Abstract
Bakgrunn
maligne gliomer rangerer blant de mest dødelige kreftformer. Hjernesvulst viser en slående mobil heterogenitet med et hierarki av differensiering stater. Nyere studier støtter eksistensen av kreft stamceller i hjernesvulst som er funksjonelt definert ved deres evne til utstrakt selvfornyelse og dannelse av sekundære tumorer som phenocopy de opprinnelige tumorer. Som c-myc oncoprotein har anerkjent roller i normal stamcellebiologi, hypotese vi at c-myc kan bidra til kreft stamcellebiologi som disse cellene dele egenskapene med normale stamceller.
metodikk /hovedfunnene
Basert på tidligere metoder som vi og andre har ansatt, svulst celle populasjoner ble beriket eller utarmet for kreft stamceller ved hjelp av stamcelle markør CD133 (Prominin-1). Vi preget c-myc uttrykk i matchet tumorcellepopulasjoner ved hjelp av real time PCR, immunoblotting, immunfluorescens og flowcytometri. Her rapporterer vi at c-myc er sterkt uttrykt i glioma kreftstamceller i forhold til ikke-stilk glioma celler. Å avhøre betydningen av c-myc uttrykk i glioma kreftstamceller, målrettet vi uttrykket bruker lentivirally omformet kort hårnål RNA (shRNA). Knockdown av c-myc i glioma kreftstamceller redusert spredning med samtidig cellesyklus arrest i G
0 /G
1 fase og økt apoptose. Non-stilk glioma celler vises begrenset avhengighet av c-myc uttrykk for overlevelse og spredning. Videre glioma kreftstamceller med nedsatt c-myc nivåer mislyktes i å danne neurosfærer
in vitro
eller svulster når xenotransplanted inn i hjernen til immunsupprimerte mus.
Konklusjon /Betydning
disse funnene støtter en sentral rolle i c-Myc i regulering av proliferasjon og overlevelse av gliom kreft stamceller. Rettet mot kjernestamcelle trasé kan tilby bedre terapeutiske tilnærminger for avansert kreft
Citation. Wang J, Wang H, Li Z, Wu Q, lathia JD, McLendon RE, et al. (2008) c-myc er nødvendig for vedlikehold av Glioma kreftstamceller. PLoS ONE 3 (11): e3769. doi: 10,1371 /journal.pone.0003769
Redaktør: Juha Klefstrom, Universitetet i Helsinki, Finland
mottatt: 11 juli 2008; Godkjent: 02.11.2008; Publisert: 20.11.2008
Copyright: © 2008 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Jialiang Wang er en mottaker av den amerikanske hjernesvulst Association grunnstipend. Annen finansiell støtte ble gitt av barndommen hjernesvulst Foundation, stiftelsen av USA Pediatric hjernesvulst, Accelerate Brain Cancer Cure, Alexander og Margaret Stewart Trust, hjernesvulst Society, Goldhirsh Foundation, Duke Comprehensive Cancer Center Stem Cell Initiative Grant (JR ), gir NIH NS047409, NS054276, og CA116659 (JR). J. R. er en Damon Runyon-Lilly Clinical Investigator støttes av Damon Runyon Cancer Research Foundation og Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research Scholar. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den nye kreftstamcelle modell antyder at svulster er organisert i et hierarki med en undergruppe av kreft stamceller ansvarlig for svulst vedlikehold og progresjon. Cancer stamceller er svært tumorigent og phenocopy de opprinnelige svulster i gnager xenograft modeller. Uttynning av kreft stilk cellepopulasjon hemmer sterkt potensiale til å initiere xenograft tumordannelse av bulk tumorer [1], [2]. Kreft stilk cellepopulasjon bidrar også til en fast tumor angiogenese [3], metastase [4], og resistens mot kjemoterapi og radioterapi [3], [5], [6], [7], [8], [9]. Selv om denne modellen har blitt validert i en voksende liste av hematopoetisk og solide tumorer, de molekylære signalveier iscenesetter biologi av kreft stamceller fortsatt ikke klarlagt.
