Abstract
Et tilstrekkelig nivå av arginin i vevet mikromiljøet er viktig for T-celle aktivitet og overlevelse . Arginin nivåer er regulert av arginin-catabolizing enzym, arginase (ARG). Det har blitt rapportert at arginase II (ARG2), en av to ARGS, blir avvikende uttrykt i prostatakreftceller, som konverterer arginin inn i ornitin, noe som resulterer i en mangel på arginin som svekker tumor-infiltrerende lymfocytter og gjør dem dysfunksjonell. Imidlertid har immunsuppresjon mediert av ARG2-uttrykkende kreftceller i lunge cancer ikke vært observert. Her studerte vi uttrykk for ARG2 i bukspyttkjertelen ductal carcinoma (PDC) vev clinicopathologically ved å undersøke over 200 tilfeller av PDC. I motsetning til prostatakreft, ble ARG2 uttrykk sjelden påvist i PDC celler ved immunhistokjemi, og i stedet ARG2 ble karakteristisk uttrykt i a-glatt muskulatur aktin-positive kreft-assosiert fibroblaster (kafeer), særlig de som ligger i og rundt nekrotiske områder i PDC. Tilstedeværelsen av ARG2-uttrykke kafeer var nært korrelert med kortere total overlevelse (OS;
P
= 0,003) og sykdomsfri overlevelse (DFS;
P
= 0,0006). Multivariat Cox regresjonsanalyse viste at forekomsten av ARG2-uttrykke kafeer i PDC vev var en uavhengig prediktor for dårligere OS (hazard ratio [HR] = 1,582,
P
= 0,007) og DFS (HR = 1,715,
P
= 0,001) i PDC pasienter. I tillegg til den karakteristiske fordelingen av ARG2-uttrykkende kafeer, kafeer slike co-uttrykte karboanhydrase IX, SLC2A1, eller HIF-1a, markører for hypoksi, i PDC vev. Videre
in vitro
eksperimenter viste at dyrkede fibroblaster hentet fra PDC vev uttrykte ARG2 transkripsjon etter eksponering for hypoksi, som hadde arginase aktivitet. Disse resultatene indikerer at kreftcelle-medierte immun-suppresjon gjennom ARG2 uttrykk er ikke en generell hendelse, og at tilstedeværelsen av ARG2-uttrykk kafeer er en indikator på dårlig prognose, så vel som hypoksi, i PDC vev.
Citation : Ino Y, Yamazaki-Itoh R, Oguro S, Shimada K, Kosuge T, Zavada J et al. (2013) Arginase II Uttrykt i Cancer-assosiert fibroblaster Indikerer vevshypoksi og Spår dårlig resultat hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (2): e55146. doi: 10,1371 /journal.pone.0055146
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 11 april 2012; Godkjent: 19 desember 2012; Publisert: 12 februar 2013
Copyright: © 2013 Ino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for tredje periode Omfattende 10-års strategi for Cancer Control fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan (NH), en Grant-in-Aid for Scientific Research fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (NH), Princess Takamatsu Foundation (10-24216) (NH), og Cancer Research and Development Fund (NH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
svulstens mikromiljø spiller viktige roller i den biologiske oppførselen til noen svulst, som inkluderer vertens immunrespons, vev oksygen spenning, og kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) [1].
Tilstrekkelig nivåer av arginin i det ekstracellulære miljø er viktig for T-celleformering og aktivitet. [2], [3] Arginin er en av de semi-essensielle aminosyrer og arginin-nivåer reguleres av arginase (ARG), [4] som hydrolyserer arginin til ornitin og urea. Det er to enzymene ARG, ARG1 og ARG2. ARG1, en cytoplasmisk enzym, er uttrykt hovedsakelig i leveren og detoxifies ammoniakk. ARG2 er uttrykt som en mitokondrie protein i forskjellige vev, slik som nyre, prostata, og tynntarmen. Arginin tjener også som et substrat for nitrogenoksid syntase (NOS), hvilket ga nitrogenoksid (NO) og andre reaktive nitrogenmellomprodukter.
