Abstract
I denne studien har vi gjennomført en meta-analyse på high-throughput genuttrykk data for å identifisere TNF
–
a-mediert gener involvert i lungekreft. Vi først undersøkt genuttrykk profiler av to uavhengige TNF-α /TNFR KO murine modeller. EGF-reseptoren signalveien var den øverste reaksjonsveien forbundet med gener mediert av TNF-α. Etter som samsvarer med TNF-a-mediert mus gener til deres menneskelige ortologer, sammenlignet vi uttrykk mønstre av TNF-a-mediert gener i normale og tumor tette vev oppnådd fra mennesker. Basert på TNF-alfa-mediert gener som ble feilregulert i lungesvulster, har vi utviklet en prognostisk gen signatur som effektivt spådd tilbakefall overlevelse i lungekreft i to validerings kohorter. Resampling tester antydet at prognostisk effekt av genet signaturen ikke var ved en tilfeldighet, og multivariat analyse antydet at dette genet signaturen var uavhengig av de tradisjonelle kliniske faktorer og forbedret identifikasjon av lungekreftpasienter har større risiko for tilbakefall.
Citation: Wang B, Song N, Yu T, Zhou L, Zhang H, Duan L, et al. (2014) Uttrykk for tumornekrosefaktor-alfa-mediert Genes Spår Tilbakefall overlevelse i lungekreft. PLoS ONE 9 (12): e115945. doi: 10,1371 /journal.pone.0115945
Redaktør: Renato Franco, Istituto dei Tumori Fondazione Pascale, Italia
mottatt: 24 juli 2014; Godkjent: 26 november 2014; Publisert: 30.12.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prosjektet 61271054 of Natural Science Foundation of China National og ble også støttet av prosjektet KYZ201320 av de grunnleggende forskning Midler til sentrale universiteter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Tong Yu og Miao Zhu, to av forfatterne av manuskriptet, er for tiden tilknyttet med Nanjing Decode Genomics Bioteknologi Corporation. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) er en pleiotropisk inflammatorisk cytokin involvert i systemisk betennelse som stimulerer akuttfasereaksjon. Dette cytokin påvirker mest menneskelige organer, og er involvert i en rekke biologiske prosesser, inkludert celle proliferasjon, differensiering, apoptose, lipidmetabolisme, og koagulasjon [1], [2], [3]. TNF-α fungerer også som en mediator ved forskjellige patologier, så som septisk sjokk, transplantasjon avvisning, multippel sklerose, diabetes, revmatoid artritt, traumer, malaria, meningitt, og adult respiratory distress syndrome [4].
rollen til TNF-α i humane kreftformer er mer komplisert [5], [6]. TNF-α har en dobbel rolle i tumorfremkallelse og progresjon [7]. TNF-α kan lette dannelsen og opprettholdelsen av antitumorimmunresponser gjennom aktivering av naturlige killer-celler og CD8 T-celler [7], [8]. TNF-α også hemmer tumor-indusert vaskularisering ved å skade den tumor-assosiert vaskulatur [9]. Videre kan TNF-α direkte påvirke kreftceller ved å øke lysosomale enzymer og indusere cytokrom c utgivelse fra mitokondrier og apoptose [10].
Selv om TNF-α har antitumor aktivitet, er det økende bevis som tyder på at endogen TNF-α virker som en svulst promoter. TNF-α har vært kjent for å bidra til kronisk inflammasjon og fremmer tumordannelse, vekst og metastase [7], [11]. Det har også blitt observert at TNF-α knockout (KO) mus var mer resistente overfor kjemisk karsinogenese av hudkreft [12], [13]. I tillegg mus mangelfull i TNF-reseptor type 1 (TNFR-1) og TNF-reseptor type 2 (TNFR-2) var resistente mot utvikling av hudkreft [14], og knockdown av TNF-α in ovarian cancer cellelinjer førte til redusert vekst og vaskulær tetthet [15]. I den senere tid Pitroda et al. undersøkt rollen til TNF-α-mediert stromal betennelse i tumorvekst. De fant at forstyrrelse av stromal TNF-α aliserte signifikant nedsatt vekst av svulster i TNF-α reseptor (TNFR) KO-mus sammenlignet med det i villtype (WT) mus [16]. Basert på denne eksperimentelle modellen av TNF-α-mediert inflammasjon og høy gjennomstrømming genuttrykk data, de også utviklet en prognostisk gen signatur som spådd total overlevelse i kreft hos mennesker [16].
