ved demethylating den SBP1 promoter-regionen og øke SBP1 promoter aktivitet. Vi gir dessuten den første bevis for å vise at SBP1 har anti-kreft funksjoner – overekspresjon av SBP1 i HCT116-celler induserer H
2o
2 -mediert apoptose, hemmer cellemigrasjon
in vitro Hotell og hemmer tumor veksten i nakne mus.
Materialer og metoder
Cell Culture, human Colon Cancer Vev og reagenser
Menneskelig tykktarmskreft cellelinje HCT116 var dyrket i McCoys 5A media supplert med 10 % FBS, 1% anitbiotic-antimyocytic (Gibco) og holdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Menneskelig tykktarmskreft cellelinjer LS174T, ble Caco2, HT29 og SW480 holdt i Minimal Essential Medium (MEM) og holdes under de samme vilkår som HCT116-celler. Menneske tykktarm kreft vev og matchet normalt vev har blitt brukt av vårt laboratorium nylig [10]. For H
2o
2 behandling, celler på 80% samløpet ble behandlet med 0,3 mm H
2o
2 for 24 timer. For demetylering undersøkelser, ble celler behandlet med 10 og 30 uM av 5′-aza-2′-Deoxycytidine (DAC) for 72 eller 96 h (Sigma, St. Louis, MO).
Plasmider Anlegg
Menneske SBP1 cDNA ble forsterket og subklonet inn pIRES2 vektorer (Clontech, Mountain View, California) (pIRES2-SBP1) med Xhol og BamHI restriksjonsenzymseter. De følgende primere ble anvendt: frem: 5′-ATCTCGAGCTATGGCTACGAAATGTGGGAAT-3 «og omvendt: 5′-ATGGATCCTCAAATCCAGATGTCAGAGCTAC-3». For å generere HA-SBP1 plasmid ble menneske SBP1 cDNA forsterkes og subklonet i HA-merket pcDNA3.1 vektor (PHA) (Invitrogen, Carlsbad, California) bruker Xbal og Xhol restriksjonsseter. De følgende primere ble anvendt: frem: 5′-ATCTCGAGATGGCTAC GAAATGTGGGAATT-3 «og omvendt: 5′-ATTCTAGATCAAATCCA GATGTCAGAGCTAC-3». For luciferase assays hele lengden av SBP1 promoter (-2572-1) (pGL4-SBP1) ble klonet inn i pGL4 vektor (Promega Corporation, Madison, WI) under anvendelse av Xhol og Hindlll restriksjonssetene. De følgende primere ble anvendt: sender 5′-ATCTCGAGCCCATACATACCA AGCAA -3 «og revers 5»-TCAAGCTTCGGGTTTGCTGTGCTGGTGTC-3. Nøyaktighet av alle plasmider ble bekreftet via sekvensering.
Transfeksjon
Transient transfeksjon av HCT116-celler med PHA-SBP1 eller PHA vektorkontroll ble utført via Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California). 24-48 timer etter transfeksjon ble cellene utsatt for ulike analyser. For stabil transfeksjon ble HCT116-celler transfektert med pIRES2-SBP1 eller pIRES2 (tom vektor) alene via Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California). Stabilt transfekterte celler ble valgt med G418.
Immunoblotting
For immunoblotting ble cellene samlet 72 timer etter behandling. Celler ble lysert ved bruk av 1xRIPA buffer (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Sigma, St. Louis, MO). Etter celle-lysering, 30 ug protein ble applisert på en 10% SDS-gel, etterfulgt av overføring til PVDF-membran. Monoklonalt antistoff mot SBP1 ble kjøpt fra MBL
International Corporation (Watertown, MA, 1:1000)., Antistoff mot β-actin ble kjøpt fra (Sigma, St. Louis, MO, 1:10000). Sekundær anti-mus antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, 1:3000). De påviste signalene ble visualisert ved en forbedret kjemiluminescensreaksjon system, som anbefalt av produsenten (ECL-Plus, Amersham, Piscataway, NJ).
