Abstract
Genistein har vist seg å undertrykke veksten av flere kreftformer gjennom modulering av ulike veier. Men effekten av genistein på regulering av onkogene mikroRNA-151 (MIR-151) har ikke blitt rapportert. I denne studien undersøkte vi om genistein kan endre uttrykket av onkogene MIR-151 og dets mål gener som er involvert i progresjon og metastasering av prostatakreft (PCA). Real-time RT-PCR viste at uttrykket av MIR-151 var høyere i PC3 og DU145 cellene sammenlignet med RWPE-1 celler. Behandling av PC3 og DU145 celler med 25 mikrometer genistein nedregulert ekspresjon av MIR-151 sammenlignet med kjøretøykontroll. Hemming av MIR-151 i PCA celler ved genistein betydelig hemmet celle migrasjon og invasjon.
In-silico
analyse viste at flere gener (CASZ1, IL1RAPL1, SOX17, N4BP1 og ARHGDIA) foreslått å ha kreft undertrykkende funksjon var målgener av MIR-151. Luciferaserapportørplasmid analyser indikerte at MIR-151 binder direkte til bestemte steder på 3’UTR av målgener. Kvantitativ real-time PCR-analyse viste at mRNA-ekspresjonsnivåene av de fem målgener i PC3 og DU145 ble markert forandret med MIR-151 etterligner og inhibitor. Kaplan-Meier-kurver og log-rank tester viste at høye uttrykk nivåer av MIR-151 hadde en negativ effekt på overlevelse. Denne studien tyder på at genistein mediert hemming av onkogene miRNAs kan være et viktig kosttilskudd terapeutisk strategi for behandling av PCa
Citation. Chiyomaru T, Yamamura S, Zaman MS, Majid S, Deng G, Shahryari V, et al. (2012) Genistein undertrykker Prostate Cancer Vekst gjennom Hemming av onkogene mikroRNA-151. PLoS ONE 7 (8): e43812. doi: 10,1371 /journal.pone.0043812
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 13. juni 2012; Akseptert: 26. juli 2012; Publisert: 23 august 2012
Copyright: © Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlige formål. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Nasjonalt Senter for Forskningsressurser av National Institutes of Health gjennom Grant Numbers R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 og VA Merit anmeldelse og VA Program prosjektet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en av de vanligste kreftformen blant menn og rangerer andre til lungekreft i kreftrelaterte dødsfall [1]. Etter androgen-deprivasjon terapi. PCa kan mest gjenta seg som androgen-uavhengig, metastatisk sykdom som fører til døden i løpet av flere år [2]. Foreløpig ingen effektive behandlinger er tilgjengelige for å kurere androgen-uavhengig PCa. Dermed er nye prognostiske markører og effektive behandlingsstrategier haster.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA på ca 22 nukleotider som regulerer genuttrykk gjennom translasjonsforskning undertrykkelse og mRNA cleavage [3]. Bio indikerer at mirnas regulere 60% av protein-kodende gener [4]. I dag har 1,527 menneskelige mirnas blitt registrert i miRBase database (https://microrna.sanger.ac.uk/). mirnas er involvert i en rekke biologiske prosesser, herunder metabolisme, utvikling og differensiering, og bidra til utvikling av forskjellige typer av kreft [5]. Mange menneskelige kreftformer har avvikende uttrykk for miRNAs, som kan fungere enten som tumor suppressors eller onkogener [6].
(A) Expression profil MIR-151 i PCA cellelinjer (LNCaP, DU145 og PC3) og normal prostata epitelceller (RWPE-1). Real-time PCR viste at uttrykket nivåer av MIR-151 var oppregulert i androgen-uavhengig PCA cellelinjer (DU145 og PC3). MIR-151 uttrykk ble normalisert til RNU48. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. (B) Expression nivåer av MIR-151 etter behandling med genistein (25 mm). MIR-151 ekspresjon ble funnet å bli redusert med 15-45% i genistein behandlede celler. *, P . 0,05
MIR-151 er koblet til en region av kromosom 8Q. Det har blitt funnet å være ofte forsterkes i en rekke kreftformer, inkludert blære, nyre, prostata, bryst, lunge, mage og endetarmskreft [7] – [13]. Vi har tidligere vist at kromosom gevinst på locus 8q24.3, hvor onkogene LY6K genet ligger på, kan ha en avgjørende rolle i blærekreft utvikling [7]. En papir viste at kopiantall gevinst på Mir-151-genet på 8q24.3 ved PCA ble korrelert med metastase [14].