Lungekreft er den hyppigst diagnosen kreft og er den ledende årsak til død kreft hos menn, bestående av 17% av den totale nye krefttilfeller og 23% av de totale kreftdødsfall [17]. I denne studien har vi gjennomført meta-analyse på high-throughput uttrykk microarray data for å identifisere TNF
–
a-forbundet gener som ble innblandet i lungekreft. Først identifiserte vi gener potensielt regulert av TNF-α og TNFR’er. Ved hjelp av to uavhengige microarray datasett, preget vi vanlige gener feilregulert i TNF-α KO og TNFR KO mus. Vi betraktet disse genene som TNF-alfa-assosiert gener. For det andre har vi utviklet en prognostisk gen signatur avledet fra TNF-alfa-assosierte gener, og vi matchet TNF-alfa-forbundet gener i mus til sine menneskelige ortologer. Vi deretter sammenlignet uttrykk for menneskelige TNF-alfa-forbundet gener i normale og tumorvev av to lungekreft kohorter. Sytten TNF-α-assosierte gener ble identifisert som vanligvis uttrykt forskjellig mellom de to gruppene; derfor disse genene komponert en multi-molekylære kreft utfallet prediktor. Dette molekylær signatur effektivt spådd tilbakefall overlevelse i lungekreft og var uavhengig av de vanlige kliniske og patologiske prognostiske faktorer.
Diskusjon
TNF-alfa-forbundet gener
Resultater og
Vi først undersøkte genene potensielt regulert av TNF-α og dets reseptorer. TNF-α binder to reseptorer, og TNFR1 TNFR2. TNFR1 uttrykkes i de fleste vev, mens TNFR2 finnes bare i celler i immunsystemet. To uavhengige microarray datasett som inneholder genuttrykk informasjon for både WT og TNF-α /TNFR KO mus ble samlet inn fra Gene Expression Omnibus (GEO) database [18]. Vi sammenlignet genuttrykksmønster av mage svulster i WT og TNF-α KO mus (GEO tiltredelse ID: GSE43145) og av melanomer av WT og TNFR KO-mus (GEO tiltredelse ID: GSE33253) [16]. På et 5% falske funnrate (FDR), 390 gener var vanlig oppregulert sammenlignet med WT mus i begge datasett (S1 Table). I motsetning til dette ble 305 gener funnet å være vanligvis ned-regulert, sammenlignet med WT-mus (S1 Table). Vi anses disse feilregulert genene TNF-α-medierte gener. Pathway analyse ved hjelp PANTHER databasen [19] viste at den øverste veien forbundet med disse feilregulert genene var «EGF reseptor signalveien» (
P
= 0,029 ved Fishers eksakte test) (S2 Table), noe som antyder en sterk sammenheng mellom TNF-α og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). EGFR er et medlem av ErbB-familien av reseptorer. Endring i EGFR-ekspresjon kan føre til kreft [20], inkludert lungekreft, kreft anal, og glioblastoma multiforme. TNF-α er en sentral regulator av flere inflammatoriske signalveier, og en viktig mål av TNF-α kan være signalveien nedstrøms for EGFR [21]. Faktisk har TNF-α vist å indusere EGFR transaktivering i en rekke celler [22], [23], [24].