c-myc oncoprotein har blitt grundig undersøkt for sin instrumental rolle i spredning og vekst av normale og neoplastiske celler. Deregulert c-myc er funnet i ulike humane svulster og er ofte assosiert med fremskreden kreft og dårlig prognose [10]. Som c-myc har nylig blitt anerkjent som en viktig regulator av stamcellebiologi, kan det være et bindeledd koble kreft og «stemness» [11]. I enten normale eller transformerte celler, c-Myc alene aktiverer en embryonal stamcelle-lignende transkripsjonen modul, som sterkt korrelert med tumormetastase og dødelighet [12]. Ektopisk c-Myc-ekspresjon i transformerte humane keratinocytter dramatisk øker kreftstamcellefraksjon og forbedrer tumorigenisitet [12]. Innføring av c-myc med andre transkripsjonsfaktorer (inkludert Oct3 /4, Sox2, og Klf4) genererer indusert pluripotent stilk (iPS-celler) fra differensierte celler [13]. Eksklusive c-myc fra denne kombinasjonen uten å eliminere endogen c-myc uttrykk, drastisk reduserer effektiviteten av iPS celleproduksjon [13], [14], [15], [16]. Mens alle disse dataene tyder på en rolle for c-Myc i å opprettholde stamcellene, har andre funksjoner i c-Myc i regulerende stilk cellebiologi har også blitt beskrevet. Betinget knockout av c-myc i mus beinmarg hindrer ikke spredning eller selvfornyelse av hematopoietiske stamceller [17]. Det heller resulterer i akkumulering av hematopoietiske stamceller i benmargen, noe som tyder på at c-myc styrer spesielt samspillet mellom hematopoietiske stamceller og sine nisjer. I tillegg, over-ekspresjon av c-myc-østrogen reseptor-fusjonsprotein i humane epidermale stamceller stasjoner differensiering i stedet for proliferasjon [18], [19].
På grunn av de anerkjente funksjoner av c-myc i både normal stilk cellebiologi og neural malignitet, undersøkte vi rollen til c-myc i human glioma kreft stamceller. Hjernesvulst er de mest vanlige primære iboende tumortype i sentralnervesystemet. Høy klasse hjernesvulst (World Health Organization karakterer III og IV) er blant de mest dødelige menneskelige maligne [20]. I glioma, korrelerer c-myc uttrykk med karakteren av malignitet [21]. Uttrykk av c-myc drevet av glial fibrillary surt protein (GFAP) -promoter i å utvikle muse astroglia induserer svulster som ligner menneskelig glioblastoma multi [22]. I denne musemodell, inneholder tumormasse hurtig delende subpopulasjoner som uttrykker c-Myc og forholdsvis hvilende tumorceller som mangler c-myc ekspresjonen [22]. Vi har nå fastslått at glioma kreft stamcellene uttrykte høye nivåer av c-myc i forhold til matchede ikke-stilk tumorceller og aktiviteten til c-myc er nødvendig for proliferasjon, vekst og overlevelse av gliom kreft stamceller. Tap av c-myc avskaffet xenograft dannelsen av glioma kreftstamceller, og understreker en viktig rolle c-myc i glioma kreftstamcelle vedlikehold.
Resultater
Glioma kreftstamceller uttrykker høye nivåer av c-myc
for å undersøke de biologiske funksjonene til c-myc i reguleringen av glioma kreftstamceller, vi først bestemt uttrykk for c-myc i disse cellene. Kortsiktige kulturer beriket eller utarmet for kreft stamceller ble avledet fra menneskelig hjerne vevsprøver ved hjelp CD133 utvalg og karakteriseres som vi tidligere har vist [9]. Kvantitativ real-time PCR viste at CD133 + glioma celler uttrykte høyere c-myc mRNA nivåer enn matchet CD133- glioma celler (Figur 1a). De differensial mRNA nivåer i høyere nivåer av c-myc protein i CD133 + glioma celler enn matchet CD133- celler (Figur 1b). I samsvar med tidligere rapporter [23], [24], de kreftstamcelle-beriket fraksjoner også uttrykt høye nivåer av Olig2, en markør for voksne nevrale multipotente stamceller (Figur 1b). For å direkte måle uttrykket av c-myc i humane hjernesvulster, vi evaluert videre c-myc uttrykk ved flowcytometri i begge CD133 + og CD133- fraksjoner av glioma celler akutt isolert fra menneske kirurgiske biopsier uten
in vitro
kultur (figur 1C). Omtrent halvparten av CD133 + celler var høy i c-myc uttrykk, mens nesten 90% CD133- cellene uttrykte lave nivåer av c-myc (figur 1D). Vi videre undersøkt c-myc uttrykk i glioma kreftstamceller bruker deler generert fra akutt frosne menneskelig glioma kirurgiske prøver. Fordi samtidig farging med CD133 var ikke forenlig med antigen hentemetode kreves for c-myc flekker, vi co-farget c-myc med en annen nevrale stamcelle markør nestin. Mer enn 90% av nestin positiv gliomceller ble også c-Myc positive (figur 1E). Disse dataene antyder at c-myc er sterkt uttrykt i glioma kreftstamceller.