Genistein (4 «, 5,7-Trihydroxyisoflavone), en stor isoflavone bestanddel av soyabønner og soyaprodukter, har vist seg å utvise sterk anticancer virkning på PCa [15], [16]. Epidemiologiske bevis tyder på at forekomsten og dødeligheten av PCa er betydelig lavere i Asia enn i USA [17]. Den midlere serumkonsentrasjon av genistein i asiatiske menn var høyere enn den for befolkningen i USA [18] og flere studier har vist at inntak av isoflavon var assosiert med en reduksjon i risiko PCa [19] – [22]. Genistein har flere molekylære mål inkludert reseptorer, enzymer og signalveier [15]. Genistein har også vist seg å undertrykke veksten av flere cancercellelinjer
in vitro
og
in vivo
, noe som reduserer ekspresjon av flere onkogene miRNAs. Til dags dato har effekten av genistein om regulering av MIR-151 ikke blitt rapportert. Derfor i denne studien undersøkte vi om genistein kan endre uttrykket av MIR-151 og dets mål gener som er involvert i progresjon og metastasering av PCa.
(A) knockdown av MIR-151A-5p hemmer cellemigrasjon betydelig. Etter transfeksjon (48 timer), ble et sår dannet ved skraping og såret ble målt etter 24 timer. Representative bilder av sårtilheling analyse er vist ved x200 forstørrelse. **, P 0,0001 (B) knockdown av MIR-151A-5p betydelig redusert celle invasjon. Representative bilder av invasjonen analysen er vist ved x200 forstørrelse. **, P . 0,0001
Resultater
MIR-151 er oppregulert ved PCA og Genistein Behandling Redusert MIR-151
For å bestemme relative uttrykk nivåer av MIR-151 i PCA celler, utførte vi TaqMan kvantitativ real-time PCR analyse ved hjelp av androgen-avhengige (LNCaP) og androgen-uavhengig (PC3, DU145) cellelinjer og sammenlignet disse med normal prostata epitelceller (RWPE-1). MIR-151 består av to modne miRNAs; MIR-151A-5p og MIR-151A-3p (miRBase). Vi observerte at Mir-151 uttrykk var markert oppregulert i androgen-uavhengig PCA cellelinjer i forhold til RWPE-1 celler (MIR-151A-5p, PC3 4,02 ganger, DU145 1,36 ganger) (MIR-151A-3p, PC3 5.14-fold, DU145 2,25 ganger) (fig 1A)
Genistein behandling signifikant nedregulert den relative uttrykket nivået av MIR-151 sammenlignet med kjøretøykontroll (MIR-151A-5p,.. PC3 15% reduksjon , DU145 14% reduksjon) (MIR-151A-3p, PC3 44% reduksjon, DU145 32% reduksjon) (figur 1B)
Effekt av MIR-151 knockdown på celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i.. PCA cellelinjer
for å undersøke de funksjonelle rollene til MIR-151, vi utførte tap-av-funksjon studier ved hjelp av anti-Mir miRNA inhibitor transfektert i PC3 og DU145 cellene. Ekspresjonen av MIR-151 ble markert undertrykket i anti-MIR miRNA inhibitor transfektanter (data ikke vist), og vi har observert lignende celleviabilitet i alle cellelinjer, noe som tyder på at knockdown MIR-151 ikke påvirke celleformering (data ikke vist). Sårheling analysen viste signifikant hemming av cellemigrasjon i anti-MIR miRNA-151A-5p transfekterte PCA cellelinjer sammenlignet med sine kolleger (Fig. 2A). Men ingen signifikant hemming ble observert med anti-MIR miRNA-151A-3p transfekterte PCA cellelinjer. Matrigel invasjonen analysen viste at antallet av invaderende celler ble signifikant redusert i anti-MIR miRNA-151A-5p transfektanter sammenlignet med de tilsvarende (fig. 2B). Derfor er det sannsynlig at MIR-151A-5p spiller videre viktig rolle i tumorcellemigrering og invasjon. For å evaluere samtidige effekter av MIR-151A-5p og MIR-151A-3p, tap-av-funksjon studier med miRNA inhibitor co-transfekterte PCA cellelinjer ble utført. Det var ingen ytterligere effekt på cellen levedyktighet av MIR-151A-5p og MIR-151A-3p kotransfeksjonen (data ikke vist).