Det har blitt rapportert at ARG2 er avvikende uttrykt i prostata kreft celler, å være involvert i tumor immun flukt mediert av arginin forbruk, noe som resulterer i en mangel på arginin som svekker tumor-infiltrerende lymfocytter og gjør dem dysfunksjonell. [5] Prostatakreft samtidig uttrykker NOS2, og dermed redusere arginin progressivt og danner peroxynitrite som trigger T-celle-apoptose ved å hemme signaloverføring som er nødvendig for cellulær aktivering. [5] Imidlertid er disse immunosuppressive effekter gjennom den ARG2 ekspresjon i kreftceller var ikke tydelig i den neste lungekreft studien. Mer enn 80% (99/120 tilfeller) av lunge cancer uttrykt ARG2 til varierende grader, selv om ekspresjonen av ARG2 hadde ingen effekt på clinicopathological egenskaper, herunder vertens tumorimmunrespons. [6] Nå er det kontroversielt, virkningen av ARG2 på kliniske kjennetegn kreft hos mennesker.
Kreft i bukspyttkjertelen [bukspyttkjertel ductal carcinoma (PDC)] er den fjerde og femte største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA og Japan, henholdsvis. [7], [8] Den samlede fem års overlevelse for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er 3-5%, [7], [9], [10], [11] i lys av sin aggressive vekst og tidlig metastatisk spredning . Den dødelighet på grunn av denne kreftformen har vist ingen åpenbar forbedring i flere tiår. Utviklingen av prediktive biomarkører for å bistå utvalg av pasient undergrupper er nyttig for studier med sikte på å redusere dødeligheten av PDC pasienter, særlig i fase kliniske studier designet for å vurdere ulike terapeutiske tilnærminger [12].
I denne studien, vi undersøkt uttrykket og clinicopathological betydning ARG2 i PDC. Vi har funnet at bare noen få PDC-celler uttrykte ARG2, men lagt merke til at ARG2 ble uttrykt i visse stromale celler i PDC vev. Vi fant også at tilstedeværelsen av ARG2-uttrykke stromale celler i PDC vev var en clinicopathologically betydelig variabel, blir forbundet med dårligere utfall, samt en indikator på hypoksi.
Resultater
ARG2 Expression er sjelden i PDC Cells, men Karakteristisk uttrykt i spindel-formet stromale celler i og rundt Nekrotiske Områder i PDC Tissue
Immunhistokjemisk analyse viste at ARG2 uttrykk var til stede i et lite antall PDC tilfeller, der det ble uttrykt fokalt i PDC celler. I motsetning til dette ble ARG2 uttrykt i spindelformede stromale celler i og rundt nekrotiske områder (figur 1A). ARG2 var farget med en dot-lignende eller grov kornet mønster i cytoplasma av spindel celler, som er kompatible med det faktum at ARG2 er lokalisert i mitokondriene (figur 1B). ARG2 ble også uttrykt i Langerhans holmen celler og ganglion celler i bukspyttkjertelen vev under ikke-patologiske tilstander. Uttrykk for ARG1 ble påvist kun i cytoplasma av nøytrofile ved immunhistokjemi, og ikke i kreftceller (figur 1C).
(A) Histologi av PDC vev i lav- (øvre søyler) og høy effekt view ( lavere kolonner). HE flekker (venstre kolonne) og immunhistokjemi for ARG2 (midten kolonner) og cytokeratins (høyre kolonner) i seriesnitt vev. Nekrotiske områder er omgitt av stjernemerker (stort område av nekrose er plassert nederst til høyre) i den øvre HE bildet og rektangelet (lys blå) tilsvarer det området av den nedre kolonne. (B) Immunhistokjemi for ARG2 (venstre øvre kolonne) og for mitokondrier (venstre nedre kolonne) i høy effekt utsikt. Positiv farging av ARG2 er visualisert som et punktlignende eller grovt kornet mønster i cytoplasma av spindelceller. Denne positive fargemønster var forenlig med mitokondrie-antigen. Double immunfluorescens (høyre kolonne) viser ARG2 (grønn), mitokondrier (rød) og kjerner (hvit). Nesten alle ARG2-positiv farging er samlokalisert med mitokondrier (gul). (C) Immunhistokjemisk uttrykk for ARG1 ble kun observert i nøytrofile. Øvre og nedre kolonner er mellom- og høy effekt utsikt, henholdsvis.