(A) CD133- og CD133 + celler ble isolert fra glioma kirurgiske biopsier passert kortsiktig hos immunsupprimerte mus og kort kultivert. Total RNA ble isolert fra både CD133- og CD133 + celler. cDNA ble fremstilt ved revers transkripsjon. Ekspresjon av c-myc ble deretter bestemt ved kvantitativ real-time PCR og normalisert til p-aktin og HPRT1. Relative mRNA-nivåer av c-myc i CD133- celler ble tildelt en verdi på 1. Data er representert som middelverdier ± S.E.M. i dette og alle etterfølgende grafer (#: p 0,001). (B) Totalt cellulære lysater ble løst ved SDS-PAGE. Protein nivåer av c-myc og Olig2 ble bestemt ved immunoblotting. Actin ble utslettet som lasting kontroll. (C) glioma-celler ble isolert direkte fra humane kirurgiske biopsiprøver, fiksert i 4% paraformaldehyd etter dissosiasjon, merket med anti-CD133-APC og anti-c-myc-FITC, og underkastet FACS-analyse. (D) Prosentandel celler som uttrykker høye nivåer av c-myc i enten CD133- fraksjonen eller CD133 + fraksjonen ble demonstrert (#: p 0,001). (E) Deler av ferskt frosset menneskelig glioma kirurgiske biopsier ble fikset og co-farget for c-myc (grønn) og nestin (rød). Kjerner ble kontra med Hoechst 33342. Representative bilder (630 ×) ble demonstrert.
c-myc regulerer cellesyklusprogresjon og spredning av glioma kreftstamceller
c-myc spiller en nøkkelrolle i regulering av cellulær proliferasjon ved å kontrollere ekspresjonen av cellesyklusproteiner. Å avhøre rolle c-myc i cellesyklusen glioma kreftstamceller, målrettet vi c-myc uttrykk av infeksjon med lentivirus uttrykker shRNA spesifikt for c-myc. To forskjellige shRNAs effektivt redusert c-Myc-ekspresjon i både CD133- og CD133 + glioma-celler som vist ved kvantitativ real-time PCR og immunoblotting (figur 2A og 2B). Lignende resultater ble funnet i en annen tumor-prøven (T4597, data ikke vist). Uttømming av c-Myc betydelig redusert S-fasen cellepopulasjonen med samtidig økning av G
0 /G
en cellepopulasjon i CD133 + -celler (p 0,001, figur 3). I motsetning til dette, CD133- celler viste en lavere rate av spredning med en mindre S-fasen befolkning enn passet CD133 + celler (figur 3 og data ikke vist), og cellesyklusprogresjon i CD133–celler ble ikke signifikant endret ved knockdown av c-Myc . Regulering av cellesyklus ved c-Myc er ofte mediert via transkripsjonell regulering av cykliner og den cyklin-avhengige kinase-inhibitorer, inkludert cykliner D
1, D
2, og E og p21
WAF1 /CIP1 [26], [27] (https://www.myc-cancer-gene.org). Demping av c-myc ekspresjonen spesifikt redusert cyklin D
en proteinnivåer, men ikke cykliner D
2 eller E, i CD133 + -celler (figur 2B). I tillegg ble p21
WAF1 /CIP1 protein nivåer oppregulert i kreftstamceller utarmet av c-myc, mens p53 nivåer ble bare moderat endret (figur 2B). Kvantitativ real-time PCR viste et lignende mønster av cyclin D
1 og p21
WAF1 /CIP1 regulering på mRNA-nivåer av c-myc i CD133 + -celler, noe som tyder på c-Myc reguleres disse to genene på nivået av transkripsjon. I slående kontrast, cyclin D
1 og p21
WAF1 /CIP1 ble minimalt endret av banket ned c-myc på enten mRNA eller protein nivåer i CD133- celler. Spesielt, basal cyklin D
1-nivåer høyere i CD133 + celler enn passet CD133- celler, mens cyklin D
2 og cyclin E-nivåer høyere i CD133- celler, hvilket antyder at cyklin D
1, men ikke cykliner D
2 eller E, er kritisk for G
1 /S overgang i CD133 + glioma celler. Tatt sammen tyder disse resultater på at c-Myc regulerer cellesyklusprogresjon i glioma kreft stamceller, i det minste delvis, gjennom å kontrollere ekspresjon av cyclin D
1 og p21
WAF1 /CIP1.