PC-3 celler ble transient transfektert med Pre-MIR miRNA forløper eller Anti-MIR miRNA Inhibitor eller negativ kontroll, fulgt av transient transfeksjon med villtype 3’UTR rapportør plasmider eller muterte 3’UTR plasmider i 24 timer. 3’UTR reporter-aktivitet ble målt ved hjelp av luciferase-analysen og normalisert til aktiviteten av Renilla luciferase. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. *, P . 0,05
Identifikasjon av MIR-151A-5p målgener ved I-silico analyse
For å identifisere potensielle mål gener fra Mir-151A-5p, brukte vi TargetScan og microRNA.org å identifisere områder hvor disse miRNAs binder. Disse programmene identifisert fem gener som inneholder antatte måls for Mir-151A-5p i sin 3’UTR (N4BP1: NEDD4 bindende protein 1, CASZ1: lakser sink finger 1, IL1RAPL1: interleukin 1 reseptor tilbehør protein-lignende en, SOX17: SRY ( sex bestemme region Y) -BOX 17 og ARHGDIA:.. Rho BNP dissosiasjon inhibitor (GDI) alpha Disse gener ble identifisert av både algoritmer og bioinformatiske analyse viste at de kan ha tumor suppressor funksjon i flere krefttyper [23] – [27]
(A) (B) (C) (D) (E) De mRNA nivåer av fem målgener av MIR-151A-5p ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR-analyser etter transfeksjon med MIR-151A-5p ligner , MIR-151A-5p hemmer og negativ kontroll i PCA cellelinjer (PC3 og DU145). (F) mRNA nivåer av fem målgener av MIR-151A-5p ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR-analyser etter behandling med genistein ( 25 mm) i PCA cellelinjer (DU145). (G) protein~~POS=TRUNC nivåer av målgener av MIR-151A-5p ble bestemt ved western blot analyser etter transfeksjon med MIR-151A-5p ligner, MIR-151A-5p inhibitor og negative kontroll i PCA cellelinjer (PC3 og DU145). Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. *, P . 0,05
luciferaserapportørplasmid Analyser Bruke vektorer som inneholder 3’UTR Binding Nettsteder av Antatte målgener
CASZ1, IL1RAPL1 og ARHGDIA hver har en spådd bindingssete for speil 151A-5p i sine 3’UTRs mens N4BP1 og SOX17 hver har to spådd bindingsseter (Fig. 3). Vi klonet de antatte MIR-151A-5p 3’UTRs målene inn i en luciferase reporter analysen vektor. Luciferase reporter analysen viste at Mir-151A-5p redusert de relative luciferase aktiviteter CASZ1, IL1RAPL1 og ARHGDIA (Fig. 4A, 4B og 4E). Luciferase reporter analysen viste også at undertrykkelse av MIR-151A-5p økte relative luciferase 3’UTR aktiviteter. Mutasjon av den antatte MIR-151A-5p bindingsseter i disse 3’UTRs redusert respons på MIR-151A-5p. Disse resultatene indikerer at Mir-151A-5p binder direkte til 3’UTRs av CASZ1, IL1RAPL1 og ARHGDIA. Luciferase reporter analysen viste også at Mir-151A-5p redusert de relative luciferase aktiviteter, og knockdown av MIR-151A-5p økte relative luciferase aktiviteter med både villtype SOX17 3’UTRs (Posisjon 472-478 og plassering 769-776) (fig. 4C og 4D). N4BP1 3’UTR plassering 3383-3389 viste ingen luciferase aktivitet endring med enten MIR-151A-5p etterligner eller MIR-151A-5p hemmer. Den andre målområde (posisjon 4077-4083) viste at MIR-151A-5p markert redusert i forhold luciferase-aktivitet og undertrykkelse av MIR-151A-5p betydelig øket luciferaseaktivitet med vill-type 3’UTR. Dermed disse data tyder på at Mir-151A-5p binder direkte til en side (Posisjon 4077-4083) på 3’UTR av N4BP1 mRNA.