å bestemme hvorvidt TNF-a-mediert gener avledet fra mus var relevante til kreft hos mennesker, matchet vi TNF-alfa-mediert mus gener til 651 forskjellige menneskelige ortologer. Deretter analyserte vi uttrykk mønstre i disse TNF-a-mediert humane gener i lungekreft. Vi utforsket forskjellen i genuttrykk mellom normale og tumorvev i to uavhengige lungekreftkullene fra Spania (ES [GEO tiltredelse ID: GSE18842]) [25] og Taiwan (TW [GEO tiltredelse ID: GSE19804]) [26]. En paret t-test ble anvendt for å identifisere de differensielt uttrykte gener mellom de normale og tumorvev (Fig. 1). I alt ble 232 TNF-α-medierte gener identifisert som ofte uttrykt forskjellig mellom de normale og tumorvev (justert
P
0,05 og fold change 1,25) i begge gruppene (S3 Table). Ett hundre og tjueni TNF-α-mediert gener ble oppregulert i tumorvev, mens 103 TNF-α-mediert gener ble nedregulert (S3 tabell). For å undersøke i hvilken funksjonelle kategorier disse genene faller, gjennomførte vi genet ontologi analyse ved bruk av GO databasen [27]. Vi fant ut at disse genene ble betydelig beriket av GO biologisk prosessbetingelser, slik som «makromolekyl katabolsk prosess», «tRNA aminoacylering», og «ubiquitin-avhengige protein katabolsk prosess» (S4 tabell).
Sammenkoblet normal og tumorvev fra lungekreftpasienter i ES og TW kullene ble inkludert i sammenligningen. Y-akse: log2-transformerte uttrykk verdier
En 17-gen signatur spår tilbakefall overlevelse i lungekreft
Vi antok at 232 forskjellig uttrykt TNF-α-mediert. gener kan forutsi tumorresultat i lungekreft. Univariate Cox regresjon mot tilbakefall overlevelse ble gjennomført over 232-genet satt i en trenings kohort fra Korea (KR [GEO tiltredelse ID: GSE8894]) [28]. Bare de gener med absolutte verdier for den Wald statistikken (forholdet mellom regresjon koeffisienten til dens standardfeil) som er større enn to ble beholdt. Totalt har vi identifisert 17 TNF-alfa-mediert gener assosiert med lungekreft gjentakelse overlevelse i opplæringen kohort. Vi utpekt de 17 TNF-alfa-mediert gener som 17-genet signatur (Fig. 1 og tabell 1).
Vi brukte et poengsystem for å tilordne hver pasient en gjentakelse poengsum som var en lineær kombinasjonen av ekspresjon av 17-genet signatur vektes med koeffisientene som oppnås fra trenings kohort (se metoder for detaljer) [16], [29], [30], [31]. Vekten til hvert gen er angitt i tabell 1. De 17-gen-positive pasienter ble definert som de som har en gjentakelse score høyere enn i gruppen medianen. Som forventet var det en betydelig redusert tilbakefall overlevelse for de 17-gen-positive pasienter i opplæringen kohort (fig. 2). Den 17-genet positive pasienter hadde en betydelig økt risiko for tilbakefall på 2,95 ganger i KR kohort (tabell 2).
gjentakelse poengsum av 17-genet signatur spår dårlig klinisk utfall i lungekreft. De svarte kurvene er for 17-gen-signatur-positive pasienter, mens de grå kurvene er for 17-gen-signatur-negative pasienter. Den 17-gen-signatur-positive pasienter ble definert som de som har et tilbakefall score høyere enn gruppen median poengsum.
P
-verdier ble beregnet ved bruk av log-rank tester for forskjeller i overlevelse. Det venstre panelet viser trening kohort (KR), mens de midtre og høyre panel viser validerings kohorter (JP og SE).