( a) Tidlig passasje ( P5) T3359 glioblastom CD133- eller CD133 + celler ble smittet av lentivirus regi uttrykk for enten ikke-måls shRNA (NT) eller c-myc spesifikke shRNAs (sh-en og sh-2). De mRNA nivåer av c-myc, p21
WAF1 /CIP1, cyclin D
1 (cycD1) og cyclin D
2 (cycD2) ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR 3 dager etter smitte. (B) Protein nivåer av c-myc, p53, cyclin D
1, cyclin D
2, cyclin E og p21
WAF1 /CIP1 ble bestemt ved immunoblotting.
(A, B) Tidlig passasje ( P5) T3359 glioblastom CD133- eller CD133 + celler ble smittet av lentivirus regi uttrykk for enten ikke-måls shRNA (NT) eller c-myc spesifikke shRNAs (sh-en og sh-2). Tre dager etter infeksjon, ble cellene fiksert i 75% etanol og merket med 10 ug /ml propidiumjodid. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved flow-cytometri. (A) Dataene ble samlet inn tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; #, P 0,001 med en-veis ANOVA sammenligning av kontrollgruppene til de tilsvarende c-myc knockdown grupper. (B) representitive FACS plott vises. M1-sub G
0 fase; M2-G
0 /G
1 fase; M3-S fase; M4-G2 /M-fasen.
Tidligere rapporter vist at hjernesvulst stamceller isolert fra menneske kirurgiske biopsier var aktivt proliferativ
in vitro product: [28], [29], men antall matchet CD133- kreftceller knapt økt etter en uke med kultur. Våre data at den relativt høye ekspresjon av c-myc in glioma kreft stamceller er avgjørende for deres cellesyklusregulering tyder på at veksten av disse celler kan også kreve c-Myc-aktivitet. Som demonstrert ved vekstkurve analyser, det totale antall styre CD133 + -celler økte omtrent seks eller syv ganger i løpet av fem dager, mens CD133 + -celler tømt for c-Myc ikke øker eller reduseres i antall (figur 4). Omvendt, vekst av CD133- populasjonen var bare moderat svekket med c-Myc knockdown (figur 4). Disse resultater antyder at c-Myc bidrar fortrinnsvis til vedvarende vekst av tumorceller initierende.