Metylering Spesifikke PCR (MS-PCR)
HCT116-celler behandlet med eller uten DAC i 96 timer, etterfulgt av DNA-rensing (DNeasy, Qiagen, Valencia, CA). Renset DNA ble deretter omdannet ved hjelp av EZ-DNA bisulifide ombyggingssett fra Zymo forskning (Orange, CA), som konverterer cytosinrestene til uracil, men påvirker ikke 5-metylcytosin, og dermed tillater en å identifisere metylerte sekvenser i DNA ved hjelp av etterfølgende MS -PCR. For MS-PCR, metylering og unmethylation spesifikke primere (designet av metylering identifikasjon programvare) [15] komplementær til CpG island spenner -463 til -673 av 5 utranslaterte område ble brukt. PCR ble deretter utført ved anvendelse av like mengder av DNA og iTaq
TM DNA ploymerase (Bio-Rad, Hercules, CA) under de følgende betingelser: innledende polymerase aktivering ved 95 ° C i 5 minutter, 95 ° C i 45 sek, 53 ° C (metylert produkt) eller 50 ° C (unmethylated produkt) i 45 sekunder, etterfulgt av forlengelse ved 72 ° C i 45 minutter. Etter 35 sykluser ble reaksjonsblandingen videre inkubert ved 72 ° C i 10 minutter. Den totale PCR-produktet ble deretter kjørt på en 2% agarosegel. Nøyaktighet av produktet ble bestemt via sekvensering.
Luciferase Assay
HCT116-celler ble transfektert med en pGL4 tom vektor eller pGL4-SBP1 plasmid som inneholder hele lengden SBP1 promoter. Renilla ble co-transfektert som en intern kontroll. 24 timer etter transfeksjon, ble cellene behandlet med PBS eller 5′-aza-2′-Deoxycytidine i 72 timer. Den doble luciferaseaktivitet kit (Promega, Madison, WI) ble anvendt i kombinasjon med et luminometer for å måle luciferase-aktivitet av behandlede celler i henhold til produsentens protokoll.
proliferasjon, apoptose og migrasjon analyse
Celleformering formering~~POS=HEADCOMP ble analysert ved hjelp av MTS Fremgangsmåte som angitt i fremstilling protokoll (Promega, Madison, WI). For å detektere apoptose, ble stabilt transfekterte HCT116-SBP1 eller vektorkontrollcellene høstet og fiksert med 70% etanol, etterfulgt av propidiumjodidfarging. Cellene ble deretter tellet ved strømningscytometri (FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA). Cellemigrasjon ble oppdaget ved hjelp av en transwell plate (Corning, Lowell, MA) etterfulgt av DAPI farging.
xenografter
1 × 10
6 HCT116-celler som stabilt uttrykker pIRES2-SBP1 eller pIRES2 vektor ble injisert subkutant i flanken av NIH-III hårløse mus (
NIH-Lyst
bgFoxn1
nuBtk
xid
) (Charles River Laboratory, New York) (5 mus per gruppe). Dyrene ble opprettholdt i et patogen-fri barriere anlegget ved University of Illinois i Chicago Biological Resources Laboratory, og overvåkes nøye av dyr anlegget ansatte. Fire uker etter injeksjon, tumorer ble isolert og vekten (g) og volum (mm
3) av tumorer ble bestemt. Total RNA ble isolert fra svulsten, ble kvantitativt sanntids RT-PCR utført, som beskrevet i vår nylig rapport [10], for å validere SBP1 konstitutiv ekspresjon i xenotransplantater. Alle prosedyrer ble utført i henhold til Animal Care og bruk retningslinje og ble godkjent av University of Illinois i Chicago Animal Care komiteen.