Prognostic Betydningen av ARG2 Expression i stromale celler
Survival analyse viste en sammenheng mellom tilstedeværelsen av ARG2-uttrykke stromale celler og kortere OS (
P
= 0,003) og DFS (
P
= 0,0006) (figur 2), selv om ingen sammenheng ble funnet mellom tilstedeværelsen av ARG2-uttrykker kreftceller og eventuelle pasient overlevelse parameter. Når det gjennomsnittlige antall positive celler var null, 1 til 80, og mer enn 80, fargings karakterene tilordnet var null (fravær), en (lavere ekspresjon), og to (høyere ekspresjon), respektivt. Som ARG2 uttrykk økte, ble overlevelsen betydelig kortere i form av både OS og DFS (figur 2).
(A, C) Kaplan-Meier overlevelseskurve viser en sammenligning av total overlevelse mellom forekomsten (grad 1 og 2) og fravær (klasse 0) av ARG2 uttrykk i stromale celler (
P
= 0,003) i A og at blant uttrykk karakterer (karakterer 0 til 2) av ARG2 i stromale celler (grad 0 g karakteren 1 , log-rank test,
P
= 2,08; grad 0 vs. klasse 2,
P
0,0001, klasse 1 vs. klasse 2,
P
= 0,0009 ) i C (B, D) Kaplan-Meier-overlevelses kurve som viser en sammenligning av sykdomsfri overlevelse mellom forekomsten (grad 1 og 2) og fravær (grad 0) av ARG2 ekspresjon i stromale celler (
P
= 0,0006) i B og at blant uttrykk karakterer (grad 0 til 2) av ARG2 i stromale celler (grad 0 kontra klasse 1,
P
= 0,069; grad 0 vs. klasse 2,
P
0,0001, klasse 1 vs. klasse 2,
P
= 0,013) i D. Svart sirkel og hvite sirkelen representerer sensurere og fiasko, henholdsvis
. gjennomsnittlig overlevelse av pasienter med PDC med eller uten ARG2-uttrykke stromale celler var 22.71 ± 1.77 måneder og 37.13 ± 2.41 måneder, henholdsvis. Ett års overlevelse for pasienter med PDC med eller uten ARG2-uttrykke stromale celler var 66,9 ± 5,2% og 78,7 ± 3,7%, henholdsvis; 2-års overlevelse var 36,1 ± 5,4% og 51,6 ± 4,6%, og 5-års overlevelse 17,1 ± 4,4% og 34,5 ± 4,5%, henholdsvis.
multivariat Cox regresjonsanalyse inkludert tumorstørrelse, node status, metastasestatus, tumor histologisk grad, margin status, nerve plexus invasjon, lymfatisk invasjon, venøs invasjon, intrapancreatic nevrale invasjon, og uttrykk for ARG2 i stromale celler viste at uttrykket av ARG2 i stromale celler, metastatisk status, lymfatisk invasjon, og venøs invasjonen var uavhengige prediktorer for OS (tabell 1), og at uttrykk for ARG2 i stromale celler, metastatisk status, nerve plexus invasjon, og venøs invasjonen var uavhengige prediktorer for DFS (tabell 2). Når uttrykket av ARG2 i stromale celler ble kategorisert i noe og lavere uttrykk versus høyere uttrykk (se Materiale og metode), univariat analyse av OS og DFS viste (
P
0,0001, hazard ratio [HR] = 2,505; 95% konfidensintervall [CI], 1,649 til 3,804) og (
P
0,0001, HR = 2,519; 95% CI, 1,658 til 3,827), henholdsvis. Multivariat analyse av OS og DFS viste (
P
0,0001, HR = 2,687; 95% CI, 1,759 til 4,103) og (
P
0,0001, HR = 2,451; 95% CI, 1,608 til 3,736), henholdsvis.