(A) T3359, (B) T3832, og (C) T4597 CD133- og CD133 + celler ble isolert og infisert som beskrevet. Cellene ble deretter sådd ut i 96-brønners plater i triplikat ved 5000 celler per brønn for CD133- celler eller 1000 celler per brønn for CD133 + celler. Totalt levedyktige celler ble deretter bestemt av CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet Assay (Promega) daglig. *, P 0,05; #, P. 0,001 med en-veis ANOVA sammenligning av kontrollgruppene til de tilsvarende c-myc knockdown-grupper på den samme dag
Tap av c-Myc induserer apoptose i cancer gliom stamceller
c-myc regulerer ikke bare mobilnettet spredning, men også mobil overlevelse. I samsvar med en rolle med hensyn til overlevelse, ble det registrert en opphopning av døde celler i CD133 + fraksjon utarmet på c-myc ekspresjonen i løpet av vekstkurven eksperimentene som ikke var tilstede i kontroller (data ikke vist). Omvendt var indikasjoner på celledød begrenset i passet CD133- celler, uavhengig av c-myc-status, noe som tyder på at tapet av c-Myc kan spesifikt induserer apoptose i CD133 + -celler. Rollen til c-myc i regulering av apoptose er fortsatt kontroversielt. Tidligere rapporter har vist at c-Myc fremmer apoptose i cancercellelinjer og forskjellige normale celletyper, mens nedregulering av c-Myc også fører til apoptose under visse omstendigheter [30], [31], [32], [33]. For å skille den anti-apoptotiske eller pro-apoptotiske rollen til c-myc in glioma kreft stamceller, kvantifisert vi apoptotiske cellepopulasjoner etter knockdown av c-Myc. Annexin V-farging viste at uttømming av c-Myc indusert apoptose i CD133 + glioma celler, mens kontroll CD133 + -celler inneholdt en minimal apoptotisk populasjon (figur 5A, C). I motsetning til dette CD133- befolkning hadde bare bakgrunnsfarging av Annexin V uavhengig av c-myc nivåer. I samsvar med disse data ble den kombinerte caspase 3/7 aktivitet forhøyet i CD133 + celler etter c-Myc knockdown, men ikke i passet CD133–celler (Figur 5B, D). Samlet utgjør disse data tyder på at c-myc er en overlevelsesfaktor for glioma kreftstamceller.
(A, B) T3359 og (C, D) T4597 CD133- og CD133 + celler ble isolert og infisert som beskrevet . (A, C) Seks dager etter infeksjon, ble cellene trypsinert og kvantifisert for apoptose ved hjelp av Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (Calbiochem). Prosentandelen av FITC-positive celler ble bestemt ved FACS-analyse, og døde celler ble utelukket ved propidiumjodidfarging. (B, D) Disse cellene ble også utplatet i 96-brønners plater ved 5000 celler per brønn for CD133- celler og 1000 celler per brønn for CD133 + celler etter infeksjon og seleksjon. Seks dager etter infeksjonen ble det kombinerte aktiviteter av kaspase 3 og kaspase 7 bestemmes av Caspase 3/7 Luminescence Assay kit (Promega), og ble normalisert av levedyktige celler bestemt ved de CellTiter-Glo assays som beskrevet i figur 4. * , p. 0,05 med enveis ANOVA sammenligning av kontrollgruppene til de tilsvarende c-myc knockdown grupper
Tap av c-myc svekker neurosfære dannelsen av glioma kreftstamceller
Deling av visse viktige egenskaper ved normale stamceller, kreft stamceller er i stand til selvfornyelse, som tillater vedvarende opprettholdelse av denne undergruppe og utvidelse av hele tumoren. Serial neurosfære formasjon analysen har blitt benyttet som et surrogat til selvfornyelse kapasitet av nevrale stamceller [34], og er nylig anvendt i de hjernetumor stamceller [9], [28]. I primær neurosfære formasjons analyser, ble ca 15% av kontroll CD133 + celler dannet neurosfærer, mens svært få kuler dannet av celler utarmet av c-myc (Figur 6A). Neurosfærer utviklet i 100% av brønnene i kontrollgruppen når sådd ut ved en tetthet på 100 celler /brønn, og i 80-85% brønner når sådd ut på 10 celler /brønn (figur 6B). I motsetning til dette ble neurosfærer dannet av celler utarmet av c-myc-ekspresjon i bare 10% (shRNA-1) eller 30% (shRNA-2) av brønner når platet ved en tetthet på 100 celler /brønn, mens ingen sfærer ble funnet når disse cellene ble platet på 10 celler /brønn. Av notatet, neurosfærer dannet av celler med redusert c-myc uttrykk var betydelig mindre enn kulene dannet av kontrollceller (figur 6C) og bare svært møtte de minstekrav som skal scores i våre eksperimenter. Mangel på neurosfærer dannet av glioma kreftstamceller utarmet av c-myc antyder svekket selvfornyelse. Imidlertid vurdere sekundær neurosfære dannelse ble utelukket fordi meget få sfærer ble samlet i knockdown gruppene i den primære analysen og neurosfærene hadde begrenset levedyktighet. Disse studiene derfor ikke kunne definitivt fastslå om c-myc uttrykk er nødvendig for selvfornyelse av glioma kreftstamceller. Imidlertid er det forventet at selvfornyelse av glioma kreft stamceller blir inhibert av knockdown av c-Myc, basert på våre observasjoner at gliom kreft stamceller ikke klart å proliferere og gjennomgikk apoptose ved knockdown av c-Myc.