Vi neste undersøkt den prognostiske makt gjentakelse score som ble bestemt ved bruk av 17-genet signatur i uavhengige validerings kohorter. To valideringskullene fra Japan (JP [GEO tiltredelse ID: GSE31210]) [32] og Sverige (SE [GEO tiltredelse ID: GSE37745]) [33] ble samlet. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste en betydelig redusert tilbakefall overlevelse for de 17-gen-positive pasienter i validerings gruppene (
P
= 5,4 × 10
-5 for JP kohort og
P
= 0,011 for SE kohort av log-rank test) (fig. 2). Univariate Cox regresjon viste at 17-gen-positive pasienter hadde en betydelig økt risiko for tilbakefall på 2,67 ganger i JP kohort og 2,08 ganger i SE kohort (tabell 2). Disse funn indikerte at 17-genet signatur er prediktiv for gjentakelse overlevelse i lunge cancer.
Vi har også undersøkt den prognostiske kraft for hvert gen innenfor den 17-genet signatur i JP-kullet, som er den største kohort i denne studien. Pasientene ble delt i to grupper i henhold til ekspresjonsnivået til hvert gen, ved hjelp av median som en cutoff. Vi identifiserte tre gener,
HNRNPAB
,
PPIL1
, og
SRPK1
, som kan brukes til å forutsi tilbakefall overlevelse individuelt (justert
P
.. 0,05 ved log-rank test) (S1 figur)
Egentlig blant 17-genet sett,
ABCE1
,
CKS1B
,
HNRNPAB
,
PCDH7
,
PPIL1
, og
SRPK1
har allerede blitt rapportert å spille en viktig rolle i kreft patogenesen. For eksempel stanse
ABCE1
av små interfererende RNA kan hemme spredning og invasivitet av småcellet lungekreft cellelinjer [34].
CKS1B
-depleted brystkreft celler ikke bare utstillings bremset G (1) progresjon, men disse cellene også akkumuleres i G (2) -M grunn blokkert mitotisk oppføring [35].
HNRNPAB
ble funnet å være overuttrykt i høyt metastatiske celler og tumor vev fra pasienter med leverkreft med tilbakefall [36].
PCDH7
var oppregulert i beinmetastatisk brystkreft vev, og undertrykkelse av
PCDH7
hemmet brystkreft celleproliferasjon, migrasjon og invasjon in vitro [37].
PPIL1
ble observert å være ofte overuttrykt i tykktarmskreftceller, sammenlignet med noncancerous epitelceller i kolon mukosa [38]. Mer interessant, kanskje avvikende
SRPK1
uttrykk i begge retninger fremme kreft ved å forstyrre PHLPP-mediert defosforylering av Akt [39]. I denne studien har vi vist at selv om prognostisk effekt av 17-genet signatur er overlegen, de enkelte gener, for eksempel
HNRNPAB
,
PPIL1
, og
SRPK1,
kan brukes som individuelle biomarkører for å forutsi tilbakefall overlevelse.
omsampling test for den 17-genet signatur
Vi gjennomførte en resampling test for å fastslå om den prediktive kraften i 17- gen signatur var betydelig bedre enn for tilfeldige gensettene. Vi bygget 1.000 tilfeldig gen signaturer, som hver inneholder 17 gener som ble tilfeldig valgt fra det menneskelige genom. Gjentakelse score ble beregnet basert på randomiserte genet signaturer, og univariate Cox regresjon av overlevelse ble utført for hver resampled gen signatur. Sammenhengen mellom hver tilfeldig gen signatur og tilbakefall overlevelse ble målt ved hjelp av Wald statistikk. Vårt alternativ hypotese var at Wald statistikken verdien av 17-genet signatur bør være høyere enn den for de randomiserte genet signaturene hvis 17-genet signatur var mer forutsigbar enn den randomiserte signaturer. Fig. 3 indikerer at Wald statistikken av 17-genet signatur var betydelig høyere enn for de randomiserte gen signaturer (
P
= 0,045 for JP kohort og
P
= 0,009 for SE-kohorten ), noe som tyder på at sammenhengen mellom den 17-genet signatur og tilbakefall overlevelse er ikke tilfeldig.
de sorte rhombuses indikerer Wald statistikk av 17-genet signatur. De grå histogrammer viser fordelingen av Wald statistikk for 1000 omsamplede gen signaturer med identisk størrelse under nullhypotesen lende sammenheng mellom 17-genet signatur og tilbakefall overlevelse.