(A) MIR-151 uttrykk i kliniske prøver (BPH, n = 17; PCa, n = 30). **, P . 0.0001 (B) Kaplan-Meier overlevelseskurve viser total overlevelse av MIR-151A-5p uttrykk (P = 0,0944)
Regulering av Target Gene Expression i PCA cellelinjer av MIR -151a-5p
Kvantitativ real-time PCR-analyse viste at mRNA-ekspresjonsnivåene av de fem målgener i PC3 og DU145 ble betydelig undertrykt i MIR-151A-5p transfektanter sammenlignet med kontrollene (fig. 5A -E). I tillegg mRNA-ekspresjon av de fem målgener i PC3 og DU145 ble markant oppregulert i MIR-151A-5p inhibitor transfektanter sammenlignet med kontrollene. Vi vurderte også effekten av genistein på mRNA uttrykk for MIR-151A-5p mål. Disse målgener var nesten oppregulert med genistein behandling i DU145 cellelinjer (Fig. 5F). De protein uttrykk nivåer av SOX17 og ARHGDIA ble betydelig redusert i Mir-151A-5p transfektanter sammenlignet med kontrollene og oppregulert i MIR-151A-5p hemmer transfektanter (fig. 5G).
Up- regulert Expression of Mir-151-5p ved PCA Prøver
Vi har evaluert uttrykk nivåer av MIR-151-5p ved PCA (n = 30) og benign prostata kreft (BPH) (n = 17) vev. Uttrykket nivåer av MIR-151-5p var signifikant høyere i PCa sammenlignet med BPH-vev (P = 0,0001, Fig. 6A). For å finne ut om nivåene av MIR-151A-5p i tumorvev korrelerer med overlevelse av PCA pasientene, vi også målt MIR-151A-5p uttrykk nivåer i humane tumorprøver (Fig. 6B). Resultatene viser at pasienter med høyt MIR-151A-5p uttrykk hadde lavere overlevelse enn de med lav 151A-5p uttrykk, selv om disse resultatene ikke statistisk signifikant (p = 0,0944). Det var heller ingen signifikant sammenheng med annen klinisk-patologiske faktorer (tumor stadium og Gleason score) (data ikke vist).
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at Mir -151 er sterkt uttrykt i androgen-uavhengig PCA cellelinjer og at cellemotilitet og invasivitet er redusert i MIR-151A-5p knockdown cellelinjer (PC3 og DU145). MIR-151 består av to modne miRNAs; MIR-151A-5p og MIR-151A-3p. To modne mirnas er skåret ut fra samme stilk-løkke forløper-MIR-151A. Dermed MIR-151A-5p og MIR-151A-3p har ulike sekvenser og derfor målrette ulike mRNA. Sårheling analysen og invasjon analysen viste at knockdown av MIR-151A-5p, men ikke MIR-151A-3p, betydelig redusert PCa celle migrasjon og invasjon. Disse resultatene tyder på at MIR-151A-5p fungerer som et onkogen ved å øke cellemigrering og invasjon i PCa. I kontrast, var det ingen signifikant effekt på celleproliferasjon i MIR-151A-5p hemmer transfekterte PCA celler, noe som tyder på at MIR-151A-5p ikke er involvert i spredning aktivitet. I denne studien viste vi at oppregulering av MIR-151A-5p uttrykk i svulster er relatert til lavere overlevelse av PCA pasienter men disse resultatene ikke var signifikant forskjellig med enten denne parameteren eller andre klinikk-patologiske funksjoner. Siden vår kohort var ikke stor (n = 30) og inkluderte bare fem prøver av avansert kreft (mer enn pT3) og tre prøver med en Gleason Score på 8 eller mer, vil studier på et større antall prøver med en balansert patologisk bakgrunn har å bli gjennomført for mer presis statistisk evaluering.