sammenheng mellom forekomsten av ARG2-uttrykke stromale celler og andre Clinicopathological variabler
Tabell 3 viser de clinicopathological funksjonene til pasienter med PDC. Når disse funksjonene ble analysert for korrelasjoner ble forekomsten av ARG2-uttrykke stromale celler funnet å være mer sannsynlig i tilfeller med dårligere tumor differensiering i form av histologisk grad, tilstedeværelse av nekrose, og tilstedeværelse av stromale celler som uttrykker Caix og SLC2A1 (alternativt kjent som glukosetransportør type 1, GLUT1), som er markører for hypoksi. I tillegg ble nærvær av ARG2-uttrykkende stromale celler korrelert med høyere tumor-infiltrerende CD68
+ makrofager og CD66b
+ nøytrofiler, og lavere tumor-infiltrerende CD4
+ T-celler og CD8
+ T-celler. Ingen signifikant korrelasjon ble funnet mellom tilstedeværelsen av ARG2-uttrykke kreftceller og noen av disse clinicopathological parametere.
Flertallet av ARG2-uttrykker stromale celler er kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) i en hypoksisk State
for å finne ut hva slags stromale celler uttrykte ARG2, vi utførte dobbel immunhistokjemi og trippel immunfluorescens. ARG2-uttrykkende spindel celler ofte var positive for α-SMA, vimentin, og kollagen type I, sjelden positiv for CD31 og CD68 (data ikke vist), og negativ for desmin, cytokeratins, og D2-40 (figur 3), som indikerer at flertallet av ARG2-uttrykke stromale celler kafeer og et mindretall var endotelceller eller makrofager. Men de fleste av kafeer i PDC vev uttrykte ikke ARG2, med unntak av de som er tilstede i og rundt nekrotisk og myxoid degenerative områder. Overraskende, ARG2 ble ikke tilsynelatende uttrykt i stromal eller epitelceller som omgir nekrotisk vev eller myxoid degenerative områder i intraductal papillær-mucinous neoplasmer i bukspyttkjertelen og nekrotisk vev i peptisk ulcus (data ikke vist).
(A) Triple immunfluorescens viser at det meste av dot-lignende farging av ARG2 (rød) er tilstede i a-SMA-positive fibroblaster (grønt). Kreftceller er positive for cytokeratins (blå). Atomkjerner er farget av DAPI (hvit). (B) histologi og immunhistokjemi av PDC vev i lav- (øverste bilde av hvert par av bildene) og høy effekt visning (nedre bilde av hvert par av bilder). HE farging og immunhistokjemi for flere antigener i seriesnitt vev. Nekrotiske områder er omgitt av stjerners merkene i lavt strømforbruk HE foto og rektangelet (lys blå) tilsvarer arealet av høyeffekts utsikt.
Siden ARG2-uttrykke kafeer var tilstede i og rundt nekrotiske områder, vi neste undersøkt forholdet mellom ARG2 uttrykk og hypoksi i kreft vev ved hjelp av dobbel farging. Uttrykk av Caix, SLC2A1, eller HIF-1α ble observert i kafeer rundt områder av nekrose. ARG2 uttrykk ble funnet i disse CAIX-, SLC2A1-, eller HIF-1a-uttrykke kafeer selv, eller i kafeer som ligger ved siden av CAIX-, SLC2A1-, eller HIF-1a-uttrykke celler (figur 4). ARG2 uttrykk i kreftceller var ikke begrenset til områdene rundt nekrose eller i nærheten CAIX-, SLC2A1-, eller HIF-1α-uttrykke celler (data ikke vist). Disse funnene antydet at uttrykk for ARG2 ble indusert i kafeer henhold hypoksiske forhold, og også at det ikke var noen åpenbar sammenheng mellom hypoksi og uttrykk for ARG2 i kreftceller.
Histologi av PDC vev i lav- (øvre søyler) og høy effekt view (lavere kolonner). HE farging og immunhistokjemi for ARG2, Caix, og SLC2A1 i seriesnitt vev. Nekrotiske områder er omgitt av stjernemerker i den øvre HE bildet og rektangelet (lys blå) tilsvarer det området av den nedre kolonne. Double farging (lengst til høyre kolonne) viser at det meste av kornet ARG2 flekker (brun) er til stede i spindelformede celler farget for Caix (lilla). Innfelt er et svært høyt strømforbruk utsikt.