(A) T3359 CD133 + celler ble infisert med lentivirus og utvalgt som beskrevet. Cellene ble deretter sådd ut på 100 eller 10 celler pr brønn i 24-brønners plater i nærvær av 1 ug /ml puromycin. Åtte brønner ble sådd ut for hver gruppe. Tallene for neurosfærer i hver brønn ble bestemt i syv dager. Kuler som inneholdt mer enn 20 celler ble scoret. (B) Prosent av brønner uten neurosfærer dannet ble kvantifisert. #, P 0,001 med en-veis ANOVA sammenligning av kontrollgruppene til de tilsvarende c-myc knockdown grupper. (C) Representative bilder av neurosfærer dannet av celler som uttrykker ikke-måls shRNA eller c-myc spesifikke shRNA (barer = 50 mikrometer). (D, E) Lignende resultater ble demonstrert i T4302 CD133 + celler.
knockdown av c-myc hemmer tumorigent potensialet for glioma kreftstamceller
Basert på kravet om c- myc-aktivitet for cellesyklusprogresjon, vekst og overlevelse, av CD133 + glioma celler i kultur, undersøkte vi rollen til c-myc-ekspresjon i sitt karsinogent potensial. CD133 + glioma celler ble infisert med ikke-måls kontroll lentivirus eller lentivirus uttrykker c-myc shRNA. Etter puromycin utvalg, ble 5000 celler av hver gruppe injisert inn i hjernen til naken mus i fire eksemplarer. 100% av mus med kontrollceller raskt utviklet nevrologiske tegn og viste store svulster på histopatologi består av pleomorphic celler med høy kjernefysisk til cytoplasma ratio, fremtredende nucleoli med minimal cytoplasma, rask mitotisk aktivitet og sentral geografisk nekrose, i samsvar med en høy grad av glial malignitet ( Figur 7). I motsetning til dette ingen mus injisert med celler utarmet av c-myc uttrykk utviklet tegn og etter 100 dager viste ingen tegn på neoplastiske celler (figur 7). Således synes c-Myc å være avgjørende for kreft stamceller til å danne svulster.
(A) T3359 CD133 + celler ble infisert og utvalgt som beskrevet. Etter seleksjon, ble celler injisert i hjernene til atymiske BALB /c nu /nu mus (5000 celler per mus). Fire mus ble injisert for hver gruppe. Mus i kontrollgruppen ble avlivet på utviklingen av nevrologiske tegn. Alle mus med c-myc knockdown glioma celler ikke utvikler nevrologiske tegn og ble avlivet etter 100 dager uten tegn på svulst. Kaplan-Meier-overlevelseskurver vises. (B) Representative bilder av hematoxylin og eosin farging av intrakranielle xenografttumorer (10 ×). (C) Xenotransplantat vev av kontrollgruppen består av pleomorphic celler med høy atom til cytoplasmiske forhold, fremstående nucleoli med minimal cytoplasma, livlig mitotisk aktivitet og sentral geografisk nekrose (stjerne, 600 x). (D) Kontroll glioma xenograft utstilt fokusområder bedre differensierte tumorceller med relativt mer eosinofil cytoplasma og celler med eksentriske cytoplasmatiske profiler som tyder på en gemistocytic utseende (piler, 400 ×). (E) Xenotransplantat svulst i kontrollgruppen oppviser infiltrering av tumorceller inn i det omgivende hjernevevet langs margen. Den mitotisk aktive (pilspiss) infiltrerende tumorceller utviser høy kjernefysisk til cytoplasma ratio og langstrakt fibrillar cytoplasma (pil) (600 ×). (F) Mouse hjernen injisert med T3359 celler som uttrykker c-myc shRNA viste ingen tegn på svulst på nålen injeksjonsstedet (piler, 200 ×).