Computational bioinformatikk og 3 «luciferaserapportørplasmid analyser tyder på at Mir-151A-5p har flere potensielle mål gener (CASZ1, IL1RAPL1, SOX17, N4BP1 og ARHGDIA). CASZ1, en neuronal differensiering gen, er blitt vist å besitte tumor suppressor aktivitet. I kliniske primære tumor sumples, er uttrykk for CASZ1 betydelig redusert i aggressive neuroblastom sammenlignet med de gunstige svulster [28]. Restaureringen av CASZ1 uttrykk hemmer tumor migrasjon
in vitro Hotell og undertrykte tumorigenicity
in vivo product: [23]. Den IL1RAPL1-genet er lokalisert på et område på kromosom X og proteinet kodet for av dette genet er et medlem av interleukin 1 reseptor-familien, og er i likhet med interleukin 1 aksessoriske proteiner [29]. IL1RAPL1 har blitt rapportert å bli nedregulert på mange hjernetumorcellelinjer og xenotransplantater sammenlignet med normalt vev [24] tyder på at det kan fungere som en tumor suppressor [30]. Den SOX17 genet koder for et medlem av SOX familien av transkripsjonsfaktorer som er involvert i reguleringen av fosterutviklingen og i fastsettelse av cellen skjebne [31]. Sanntids kvantitativ PCR viste at SOX17 ekspresjon var lavere i magekreft vev enn de som er i normalt vev [32]. SOX17 ble rapportert å være en kandidat tumor suppressor gen som hemmer kanoniske WNT /β-catenin signalveien i kolorektal kreft og leverkreft [25], [33]. N4BP1 har blitt identifisert som et substrat for mono ubiquitylation av E3 ubiquitin ligase Nedd4 [34]. Det har vist seg at N4BP1 interagerer med og regulerer negativt ITCH E3 aktivitet rettet mot sine underlag, inkludert c-Jun og p53-relaterte tumor suppressor protein (p73 og p63) [35]. ARHGDIA er en mobil regulatorisk protein som binder seg til og negativt regulerer de fleste Rho GTPases inkludert RhoA, Rac1, og Cdc42 [36]. Tap av ARHGDIA øker metastase og motstand mot tamoksifen ved brystkreft [37] og tap av ARHGDIA uttrykk fremmer utvikling og progresjon av PCa [27]. I thisb studie viste vi at mRNA uttrykk nivåer av disse fem tumor suppressor målgener i PC3 og DU145 ble markert endret i eksperimentering med MIR-151A-5p ligner og MIR-151A-5p inhibitor, noe som indikerer at Mir-151-5p direkte mål disse genene.
Genistein har vist seg å undertrykke veksten av flere cancercellelinjer
in vitro
og
in vivo
, noe som reduserer ekspresjon av onkogene mirnas, slik som MIR -21 [38], MIR-27a [39], MIR-221 og MIR-222 [40]. I denne studien viste vi at genistein behandling signifikant nedregulert den relative uttrykket nivået av onkogene MIR-151. Nylig, vår gruppe viste at genistein hemmet uttrykket av MIR-21 i nyrekreftceller og i svulstene dannet etter injisering genistein behandlet nyrekreftceller i nakne mus sammen med hemming av tumordannelse [38]. MIR-27a har blitt rapportert å være en onkogene miRNA i ulike kreftceller, og dens uttrykk og målet genet (ZBTB10) nivåene var avhengig av dose av genistein [39]. Vi har tidligere vist at genistein oppregulert tumorsuppressorgenet ARHI av downregulating MIR-221 og MIR-222 ved PCA [40]. Genistein har også blitt rapportert å undertrykke veksten av flere kreftformer ved å øke ekspresjon av tumordempere, MIR-146a [41] og MIR-1296 [42]. Behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med isoflavonforbindelser (inkludert 70,54% genistein), økt MIR-146a uttrykk, forårsaker nedregulering av EGFR, MTA-2, IRAK-1, og NF-kB, resulterte i inhibering av celle invasjon [41]. Vi har også rapportert at genistein økt MIR-1296 uttrykk (3-5 ganger) i PCA celler og betydelig nedregulert uttrykk for MCM2 som er målet for MIR-1296 [42].
I denne studien har vi har vist at MIR-151 direkte rettet mot flere tumorsuppressorgener og involvert i progresjon og metastasering av PCa. I tillegg er dette den første rapporten som viser at genistein nedregulerer Mir-151 uttrykk som tyder på at genistein kan tjene som et viktig kosttilskudd terapeutisk middel for behandling av PCa.
