Abstract
Bakgrunn
histondeacetylase hemmere (HDACis) re-express forstummet tumorsuppressorgener og er for tiden under kliniske studier. Selv HDACis har vært kjent for å indusere genekspresjon, er like mange gener downregulated på HDAC hemming. Mekanismen bak dette downregulation fortsatt uklart. Her gir vi bevis for at flere DNA-reparasjonsgener er nedregulert av HDAC hemming og gi en mekanisme som involverer E2F1 transkripsjonsfaktor i prosessen.
Metodikk /hovedfunnene
Bruk Analyse av Functional Merknad (AFA ) på microarray data av prostata kreft celler behandlet med HDACis, fant vi en rekke gener i DNA skade respons og reparasjon trasé blir nedregulert av HDACis. AFA avslørte anrikning av homolog rekombinasjon (HR) DNA-reparasjonsgener i BRCA1 reaksjonsveien, så vel som gener som reguleres av E2F1 transkripsjonsfaktor. Prostata kreft celler viste en redusert DNA-reparasjon kapasitet og økt overfølsomhet mot kjemikalie- og radio-DNA skadelige stoffer ved HDAC hemming. Rekruttering av nøkkel HR reparasjon proteiner til området av DNA-skade, samt HR reparasjon kapasiteten ble kompromittert på HDACi behandling. På grunnlag av våre AFA data, hypotese vi at E2F-transkripsjonsfaktorer kan spille en rolle i den nedregulering av nøkkelreparasjonsgener ved HDAC-inhibering i prostatakreftceller. ChIP analyse og luciferase analysene viser at nedregulering av viktige reparasjonsgener er formidlet gjennom redusert rekruttering av E2F1 transkripsjonsfaktor og ikke gjennom aktiv undertrykkelse av undertrykkende E2Fs.
Konklusjon /Betydning
Vår studie indikerer at flere gener i DNA-reparasjon veien er berørt på HDAC hemming. Nedregulering av reparasjonsgener er på grunn av en nedgang i mengde og formidler rekruttering av E2F1 transkripsjonsfaktor. Siden HDAC effekten påvirker flere veier som potensielt kan ha en innvirkning på DNA-reparasjon, kunne kompromittert DNA-reparasjon på HDAC hemming også tilskrives flere andre veier enn de som er undersøkt i denne studien. Men gjør vår studie gir innsikt i mekanismen som styrer nedregulering av HR DNA reparasjonsgener på HDAC hemming, noe som kan føre til begrunnelsen bruk av HDACis på klinikkene
Citation. Kachhap SK, Rosmus N, Collis SJ , Kortenhorst MSQ, Wissing MD, Hedayati M, et al. (2010) nedregulering av homolog rekombinasjon DNA reparasjonsgener ved HDAC Hemming i prostatakreft er mediert gjennom E2F1 transkripsjonsfaktor. PLoS ONE 5 (6): e11208. doi: 10,1371 /journal.pone.0011208
Redaktør: Kerstin Borgmann, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 17 mars 2010; Godkjent: 25 mai 2010; Publisert: 18 juni 2010
Copyright: © 2010 Kachhap et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet er støttet av Flight Attendant Medical Research Institute, David Koch Fund som ble gitt av Prostate Cancer Foundation, Prostate Cancer Foundation Grant, Specialized Program for forskning Excellence Grant P50-58236, og AEGON. MDW støttes av Dr. Saal van Zwanenberg Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetisk regulering av genekspresjon er antatt å være forårsaket av både kromatin modulatorer som kan modifisere N-terminale hale av histoner og DNA-metylering av enzymer som metylat CpG klynger i promotorområdene av eukaryotiske genomer [1], [2- ], [3]. Kreftceller modulere epigenetisk maskiner til taushet tumor og metastatisk dempere for å få selektiv vekst og invasive egenskapene [4], [5], [6]. Den HDAC klasse I og klasse II enzymer danne komplekser med co-repressors som Nurd og SMRT /NCoR komplekser [7]. Kreftceller, inkludert prostata cancer (PCA), rekruttere forskjellige HDACs forbundet med disse store multiprotein ko-repressor-komplekser for å dempe tumorsuppressorgener, og denne tjener som en begrunnelse for bruk av HDACis for å behandle kreft [8], [9] .