Diskusjoner
kreft stammen celle hypotese har skapt betydelige kontrovers, men tilstedeværelse av heterogeniteten av tumorceller ved noen kreftformer er vel anerkjent. Tumorceller som viser stamcelle-lignende egenskaper og initiere xenograft tumorer har blitt renset fra et økende antall kreftformer, inkludert leukemi [35], [36], hjerne [28], [29], bryst [37], kolorektal [38 ], [39], bukspyttkjertel [40], og hode og nakke kreft [41]. Disse kreftstamceller er funksjonelt definert gjennom analyser av selvfornyelse og serie xenotransplantasjon analyser i gnagermodeller. Eksperimenter viser at karsinogent potensial av kreft stamceller er minst flere størrelser høyere enn bulk tumorer. For eksempel, gliom kreft stamceller anriket ved valg av CD133 overflateantigenet danner ortotopisk xenografttumorer med 500 celler i atymiske nakne mus, mens 2 x 10
6 CD133- celler kan ikke [9]. I tråd med den potente tumorigenisitet av hjernesvulst stamceller, vi demonstrert her at CD133 + gliom kreft stamceller høyt uttrykt i c-Myc oncoprotein. FACS-analyse viste at minst halvparten av CD133 + -celler akutt dissosiert fra humane kirurgiske biopsiprøver hadde høye nivåer av c-Myc, mens mesteparten (mer enn 85%) av CD133- celler ble c-Myc-lav (figur 1D). Lignende co-uttrykk for c-myc og en stamcelle markør, nestin, ble identifisert direkte på menneske kirurgisk biopsi prøven seksjoner (figur 1E). Spesielt, glioma kreft stamceller som uttrykker c-Myc shRNA likevel beholdt gjenværende nivåer av c-Myc-proteinet (figur 2B, kolonnene 5 og 6) som var høyere enn de c-myc nivåene funnet i CD133- celler som uttrykker ikke-målsøkende shRNA (figur 2B, kolonne 1). Ikke desto mindre, er reduserte nivåer av c-Myc ikke var i stand til å understøtte proliferasjon, vekst, overlevelse, og tumorigenesis av gliom kreft stamceller. En fersk musemodell for T-celle lymfom ved å bruke betinget uttrykkes c-Myc antyder også at visse terskelnivå på c-myc er nødvendig for å opprettholde den tumor-fenotypen [42]. Kollektivt, resultatene markere en nødvendig forutsetning for høy c-myc uttrykk i glioma kreftstamceller.
Cancer stamceller har blitt foreslått som sakte sykling celler, som sine somatiske stamceller kolleger [43]. Raske utvidelsen av svulster er da avhengig av rask dele stamceller. Den langsomme cellesyklus kan gi kreft stamceller en beskyttende mekanisme mot visse terapeutiske tilnærminger som er rettet mot rask voksende celler. For eksempel, i human akutt myelogen leukemi, de hvilende stamcellene leukemi er resistente overfor kjemoterapi-medikamenter som er avhengig av cellesyklus [44]. Likevel kan karakteristikker av kreft stamceller ikke nødvendigvis ensartet på tvers av ulike krefttyper, og biologi av kreft stamceller kan endre hele ulike stadier av svulst utvikling. I hjernesvulster, Singh og medarbeidere første gang påvist at bare CD133 + kreftstamcelle befolkningen sprer
in vitro
når akutt isolert fra menneske kirurgiske biopsier [28], [29]. Disse resultatene var tilsvarende de svært proliferative kreft stamceller som ble karakterisert ved en RAS-indusert sebrafisk embryonalt rhabdomyosarkom [45]. I denne studien, fant vi ut at de CD133 + glioma celler inneholdt en høyere prosentandel av S fase celler og vokste raskere
in vitro
enn matchet CD133- celler (figur 3 og 4). Vi fant også at proliferasjon og vekst av kreft gliom stamceller ble alvorlig svekket ved knockdown av c-Myc, men viktigere, cellesyklusprogresjon av CD133- glioma celler var relativt ufølsomme for tap av c-Myc. Transkripsjons programmer som reguleres av c-myc fortsatt dårlig definert og avhenger av batteritilstand [26], [46], men inkluderer induksjon av cyclin D
1 [47] og undertrykkelse av p21
WAF1 /CIP1 cyclin- avhengig kinase inhibitor [48], [49]. Gjennomgående ekspresjon av cellesyklus regulatorer nedstrøms av c-Myc, inkludert p21
WAF1 /CIP1 og cyklin D
1, ble endret i glioma kreft stamceller følgende c-Myc knockdown, men ikke i CD133- cellene. Disse data avdekke en spesifikk rolle i c-Myc og nedstrøms målgener i regulering av proliferasjon og vekst av CD133 + gliom kreft stamceller.