Materialer og Metoder
Clinical prostata Prøver
Alle vev lysbilder ble gjennomgått av et styre sertifisert patolog for identifisering av prostatakreft foci samt tilstøtende normalt glandular epitel. Alle kreftpasienter hadde forhøyede nivåer av prostata spesifikt antigen (PSA) og hadde gjennomgått radikal prostatektomi fra 1999 til 2004. pasientenes egenskaper er vist i tabell 1. Ikke-cancervev ble oppnådd fra BPH pasienter som hadde gjennomgått prostatektomi eller transuretral reseksjon. Informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Cell Kultur
Menneskelig prostata kreft cellelinjer, LNCaP, PC-3 og DU145 og en ikke-ondartet epithelial prostatacellelinje, RWPE-en, var kjøpt fra The American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Prostatakreft-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en fuktet atmosfære av 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C. RWPE-1-cellelinjen ble dyrket i keratinocytt-vekstmedium supplert med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor og 0,05 mg /ml bovint hypofyseekstrakt (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Subkonfluente celler (60% -70% konfluent) ble behandlet med genistein (25 mikromol /L, Sigma, St. Louis, MO, USA) oppløst i dimetylsulfoksyd og celler behandlet med kjøretøy (dimetylsulfoksyd) fungerte som kontroll. Celle media og genistein ble endret hver dag og dyrket i 4 dager.
RNA Utvinning
RNA ble ekstrahert fra FFPE humane prøver ved hjelp av en miRNeasy formalinfiksert parafin-embedded kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) etter mikrodisseksjon. Å fordøye DNA, ble det Qiagen RNase-fri DNase sett som brukes. Total RNA ble også hentet fra prostatakreftcellelinjer og en ikke-ondartet epithelial prostatacellelinje ved hjelp av et miRNeasy mini kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Kvantitativ Real-time PCR
Hentet total RNA ble revers transkribert til enkelttrådet cDNA ved hjelp av en iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og en TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitativ real-time PCR-analyse ble utført med en Applied Biosystems Prism7500 rask rekkefølge Detection System bruker TaqMan universell PCR Master Mix i henhold til produsentens protokoll (Applied Biosystems). Nivåer av RNA uttrykk ble bestemt å bruke 7500 Fast System SDS programvareversjon 1.3.1 (Applied Biosystems). Kvantitative PCR parametre for sykling var som følger: 95 ° C i 20 sekunder, 40 sykluser med PCR ved 95 ° C i 3 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder. Alle reaksjoner ble gjort i en 10-mL reaksjonsvolumet i tre eksemplarer. Dataene ble analysert med delta-deltaet Ct metode for å beregne fold-endring. TaqMan prober og primere for CASZ1 (assay ID: Hs00214901_m1), IL1RAPL1 (analyse ID: Hs00990788_m1), SOX17 (analyse ID: Hs00751752_s1), N4BP1 (analyse ID: Hs00206373_m1), ARHGDIA (analyse ID: Hs00366348), GAPDH (analyse ID: Hs02758991_g1), MIR-151A-5p (analyse ID: 002642), MIR-151A-3p (analyse ID: 002254), RNU48 (analyse~~POS=TRUNC ID: 001006) ble oppnådd fra Applied Biosystems. GAPDH og RNU48 ble brukt som intern kontroll.
Western Blot analyse
På 72 timer etter transfeksjon ble cellene lysert med RIPA buffer (Pierce, Brebieres, Frankrike) som inneholder proteasehemmere (Sigma). Protein kvantifisering ble gjort ved hjelp av en BCA proteinanalyse kit (Pierce). Protein lysat (30 pg) ble separert med 4% til 20% SDS-polyakrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembran. Et antistoff mot SOX17 ble kjøpt fra Millipore (Billerica, MA, USA). Antistoffer mot ARHGDIA og GAPDH ble kjøpt fra GeneTex (Irvine, CA, USA). Membranen ble vasket og deretter inkubert med sekundære antistoffer konjugert til pepperrotperoksidase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Spesifikke komplekser ble visualisert med en echochemiluminescence (ECL) deteksjon system (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), og uttrykket nivået av disse genene ble evaluert ved hjelp ImageJ programvare (ver 1.43;. https://rsbweb.nih.gov/ij /index.html).