Hypoksi induserer uttrykk for ARG2 i kafeer hentet fra PDC Vev
For å bekrefte om uttrykk for
ARG2
genet er indusert av hypoksi i kafeer, gjennomførte vi
in vitro
eksperimenter med kafeer hentet fra PDC vev. Induksjon av
ARG2
genekspresjon av hypoksisk spenning ble funnet i kafeer på både transkripsjon og proteinnivåer, og den induserte ARG2 hadde arginase aktivitet (figur 5A-C). Uttrykk for ARG2 videreført under hypoksiske forhold, og induksjon av ARG2 av hypoksisk stresset var reversibel. Re-oksygene redusert oppregulert uttrykk for
ARG2
genet til et nivå som kan sammenlignes i kafeer dyrket under normoksisk forhold (figur 5A). Hypoksisk stresset indusert opphopning av HIF-1α i kafeer (figur 5D). I henhold til genet databasen, 5′-flankerende område av det første ekson av den ARG2 genet har potensielle bindingsseter for HIF-1 (5′-RCGTG-3 «) [13]: ACGTG ved -425 til -421 og GCGTG hos -234 til -230. Disse funnene tyder på at uttrykk for ARG2 induseres via HIF-1 signalveien.
(A) Relativ genekspresjon måles ved real-time RT-PCR i fibroblaster hentet fra PDC vev etter 48 timer med eksponering for hypoksi (hypoksi) eller kultur i henhold normoksisk kontrollbetingelser (Normoxia). Uttrykk av gener i fibroblaster etter 48 timer med kultur i henhold hypoksiske forhold etterfulgt av 48 timer med kultur i henhold normoksisk forhold (Re-oksygenering) ble også analysert. Hver data kolonne representerer den gjennomsnittlige relative uttrykk standardisert med 18SrRNA ± SE for tre bestemmelser.
SLC2A1 plakater (alternativt kjent som glukosetransportør type 1 eller GLUT1) genet er hypoksi-induserbar. Betydning verdi (Student
t
test) av
P
0,01 (*). Noen gener uttrykkes i kafeer på et ekstremt lavere nivå enn i et normalt vev som er den viktigste vev for å uttrykke genet. I slike tilfeller blir sammenligning av genekspresjon vist i innfellinger med 1/50 til 1/10000 skalaer. (B) Western blot-analyse (øvre kolonne) viser at ARG2 proteinekspresjon blir indusert i kafeer brukt i (A) ved eksponering for hypoksi. N og H angir de cellene dyrket under normoksisk og hypoksiske betingelser, henholdsvis. ARG2 protein indusert i kafeer har arginase aktivitet (nedre kolonne). En enhet av arginase omdanner en umol L-arginin til ornitin og urea per minutt ved pH 9,5 og 37 ° C. Hver data kolonne representerer middelverdien aktivitet ± SE for tre bestemmelser. Betydning verdi (Student
t
test) av
P
0,05 (*) og
P
0,01 (**). (C) Uttrykk av gener i kafeer fra PDC vev under dyrking i henhold hypoksiske forhold oppdages av real-time RT-PCR. Data representerer en av tre uavhengige eksperimenter. Betydning verdi (Student
t
test) av
P
0,01 (*) og
P
0,001 (**). (D) Western blot-analyse av HIF-1α protein. Opphopning av HIF-1α protein er observert i kafeer etter 6 timer med eksponering for hypoksiske forhold. N og H indikerer celler dyrket under normoksisk og hypoksiske forhold, henholdsvis.
Uttrykk for
ARG1
,
NOS1, NOS2
, og
NOS3
gener ble ikke signifikant indusert av hypoksi (figur 5A). Uttrykk for
ARG1 Hotell og
NOS3
gener syntes å være forårsaket av hypoksi, selv om deres nivåer av uttrykk var svært lav, nesten 1/1000 til 1/10000 av dem i et normalt vev, som er en av de viktigste vev som uttrykker genet. Siden alle disse gener koder for enzymmolekyler, er det lite sannsynlig at slike små mengder av induserte transkripter ville være biologisk viktige. Snarere er det spekulert at små mengder av kontaminerende celler som endotelceller kan ha reagert til de hypoksiske betingelser. Peroxynitrite er en reaktiv nitrogenmellomprodukt fremstilt ved både NOS og ARG er til stede. Siden disse cellene ikke uttrykke nitrotyrosine undersøkt av immunhistokjemi (data ikke vist) som er generert av nitrering av tyrosin rester av peroxynitrite,
NOS2
uttrykk ble ikke indusert i kafeer i og rundt nekrotiske områder i PDC vev. Disse resultatene tyder på at
NOS2
ikke indusert i
ARG2
-expressing kafeer.