En tidligere utgitt studie av Venet et al. sammenlignet 47 prognostiske brystkreft underskrifter til signaturer av tilfeldige gener [40]. Det ble funnet at -60% av signaturene var ikke signifikant bedre resultat prediktorer enn randomiserte signaturer med identisk størrelse, og ~23% var verste prediktorer enn medianen tilfeldig signatur [40]. Derfor er det ikke mulig å konkludere med at en spesiell mekanisme er assosiert med human cancer fra det funn at et gen signatur for denne mekanismen forut kreft resultat, fordi de fleste randomiserte signaturer gjøre [40]; Men her, viser vi at vår 17-genet signatur vinner dette problemet.
Multivariatanalyse
Vi undersøkte resultatene av 17-genet signatur sammenlignet med kliniske faktorer assosiert med lungekreft utfall . For JP årsklasse, vi vurderte faktorer inkludert pasientens alder, kjønn, røyking historie, scene,
EGFR Twitter /
KRAS Twitter /
ALK
genet endring status, og Myc proteinnivå . I JP kohort, scene og
EGFR Twitter /
KRAS Twitter /
ALK
gen endring status kan individuelt forutsi tilbakefall overlevelse (S2 fig.). For SE årsklasse, tok vi alder, kjønn og stadium i betraktning. Men ingen av disse faktor i SE kohorten individuelt forutsi tilbakefall overlevelse. En multivariat Cox regresjon av overlevelse indikerte at 17-genet signaturstatus forble en betydelig kovariat i forhold til de kliniske faktorer i hvert validerings kohort (
P
= 3,4 x 10
-3 til JP kohort og
P
= 2,5 × 10
-2 for SE kohort) (tabell 3). I JP årsklasse, pasientens alder, stadium, og
EGFR Twitter /
KRAS Twitter /
ALK
endring status var også signifikante variabler. Men i SE årsklasse, 17-genet signatur status var den eneste signifikante covariant i den multivariate modellen (tabell 3). Disse resultatene tyder sterkt på at 17-genet signatur er stort sett uavhengig av de tradisjonelle kliniske faktorer og forbedrer identifisering av lungekreftpasienter har større risiko for tilbakefall.
17-genet signaturen var avledet fra en «hypotese-drevet» metoden i stedet for hele genomet screening. Tradisjonelt ble prognostiske kraften av enkeltgener innenfor det humane genom testet én etter én. Genene med best statistisk signifikans vil bli beholdt og brukt som kreft biomarkører. Men statistisk-avledet gen signaturer av hele genomet screening er ofte svært nøyaktige i oppdagelsen kullene fra de ble identifisert, men de fleste av dem har ikke blitt validert som nyttige kliniske verktøy [41], [42]. I denne studien vi først antatt at TNF-α er implisert i lungekreft. Da vi pre-identifiserte genene som er potensielt mediert av TNF-α /TNFR ved hjelp av TNF-a /TNFR KO mus. Multivariat analyse viser at dette «bottom-up» metode gir et gen satt med lovende prediktiv kraft, som legger prognostisk verdi til kliniske og patologiske funn i lungekreft.
Konklusjoner
Vi undersøkte genet ekspresjonsprofiler av to uavhengige TNF-α /TNFR KO murine modeller. EGFR-signalveien ble funnet å være den beste vei forbundet med gener mediert av TNF-α. Basert på TNF-alfa-mediert gener funnet i murine modeller, har vi utviklet en prognostisk gen signatur som effektivt spådd tilbakefall overlevelse i lungekreft i to validerings kohorter. Når du arbeider i fellesskap med kjente tradisjonelle kliniske faktorer, kan den 17-genet signatur forbedre prediksjon nøyaktighet for å identifisere pasienter med høyere risiko for tilbakefall.