Transfeksjon
Forhånds MIR miRNA forløper og negativ kontroll (Applied Biosystems) ble brukt i gevinst-av-funksjon eksperimenter, mens Anti-MIR miRNA Inhibitor og negativ-kontroll (Applied Biosystems) ble anvendt i de tap-av-funksjon eksperimenter. PC3 og DU145 cellene ble transient transfektert hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen), i henhold til produsentens anbefalinger. Mock transfections, med transfeksjon reagens, ble brukt som kontroller.
Cell Proliferation, migrering og invasjon Analyser
Celleproliferering ble målt ved hjelp av en CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) utført i henhold til produsentens instruksjoner. Celleformering ble bestemt ved absorbansmålinger ved 490 nm ved bruk av Spectramax 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). Cellemigrering aktivitet ble evaluert ved en sårhelende analysen. Celler ble sådd ut i seks-brønners skåler, og cellemonolagene ble skrapet ved anvendelse av en P-20 mikropipette spissen. Bredden av det første gap (0 h), og det gjenværende gap 24 timer etter at såret ble beregnet fra mikrofotografier. En celle invasjon analysen ble utført ved å bruke modifisert Boyden kamre som består av Transwell-forbelagt Matrigel membranfilterinnsatser med åtte mikron porer i 24-brønners vevskulturplater (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Minimum essential medium inneholdende 10% FBS i det nedre kammer tjente som kjemoattraktant, som tidligere beskrevet [43]. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer
Prediksjon av mikroRNA Targets
De predikerte målgener og deres miRNA bindende språk frø regioner ble bestemt med TargetScan (slipp 5.2, http:. //www.targetscan. org /) og microRNA.org (august 2010-versjonen, https://www.microrna.org/microrna/home.do). Sekvensene av de antatte modne miRNAs ble bekreftet av miRBase (slipp 18,0; https://microrna.sanger.ac.uk/).
Plasmid Bygg og Dual-luciferaserapportørplasmid Analyser
For 3 «UTR luciferase reporter assay PmirGLO Dual-luciferase miRNA Target-ekspresjonsvektor ble brukt (Promega). Oligonukleotid-sekvensene (villtype) som brukes er vist i tabell S1. Vi har også konstruert muterte oligonukleotider for hver av de villtype oligonukleotider (tabell S1). I et totalvolum på 25 ul, 1 pl av hver av 100 uM forover- og revers oligonukleotid, 2,5 ul 10 x annealing-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl og 10 mM ethylendiamintetraeddiksyre) og 20,5 pl vann var inkubert ved 95 ° C i 3 minutter og deretter plassert ved 37 ° C i 15 min. Oligonukleotidene ble ligert inn i PmeI-XbaI stedet pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor. For 3 «UTR luciferase assay, prostata kreft celler ble ko-transfektert med Pre-Mir miRNA forløper eller Anti-MIR miRNA hemmer og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspresjonsvektorer bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og X-tremeGENE HP DNA Transfeksjon Reagens ( Roche Diagnose, Basel, Sveits, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Luciferase reporter analysen ble utført ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega) 24 timer etter transfeksjon.
Statistical Analysis
Forholdet mellom to variabler og de numeriske verdiene oppnås ved real-time RT -PCR ble analysert ved hjelp av parametriske Mann-Whitney U test eller paret t-test. Forholdet mellom tre variabler og de numeriske verdier ble analysert ved anvendelse av Bonferroni justerte Mann-Whitney U-test. Association of Mir-151 uttrykk med total overlevelse ble anslått av Kaplan-Meier-metoden, og de resulterende kurvene ble sammenlignet med log rank test. Alle analyser ble utført ved hjelp av Expert Statview (versjon 4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). I sammenligningen mellom tre variabler, et ikke-justert statistisk signifikansnivå på P 0,05 tilsvarer en Bonferroni justert nivå på P . 0,0167
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Primer oligonukleotid-sekvenser (villtype og muterte).
doi: 10,1371 /journal.pone.0043812.s001 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Dr. Roger Erickson for hans støtte og hjelp i forbindelse med utarbeidelsen av manuskriptet .