ARG2-uttrykke kafeer potensielt påvirke immunreaksjonen
Den normale fysiologiske konsentrasjonen av L-arginin i serum er omtrent 100 um (50-150 um). Vi har fastslått at 12-15 pM L-arginin ville være nødvendig for T-celle-proliferasjon indusert av T-celle-reseptor stimulering under de eksperimentelle betingelser som anvendes vi (Figurene 6A og 6B). Deretter prøvde vi å undersøke om ARG2 indusert ved eksponering for hypoksi påvirker spredning av T-celler
in vitro
. I motsetning til forventning, det kondisjonerte medium som hadde vært benyttet for dyrking av kafeer henhold hypoksiske betingelser ikke undertrykke T-celleformering i betydelig grad i forhold til medium som hadde vært benyttet for dyrking av kafeer henhold til normoksisk betingelser (figur 6A og B). Avviket av funnene til våre resultater av induksjonen av ARG2 protein med en viss enzymatisk aktivitet i kafeer etter hypoksisk eksponering kan være forårsaket av utskillelsen av ubestemte molekyler som kan understøtte T-celleformering fra kafeer.
( A) T-celle proliferasjonsanalyse. CFSE-merket CD3
+ T-celler ble stimulert med anti-CD3 /CD28-antistoff-konjugert-perler i friskt medium supplert med indikator- L-arginin (kontroll) eller i kondisjonert medium etter dyrkning av kafeer henhold til normoksisk forhold (normoxia) eller hypoksiske betingelser (hypoksi) i mediet med indikator- L-arginin (inkludert 2,0 uM arginin av seruminnhold) i fire dager, og deres sprednings profiler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Ikke-delte celler som viste den høyeste fluorescensintensitet og intensiteten av de merkede T-celler ble halvert med hver celledeling. Tallene representerer forholdet mellom antall celler som har gjennomgått flere avdelinger, i forhold til det opprinnelige antall celler. Data representerer en av seks uavhengige eksperimenter. (B) Prosenter av celler som har gjennomgått celledelinger. Data representerer en av seks uavhengige eksperimenter. (C, D) Sammenligning av absolutte antall tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler (C) med sine prolifererende indeks (andelen av Ki-67-positive prolifererende celler mellom CD3
+ T-celler) (D ) mellom området rundt ARG2-uttrykk kafeer (hvit) og området inne i svulsten med unntak av nekrotisk vev (flekket). Vi telte tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler og deres Ki-67 positivitet i hver tjue forskjellige kraftige felt per område kategorier ved hjelp av to PDC tilfeller. Hver datakolonne representerer gjennomsnitt ± SE for tre bestemmelser. Betydning verdi (Student
t
test) av
P
0,05 (*) og
P
. 0,001 (**)
for å finne ut om CD3
+ T-celler formerer rundt ARG2-uttrykke kafeer i PDC vev, utførte vi dobbelt immunhistokjemi for CD3 og Ki-67 og sammenlignet tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler med sine prolifererende indeksen i området rundt ARG2-uttrykk kafeer i området innenfor svulsten bortsett nekrotisk vev. Det var overrasket over at det var få CD3
+ T-celler rundt ARG2-uttrykke kafeer. Både den absolutte antall tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler (figur 6C), og andelen av Ki-67-positive prolifererende celler blant CD3
+ T-celler (figur 6D) ble observert i området rundt ARG2- uttrykker kafeer var betydelig lavere enn det som ble observert i det andre området. Disse funnene tyder på at det adaptive immunrespons er undertrykt i områdene rundt ARG2-uttrykke kafeer.