aktiviteten av både klasse i og klasse II HDACs inhiberes av kortkjedede fettsyrer (fenylbutyrat, Valproinsyre (VPA)) og hydroksamsyrer (Vorinostat, Trichostatin A), mens benzamider (MS-275) ser ut til å være spesifikk for klasse i HDACs [8]. Omvendt, klasse III HDACs, er sirtuins, blir ikke hemmet av noen av disse midler [10]. Nylig Vorinostat har blitt godkjent av FDA for behandling av kutan T-celle lymfom. Vi og andre har vist at behandling av PCa med HDACis eller DNA metyltransferase hemmere avlaster undertrykkelse, forårsaker reexpression av forstummet tumor suppressors fører til cellesyklus arrest, alderdom og apoptose [11], [12], [13]. Kombinasjonen av HDACis med andre midler som har vist seg å være effektiv for et bredt spekter av cancere. Selv om HDACis har vært kjent for å oppregulere en rekke gener, er paradoksalt nok et likt antall gener trykt på HDAC-inhibering [14], [15], [16]. Undertrykkelse av gener ved HDAC hemming kan være et resultat av indirekte handlinger repressors som aktiveres og forårsake undertrykkelse i en HDAC passiv måte, eller undertrykkelse kan være forårsaket av aktiv rekruttering av HDACs til arrangører av utvalgte gener [17]. Trasé som er nedregulert ved HDAC hemming lage innstillinger for behandlingsmetoder som er ineffektive i deres nærvær. Nylige rapporter antyder at HDACis som fenylbutyrat, VPA, MS-275 og Saha kan potensere strålesensitivitet av kreftceller [18], [19], [20], [21]. Transcriptional nedregulering av visse gener som er involvert i den homologe rekombinasjon (HR) og ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) DNA-reparasjonsbaner har vært implisert [18], [19], [20], [22].
dobbel trådbrudd (DSB sin) kan være forårsaket av endogene stoffer slik som reaktive oksygenforbindelser og replikering stress ved fastlåste replikering gafler, eller kan være forårsaket av eksogene agenter som ioniserende stråling [23]. Det er i økende grad tydelig at DNA-skade blir avfølt av proteinkomplekser, betegnet DNA-skade sensorer, som i sin tur induserer en signaltransduksjon kaskade som rekrutterer mediator og effektor-proteinene til de skadede områder, som fører til reparasjon av DNA [24]. Avhengig av omfanget av skaden, varsler ytterligere signaloverføring i cellen til enten å utsette cellesyklus gjennom sjekkpunktet aktivering for reparasjonsprosesser for å fullføre, eller gjennomgår apoptose [24]. Hver type DNA-skade registreres og repareres av forskjellige DNA reparasjon veier. Den MRN kompleks, bestående av Mre11-Rad50-NBS1 mekler kompleks, sanser DSB sin og rekrutterer minibank, PI3K-lignende kinase, til stedet av DSB sin [25]. ATM er aktivert etter rekruttering til DSB sin og fosforylerer nedstrøms underlag, initiere signaltransduksjon prosessen [26].
ATM og relaterte kinaser, ATR og DNAPK, fosforylere en histon variant γ-H2AX på Ser-139 som laster til områder av DSB sin og dekker megabases flankerer DSB sin; dette utgjør bestrålingsinduserte foci. Fosforylerte γ-H2AX rekrutterer flere mediator proteiner [27]. Blant disse meglere er BRCA1 assosiert overvåking kompleks og 53BP1. Den signaltransduksjon kaskade blir ytterligere forsterket av svinger sjekkpunkt kinaser, CHK1 og CHK2, som aktiveres ved fosforylering av ATM og ATR. ATM og ATR sammen med CHK1 /CHK2 kinaser fosforylerer en rekke effektor underlag som inkluderer BRCA1, Rad51, p53, og MDM2 [28]. Fosforylering av p53 fører til stabilisering sin, forårsaker en cellesyklus-stans ved induksjon av p21, eller i tilfelle av større DNA-skade, apoptose. Stall replikering gafler som oppstår på grunn av DNA skade og replikering stresset, blir registrert av PCNA relatert Rad9-Rad1-Hus1 eller 911-komplekset, som rekruttering til fastlåste nettstedet er mediert av replikering protein A og ATR. Den endelige effektor-proteiner som reparere den skadede DNA blir aktivert og rekruttert av de ovennevnte kinaser og mediator-proteiner til området for skade og reparasjon følger.
Gener av DNA-reparasjons veier er strengt regulert både på transkripsjons og legge transkripsjonsnivået. På transkripsjonsnivået, har E2F transkripsjonsfaktorer er kjent for å spille en rolle i regulering av reparasjons proteiner. Det er ni kjente E2F transkripsjonsfaktorer som kan deles inn i transkripsjonsaktivatorer (E2F1, E2F2, E2F3a) og repressors (E2F4-8); E2F3b er antatt å fungere som en repressor [29]. E2F1 og E2F4 har vært innblandet i reguleringen av CHK1, BRCA1 og RAD51 gener [30], [31], [32].
Nylig rapporterte vi en roman «multiple-loop, double-cube» cDNA microarray design, for å analysere HDAC hemmer induserte endringer i genuttrykk over følsomme og resistente PCA cellelinjer [16]. Søknad Analyse av Functional Merknad (AFA) på datasettet fra ovenstående microarray eksperiment fant vi at flere gener av HR reparasjon og DNA-skade svar pathway er nedregulert på HDAC hemming. I denne rapporten viser vi transcriptional nedregulering av flere DNA skade responsgener i PCA celler ved HDAC hemning, gi funksjonell bevis for involvering av HR reparasjon veien i nedsatt DNA-reparasjon, og gir en rolle E2F1 transkripsjonsfaktor i nedregulering av DNA skade responsgener.