Diskusjon
Resultater og SBP1 Arrangøren var sterkt denaturert i Menneskelig Colon Cancer vev
Vi har nylig rapportert at SBP1 protein og mRNA-ekspresjon ble dramatisk redusert i human kolorektal kreft [10], så vel som i andre typer kreft. For å belyse årsaken av genekspresjon reduksjon, isolert vi målrettet menneskelige tykktarmskreftceller og matchet normale colonic epitelceller fra kolorektal kreftpasienter med lavt tumor-SBP1 protein og mRNA uttrykk [10] for SBP1 arrangøren metylering analyse. Overraskende fant vi faktisk at den SBP1 promoteren var høyere metylert i disse tumorene sammenlignet med deres tilstøtende normal slimhinne (Fig. 1A). Selv om høyere prøvevolumer er nødvendig for å betegne disse resultatene Disse data viser tydelig at SBP1 promoter metylering kan være en av de mekanismene som er ansvarlige for SBP1 nedregulering i humane tykktarmkreftformer.
A, SBP1 promoter var sterkt metylert i human tykktarm cancervev. Genomisk DNA fra tilstøtende normal (N) og adenokarsinom (T) vev ble isolert, omdannet og forsterkes for human SBP1 promoter ved hjelp av MS-PCR. # Indikert ulike pasienter. Unmethylated (U) og metylert (M) bånd ble påvist ved DNA-separering på 2% agarosegeler med etidiumbromid. B, Western blotting-analyse viste ulike uttrykk for SBP1 i humane tykktarmskreft cellelinjer; HCT116-celler med stabil transfeksjon av SBP1 overekspresjon plasmid ble anvendt som positiv kontroll. C, SBP1 promoter ble hypermethylated i HCT116 cellene. Genomisk DNA fra LS174T ble HCT116, SW480, Caco-2 og HT-29 tykktarm kreft celler isolert, konvertert og forsterkes via MS-PCR for menneskelig SBP1 arrangøren fulgt av gel separasjon av total DNA på 2% agarosegeler (U, unmethylated DNA ; M, denaturert DNA). D, DAC reverseres SBP1 promoter metylering i HCT116 cellene. DNA fra HCT116-celler behandlet med 30 pM av DAC i 96 timer, ble isolert og separert på 2% agarosegeler etter konvertering og MS-PCR. E, Luciferase-analyse viste at DAC øket SBP1 promoter luciferaseaktivitet av HCT116-celler med transfeksjon av en vektor inneholdende den fulle lengde av promoteren SBP1 og med en behandling av 30 uM DAC eller PBS i 72 timer. pGL4 vektor og Renilla ble co-transfektert som kontroller (* p 0,01, sammenlignet med PBS). F, DAC gjen SBP1 protein ekspresjon i HCT116-celler med DAC behandling i 72 timer, analysert ved Western blotting. G. SBP1 mRNA ble restaurert av DAC i HCT116-celler (* p 0,01, sammenlignet med PBS). Hvert eksperiment ble utført minst 3 ganger.
SBP1 Arrangøren Ble Hypermethylated i Human Colon kreft celler
For å validere SBP1 promoter metylering og SBP1 genuttrykk, menneskelige tykktarmskreftcellelinjer ble ansatt. Først fant vi forskjellige SBP1 proteinnivåene i flere cellelinjer ble analysert ved Western-blotting (fig. 1B). Vi valgte opprinnelig to cellelinjer for metylering analyse: LST174T celler som har høyest nivå av SBP1 og HCT116-celler som har en undetectable SBP1 protein uttrykk. Som vist på figur 1C, SBP1 promoter var sterkt metylert i HCT116-celler, mens det var for det meste unmethylated i LS174T celler. Påfølgende sekvensering av skåret denaturert og unmethylated band bekreftet nøyaktigheten av metylering mønsteret sett i disse to cellelinjer og viste ingen åpenbare mutasjoner i promoter regionen SBP1. Vi undersøkte også SBP1 promoter metylering status i SW480, Caco-2 og HT-29-celler, som har lav, middels og høye ekspresjonsnivåer av SBP1 protein, henholdsvis (fig. 1B). I samsvar med SBP1 proteinekspresjon, den SBP1 promoteren var sterkt metylert i SW480 celler, moderat metylert i Caco-2 celler og metylert i mindre grad i HT-29-celler (fig. 1C). Vi behandlet neste HCT116-celler med den generelle demethylating midlet 5′-aza-2′-Deoxycytidine for å bestemme hvorvidt den hypermethylated SBP1 promoteren kan demetyleres. Vi har funnet at behandling av HCT116-celler med 30 pM av DAC i 96 timer sank SBP1 promoter metylering og øket SBP1 promoter unmethylation, sammenlignet med PBS-kontroll behandling (Fig. 1D). Dette tyder på at SBP1 arrangøren er regulert gjennom metylering av den proksimale CpG island og at arrangøren hypermethylation stiller SBP1 uttrykk i HCT116 humane tykktarm kreft celler.