Den direkte effekten av ARG2 indusert ved eksponering for hypoksi i kafeer mot kreftcellene ble undersøkt ved hjelp av en
in vitro
system der kafeer hentet fra PDC vev var co-dyrket med kreft i bukspyttkjertelen MiaPaCa-2 celler. Spredning av cancerceller ble ikke signifikant påvirket av ARG2 indusert ved hypoksi (figur 7A), og oksidativt stress-indusert apoptose av kreftceller, men kafeer seg selv er ikke hindres av polyamin fremstilt ved ARG2 i respons til hypoksi (figur 7C).
(A) ARG2-uttrykke kafeer støtter ikke spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler. Kafeer utvunnet fra PDC vev og MiaPaCa-2-celler ble ko-dyrket i medium med eller uten 2 mM DFMO i henhold til normoksisk eller hypoksiske betingelser i 48 timer, og antallet av levende celler ble beregnet på grunnlag av data oppnådd ved strømningscytometri. Det absolutte antall MiaPaCa-2-celler dyrket under hypoksiske betingelser redusert betraktelig sammenlignet med normoksisk forhold, men denne effekten ble ikke signifikant påvirket av tilstedeværelsen av DFMO i kulturmediet. Data representerer en av tre uavhengige eksperimenter. Betydning verdi (Student
t
test) av
P
0,05 (*) og
P
0,01 (**). (B) Oxidative stress-fremkalt apoptose ble indusert i MiaPaCa-2-celler ved eksponering for forskjellige konsentrasjoner (0-500 uM) i H
2o
2 til 7 timer. De døde celler og levende celler ble detektert ved strømningscytometri etter farging med Annexin V og PI. (C) ARG2-uttrykke kafeer ikke beskytte kreft i bukspyttkjertelen celler mot oksidativt-indusert apoptose. Etter 48 timer med ko-kultur av kafeer utvunnet fra PDC vev og MiaPaCa-2-celler i medium med eller uten 2 mM DFMO i henhold til normoksisk eller hypoksiske betingelser, alle cellene ble dyrket i ytterligere 4 timer under et oksidativt stress (50 uM H
2o
2) ved hjelp av de samme vilkår som før. Prosentandelene av levende celler ble målt ved flow-cytometri (venstre kolonne). For å evaluere effekten av oksidativt stress, var prosentandelen av levende celler etter eksponering for oksidativt stress dividert med prosentandelen av levende celler dyrket under de samme betingelser før oksidativt stress (høyre kolonne). Forholdet mellom levende celler før og etter oksidativt stress redusert betydelig i både MiaPaCa-2 celler og kafeer dyrket under hypoksiske forhold. Blokkering syntesen av polyaminer med DFMO økt betydelig grad av oksidativt stress-indusert apoptose i kafeer. Data representerer en av tre uavhengige eksperimenter. Betydning verdi (Student
t
test) av
P
0,05 (*) og
P
. 0,01 (**)
diskusjon
ARG spiller viktige roller i regulering av de fleste aspekter av arginin metabolisme i helse og sykdom, som arginin er en forløper for flere molekyler med i hovedsak viktige biologiske funksjoner, slik som urea, nitrogenoksid, polyaminer, prolin, kreatin, glutamat, og agmatin. [2], [4] Selv om ARG2 er angivelig involvert i tumorImmunrømnings mekanismer, [5] sine roller i human cancer er fortsatt ikke fullstendig klarlagt. Her viste vi at flertallet av PDCs ikke uttrykke ARG2 og at tilstedeværelsen av ARG2-uttrykke PDCs ikke var signifikant korrelert med pasientens utfall. I stedet ble tilstedeværelse av ARG2-uttrykke kafeer funnet å være en uavhengig prediktor for dårligere OS (HR = 1,582,
P
= 0,007) og DFS (HR = 1,715,
P
= 0,001 ) i PDC pasienter. Tilstedeværelsen av ARG2 kafeer i PDC vev ble korrelert med høyere tumor grad, tilstedeværelse av histologisk nekrose, tilstedeværelsen av Caix-uttrykk stromale celler, og nærværet av SLC2A1-uttrykkende stromale celler i PDC vev. ARG2-uttrykke kafeer ble lokalisert i og rundt nekrotiske områder i PDC vev og co-uttrykt Caix, SLC2A1, og HIF-1α. Videre
in vitro
eksperimenter viste at dyrkede fibroblaster hentet fra PDC vev uttrykte ARG2 etter eksponering for hypoksi. Disse resultatene indikerer at kreftcelle-medierte immun-suppresjon gjennom ARG2 uttrykk er ikke en generell hendelse, og at tilstedeværelsen av ARG2-uttrykkende kafeer er en uavhengig prognostisk faktor for PDC-pasienter, og reflekterer også vevshypoksi.