Metoder
Mikromatrise databehandling
All microarray data analysert i denne studien ble hentet fra GEO databasen [18]. GC robust multichip gjennomsnitt (GCRMA) algoritme [43] ble brukt til å oppsummere uttrykket nivået av hver sonde satt for microarray data. Betydningen analyse av mikromatriser (SAM) algoritme [44] ble brukt til å identifisere de differensielt uttrykte gener mellom WT og TNF-a /TNFR KO-mus. En paret t-test ble anvendt for å detektere de differensielt uttrykte gener mellom de normale og tumor humane lungevevet.
P
-verdier ble justert ved hjelp av Benjamini-Hochberg prosedyre.
Risk scoring system
For trening kohort (KR), univariate Cox regresjon ble brukt for å evaluere sammenhengen mellom tilbakefall overlevelse og genuttrykk. En gjentakelse resultatet ble deretter beregnet for hver pasient ved hjelp av en lineær kombinasjon av gen-ekspresjon som ble vektet med Wald statistikken (forholdet mellom regresjon koeffisienten til dens standard feil), som vist nedenfor [16], [29], [30], [31]:
Her
S
er gjentakelse score på pasienten;
n
er antall gener;
Z
i
betegner Wald statistikk av genet
I
(oppført i tabell 1);
e
i
betegner uttrykket nivået av genet
i
; og
μ
i
og
τ
i
er gjennomsnitt og standardavvik på genuttrykket verdier for genet
i
tvers av alle prøvene. Pasientene ble deretter delt inn i positive og negative grupper, med medianen av tilbakefall poengsum som cutoff. En høyere tilbakefall poengsum innebar et dårlig resultat. Poengsystemet og tilhørende skalerings koeffisientene ble løst basert på trenings kohorter og deretter evalueres i validerings kohorter [16], [29], [30], [31].
Statistiske verktøy
Alle statistiske analyser ble utført ved R plattformen. Den «overlevelse» biblioteket ble brukt til å gjøre overlevelsesanalyse. Statistisk signifikans mellom to Kaplan-Meier-kurver ble bestemt ved log-rank test ved hjelp av «survdiff» -funksjonen. Både univariat og multivariat Cox regresjon ble utført av «coxph» -funksjonen.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig.
uttrykk for
HNRNPAB
,
PPIL1
, og
SRPK1
spår tilbakefall overlevelse individuelt. Pasientene i JP-kullet ble inndelt i to grupper i samsvar med ekspresjonsnivået av hvert gen, ved hjelp av median som en cutoff. De svarte kurvene er for pasientene genuttrykket høyere enn medianen, mens de grå kurvene er for de andre pasientene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s001 product: (PDF)
S2 Fig .
Stage og
EGFR Twitter /
KRAS Twitter /
ALK
genet endring status individuelt forutsi tilbakefall overlevelse i JP kohort. Det venstre panelet er for scenen. Den svarte kurven er for pasienter med stadium II, mens den grå kurven er for pasienter med stadium I. Høyre panel er for genet endring status. Den svarte kurven er for pasienter uten endring, mens den grå kurve er for pasienter med ombygging.
P
-verdier ble beregnet ved bruk av log-rank tester for forskjeller i overlevelse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s002 product: (PDF)
S1 Table. Bedrifter Den gener ofte forskjellig uttrykt mellom WT og TNF-α /TNFR KO mus
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s003 plakater (XLSX)
S2 Table. .
De 10 PANTHER stier knyttet til feilregulert gener i TNF-a /TNFR KO mus
doi: 10,1371 /journal.pone.0115945.s004 plakater (XLSX)
S3 Table. Bedrifter Den TNF-alfa-mediert gener som er forskjellig uttrykt mellom de normale og tumorvev
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s005 plakater (XLSX)
S4 Table. Bedrifter Den GO biologisk prosess vilkår knyttet til TNF-alfa-mediert gener som er feilregulert i tumorvev
doi:. 10,1371 /journal.pone.0115945.s006 plakater (XLSX)