apoptose kan induseres ved avvikende ekspresjon av visse onkogener, for eksempel c-Myc og E2F1, som kan virke som en «fail-safe» mekanisme for å eliminere potensiell cellulær transformasjon [33], [50]. Apoptose indusert ved c-Myc kan mediert gjennom aktivering av ARF-MDM2-p53 vei, eller ved aktivering av død-reseptorer, slik som CD95 /Fas [33]. Imidlertid er dereguleringen av c-Myc vanlig i humane tumorer, og er en indikator på dårlig prognose fordi tumorer er godt utstyrt med forskjellige anti-apoptose-mekanismer som kan nøytralisere den apoptotiske trykket introdusert av c-Myc. Tumorgenese i c-myc transgene musemodeller akselereres hvis den kombineres med andre anti-apoptose genetiske endringer, for eksempel overekspresjon av Bcl-2 [51] eller Bmi1 [52], eller forstyrre ARF-MDM2-p53 veien [53]. Videre har det vært direkte demonstrert at vedvarende c-Myc-aktivitet er nødvendig for tumor vedlikehold i en rekke betinget transgene musemodeller. Disse modellene viser at inaktivering av c-myc nesten uunngåelig resulterer i tumor regresjon uavhengig av tumor type med samtidig veksthemming, differensiering og apoptose (anmeldt i [54]). I noen tilfeller, slik som osteosarcom [55] og hud-tumorer [56], kort inaktivering av c-myc er tilstrekkelig til å indusere forlenget tumorregresjon. Imidlertid kan det avhengighet av c-Myc være tumor-typespesifikk. I visse betinget transgene modeller, reaktivering av c-Myc etter forbigående avbrudd gjentumorvekst [57], som kan innebære aktivering av hvilende kreft stamceller. Alternativt kan svulster tilbakefall i en del av dyrene selv i fravær av c-Myc-aktivitet, hvilket antyder at kreften stamceller kan ha samlet seg flere mutasjoner for å kompensere tapet av c-Myc [58], [59], [60]. Den vedvarende tumorregresjon kan være forbundet med fullstendig utrydding av kreft stamceller etter inaktivering av c-Myc, mens kreft stamceller kan overleve og /eller rømme c-Myc avhengighet i vendende tumorer. Vår undersøkelse viste en markert induksjon av apoptose etter c-Myc knockdown i kreftstamcellepopulasjonen (figur 4), og kreft stamceller tømt for c-myc ekspresjonen ikke klart å utvikle ortotopiske xenograft tumorer i nakne mus (figur 6). Av særlig interesse, overlevelse av de ikke-stammen glioma-celler var ikke avhengig av vedvarende ekspresjon av c-myc. Ved en rekke nyere studier i andre cancermodeller, rettet mot c-myc ekspresjonen nedsatt cellulær proliferasjon og indusert begynnende alderdom [61], [62], [63]. Disse modellene kan representere resultatet av tap av c-myc i mer homogene kreftcellepopulasjoner, spesielt genmodifisert modeller drevet av overekspresjon av c-myc. Vår studie har viktige implikasjoner som målgruppe c-myc har unike fordeler spesifikke cellulære avdelinger i modeller som representerer cellulær heterogenitet. Selv om målretting c-myc var tilstrekkelig til å hindre tumorvekst i våre studier, de dikotome virkningene av c-myc hemming som vi har oppdaget kan støtte behovet for å samtidig målrette de ikke-stamcelle svulstpopulasjonene å oppnå klinisk effekt. Dermed c-myc som molekylære mål skje med raffinement som flertallet av kreftceller kan demonstrere døgnbehandlingstiltak, men en kritisk svulst befolkningen – de kreftstamceller – kan hemmes eller drepes for å forbedre den generelle tumorkontroll og redusere motstand mot andre behandlinger.