Redusert oksygen spenning har blitt rapportert å påvirke ARG aktivitet i flere vev og celletyper, inkludert lunge, hjerne, endotelceller, og makrofager, [14], [15], [16] selv om effektene på aRGS varierer blant vev, celler og arter. Hos mennesker er det blitt vist at hypoksi induserer ekspresjon av ARG2 i lungearterie glatte muskelceller (PASMC) [17] og lunge mikrovaskulær endotelceller. [18], [19] Så vidt vi vet, har effekten av hypoksi på ARG uttrykk i kreft vev eller fibroblaster ikke blitt vist tidligere. Vår studie sammen med studien at hypoksi-indusert uttrykk for ARG2 men ikke ARG1 i PASMCs antyder at ARG2 er hypoksi-induserbar isoform. [17] Det er i overensstemmelse med våre funn at akkumulering av HIF-1α ble funnet i kafeer henhold hypoksiske betingelser, og også at 5′-flankerende område av det første ekson av den ARG2 genet har potensielle bindingsseter for HIF-1.
Ornitin generert av ARG kan videre metaboliseres til polyaminer og prolin, som er kritiske for celleproliferasjon, differensiering og reparasjon av vev, og dermed potensielt hindrer celledød. [20], [21], [22] Derfor induksjon av ARG2 kan være en defensiv reaksjon av kafeer i PDC vev under alvorlig hypoksisk belastning som potensielt kan føre til celledød. Ja, våre resultater viste at ARG2-uttrykke kafeer bedres oksidativt stress-indusert apoptose av kafeer selv (figur 7C). Dette er i overensstemmelse med det faktum at disse kafeer viste et høyt nivå av ARG og et lavt nivå av NOS, indikerer omfattende generering av polyaminer og prolin i dem. Disse kafeer kan også forårsake fibrose, siden Proline er en viktig komponent av kollagen. Som det har blitt observert at nekrotisk vev ofte blir omformet til fibrøst vev som en form for helbredelse reaksjon, [23] er det foreslått at ARG2 induksjon er involvert i fibrose i hypoksiske områder for å lette etter nekrotisk fibrose. Selv om det fortsatt er uklart om ARG2-uttrykker kafeer fremme tumorprogresjon ble ingen signifikante effekter på spredning av kreftceller og beskyttelse av oksidativt stress-indusert apoptose av kreftceller som finnes i våre
in vitro
eksperimenter (Tall 7A og 7C).
de fleste av PDC cellene uttrykte ikke ARG2. Lungekreft uttrykker ARG2, selv om immunsuppresjon mediert av ARG2-uttrykkende kreftceller ikke er blitt observert. [6] Det er således foreslått at kreftcelle-medierte immun-suppresjon av ARG2 (og NOS2) i prostatakreft [5] er sannsynligvis vev-avhengige, og ikke en generell arrangement i kreft mikromiljøet. Vår undersøkelse av tumor-infiltrerende immunceller i PDCs viste at forekomsten av ARG2-uttrykke kafeer var signifikant korrelert med høyere infiltrasjon av CD68
+ makrofager (
P
= 0,05) og CD66b
+ nøytrofile (
P
0,0001), og lavere infiltrasjon av CD4
+ T-celler (
P
= 0,003) og CD8
+ T-celler (
P
= 0,036). I tillegg, tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler i området rundt ARG2-uttrykkende kafeer var få og viste mindre spredning (figur 6). Disse funnene antyder at nærværet av ARG2-uttrykkende kafeer er nært relatert til den immunundertrykkende mikromiljøet. Denne situasjonen kan forklares i form av vevshypoksi, [24] selv om i hvilken grad lokale uttrykk for ARG2 i kafeer bidrar til dette immunsuppresjon er fortsatt uklart.