SBP1 Arrangøren Demetyler Økt SBP1 Arrangøren aktivitet og Reddet SBP1 Expression
Våre data viser at SBP1 promoteren hypermethylated og at demethylating midlet DAC kan reversere dette tilfelle. Det er derfor viktig å belyse hvorvidt arrangøren demetylering kan deretter øke SBP1 promoter aktivitet og SBP1 mRNA og protein uttrykk. Først transfekterte vi HCT116-celler med en luciferase-plasmid inneholdende den fulle lengde SBP1 promoter region (pGL4-SBP1) og behandles cellene med 30 uM DAC i 72 timer for å teste om DAC behandling øker promoter-aktivitet, og fant at DAC faktisk økte SBP1 promoter aktivitet etter 3 ganger (fig. 1E). Konsekvent, HCT116-celler behandlet med ulike konsentrasjoner av DAC viste en økt SBP1 protein ekspresjon i en doseavhengig måte (fig. 1F). I tillegg DAC behandling økt SBP1 mRNA nivåer av 50 folder i 72 timer behandling og 89 folder for 96 t behandling i HCT116-celler (fig. 1G). Selv om andre mekanismer for regulering av SBP1 ikke kan utelukkes, disse eksperimentene tyder på at SBP1 uttrykk i menneskelige tykktarmskreftceller er forstummet delvis av sin promoter metylering og at SBP1 uttrykk kan bli reddet av demethylating arrangøren regionen.
SBP1 Hemmer Cell Proliferation, Øker apoptose og Hemmer cellevandring
SBP1 har vist seg å være involvert i intracellulær transport av selen [2] og for å tjene som en markør i colonic celledifferensiering [10]. har også vist seg SBP1 til å bli redusert i forskjellige humane kreftformer. Men dens funksjoner i kreft ennå ikke er definert. Derfor ønsket vi å identifisere de funksjoner SBP1 måtte ha i menneskelige tykktarmskreftceller. Ett kjennetegn på kreft er ukontrollert celledeling. For å teste om SBP1 kan påvirke cellevekst, ble HCT116-celler som overuttrykker SBP1 behandlet med ulike konsentrasjoner av H
2o
2 og celleproliferasjon ble analysert via en MTS analyse (Promega, Madison, WI). Selv om behandling av cellene med 0,2 mM H
2o
2 seg hemmet celleproliferasjon i HCT116-celler, kan det innses at SBP1 overekspresjon sensibilisert HCT116-celler i H
2o
2-indusert vekstinhibisjon ved nedre konsentrasjoner ( 0,2 mM), noe som indikerer at SBP1 kan spille en rolle i cellesyklusregulering (figur 2A.). FACS analyse viste at SBP1 overekspresjon ført til en økning av apoptotisk celledød (sub-G1 fraksjon) når cellene ble behandlet med H
2o
2 (Fig. 2B). Videre overekspresjon av SBP1 i HCT116 cellene hemmes human tykktarmskreft celle migrasjon (Fig. 2C). Disse forsøk antyder at SBP1 kan ha noen tumorundertrykkende funksjoner i humane tarmkreftceller.
A, HCT116-celler transfektert med HA-SBP1 hadde en økt sensitivitet for H2O2 ved MTS proliferasjonsanalyse sammenlignet med tom vektor (HA) . Cellene ble behandlet med H2O2 i 24 timer. B, HCT116-celler transfektert med HA-SBP1 øket H2O2-indusert apoptose ved strømningscytometri-analyse. Celler ble behandlet med 0,3 mM av H
2o
2 til 24 timer. Bokser indikere apoptotiske celler (sub-G1). C, SBP1 hemmet kreft celle migrasjon: celle migrasjon av SBP1 overekspresjon HCT116-celler og HA-kontrollceller ble vurdert via Transwell kamre. Migrerte celler ble detektert med DAPI farging.
SBP1 svekkede Colorectal Cancer Cell Veksten i NIH-III Nude Mice
For å teste om SBP1 har anti-tumor aktivitet
in vivo
utførte vi xenograft eksperimenter i NIH-III nakne mus ved bruk HCT116-celler som enten stabilt overuttrykker SBP1 (pIRES2-SBP1) eller en kontroll vektor (pIRES2). Fire uker etter kreftcelle-injeksjon, ble tumorer isolert og tumorvolum og vekt ble bestemt. SBP1 uttrykk i eksplanterte svulster avledet fra SBP1 overekspresjon HCT116-celler ble bekreftet via RT-PCR viser 607-dobling på mRNA nivå. I overensstemmelse med
in vitro
data, mus injisert med SBP1 overekspresjon HCT116-celler hadde en signifikant mindre tumorvolum (fig. 3A) og tumorvekt (Fig. 3B) enn mus injisert med kontrollcellene, hvilket indikerer at SBP1 har tumor undertrykkende funksjoner
in vivo
også.
NIH-III nakne mus ble injisert med HCT116-celler som stabilt uttrykker SBP1 (pIRES2-SBP1) eller vektor (pIRES2) kontroll. Fire uker etter injeksjon, ble tumorvolum (A) og tumor vekt (B) bestemt.
Tatt ovenfor, gir vi den første bevis for at SBP1 promoteren hypermethylated i human kolorektal kreft, og at demetylering via DAC øker SBP1 promoter-aktivitet, så vel som livredning mRNA og protein ekspresjon (fig. 1). Gene stanse er en vanlig mekanisme finnes i mange humane kreftformer for å hemme tumor suppressor uttrykk. Våre data viser at SBP1 arrangøren er svært denaturert i tumorvev av pasienter med kolorektal kreft, noe som indikerer at SBP1 uttrykk i tykktarmskreft er delvis styrt gjennom genet demping. Det er viktig å undersøke hvorvidt SBP1 genet Slå er en vanlig mekanisme for å redusere SBP1 ekspresjon i andre typer av kreft, hvor SBP1 har vist seg å bli nedregulert. Dessuten, på grunn av redusert ekspresjon av SBP1 i humane cancere, SBP1 er blitt foreslått for å ha tumor suppressive aktivitet. Vi tror at vi er de første til å gi bevis for at dette kan faktisk være sant, i form av at overekspresjon av SBP1 i HCT116 cellene undertrykte celleproliferasjon, økt apoptotisk celledød og nedsatt cellevandring
in vitro plakater (Fig . 2), og hemmet tumorvekst
in vivo plakater (fig. 3). Men de eksakte mekanismene av SBP1 regulering og anti-kreft handling er fortsatt ukjent og trenger videre etterforskning. Faktisk er det nå undersøkt i vårt laboratorium. Forstå regulering og mekanismer for SBP1 tumor suppressor funksjoner vil ha en stor innvirkning på å avsløre den molekylære mekanismen for kreftutvikling og i å utvikle mer effektive chemoprevention og kjemoterapi for menneske ondartede sykdommer.