Resultater
AFA avslører HDACis downmodulate flere gener i DNA skader og respons sti ved PCA
AFA ble utført på vår nylig publisert microarray data sett to PCA cellelinjer (PC3 og DU-145) behandlet med vorinostat (tidligere kjent som Saha) og VPA [16]. Analysen viste nedregulering av flere gener som er involvert med DNA-skade og reparasjon respons (tabell 1). Protein-protein interaksjon analyse på microarray data avdekket flere gener knyttet til E2F1 og BRCA1 trasé ble nedregulert med begge HDACis mer enn 1,3 ganger i begge PCA cellelinjer (Fig. 1a). Mange av disse downregulated gener er involvert i HR DNA reparasjonsveien. Overraskende, NHEJ pathway relaterte gener, spesielt DNAPK og Ku, ikke ble berørt i våre rekker. Tidligere rapporter har vist at RAD51 blir nedregulert ved HDAC-inhibitor behandling i en rekke cellelinjer [18], [19], [20]. Vår microarray data viste at i tillegg til Rad51 og beslektede gener, et bredt utvalg av gener som er involvert i DNA-skade respons og reparasjon svei slik som BRCA1, Chk1, Topo IIα, Hus1, og Bubr1, ble nedregulert ved HDAC-inhibitor behandling (Fig. 1b) .
a) DU145 og PC3 cellene ble behandlet med to forskjellige HDACis (vorinostat (Saha, en mm), og VPA (valproinsyre, 1 mm) for ruge perioder (2 dager og 4 dager). AFA avslører ned- regulering av gener involvert med DNA-skade og respons (se tabell 1). AFA resultater for protein-protein interaksjon indikere BRCA1 og E2F samhandlende nettverk påvirkes av HDAC hemming. Fargekode kode~~POS=HEADCOMP representerer som 10
-n
p-
verdier hentet fra Wilcoxon rank-sum test. b) DNA-reparasjonsgener downregulated ≥1.3 fold i både PC3 og DU-145 celler ved behandling med både VPA og vorinostat. c) Validering av AFA ble gjort av en Q-PCR-analyse på en undergruppe av gener nedregulert på 1,5 mM VPA behandling. Resultatene er avbildet som fold endring over ubehandlede kontrollceller.
For å forstå konsekvensen av downmodulation og få mer innsikt i mekanismen bak downmodulation, vi spilte videre analyse ved hjelp av to PCa celle linjer (DU-145 og LnCap) ved hjelp av HDAC-inhibitoren VPA. For å validere våre microarray data, utførte vi en Q-PCR-analyse på en undergruppe av reparasjonsgener. Våre data viser at alle de genene som ble testet ble nedregulert i begge cellelinjene, bortsett fra Hus1 som ble nedregulert bare i LNCaP-celler (Fig. 1c). BRCA1, Rad51 og Chk1 er kjent for å bli regulert av transkripsjonsfaktoren E2F [30], [31]. Siden AFA avslørt berikelse for downmodulation av E2F1 målgener, inkludert E2F1 selv, undersøkte vi karakternivået både aktivator (E2F1) og repressor E2F (E2F4 og 6) transkripsjonsfaktorer. Våre resultater viser at E2F1 var signifikant nedregulert i begge cellelinjene som ble behandlet med VPA, mens repressor E2Fs ble ikke påvirket i noen av cellelinjer ved VPA behandling (Fig. 1c).
Downmodulation av DNA-reparasjonsgener ved HDAC inhibering fører til en økt sensitivitet av PCA-celler til DNA-ødeleggende midler
Tidligere rapporter fra vår gruppe, og andre har vist at HDACis som VPA kan redusere proliferasjon av prostata kreftceller [11], [16]. HDACis har også vært kjent for å virke som radiosensibiliserende [18], [19], [20]. Vi antok at downmodulation av DNA-reparasjonsgener ved HDAC hemming vil føre til en økt følsomhet for ulike DNA-skadelige stoffer. DU-145-celler ble underkastet klonogene overlevelsesanalyser etter behandling med en kombinasjon av HDACis og forskjellige midler som induserer DSB som stråling, cisplatin og hydroksyurea. En Radiosensitivity klonogene Analysen ble utført med stigende doser av VPA i nærvær av en økende dose av stråling. Som forventet, VPA gjorde radiosensibilisere DU-145-celler, og det var en økning i følsomhet med økende doser (Fig. 2a). Nylig er det blitt vist at en mangel ved homolog rekombinasjon kan føre til endringer i medikamentsensitivitet profil, slik at BRCA1 mangelfulle brystcancere følsomme for mitomycin C, cisplatin, etoposid og andre medikamenter som produserer dobbelt-trådet lesjoner [33]. Vi hevdet at dette kan være sant for HDACi behandlet PCA celler, hvor det er en nedgang i BRCA1 pathway relatert genuttrykk. Klonogene analyser som utføres etter behandling av DU-145-celler med VPA alene eller i kombinasjon med cisplatin og hydroksyurea, viste at sammenlignet med en monoterapi, kombinasjonen av VPA med enten hydroksyurea eller cisplatin sterkt redusert klonogene overlevelses (fig. 2b og c) .
a) klonogene analysen ble utført i DU-145 etter behandling med forskjellige doser av VPA i 48 timer før bestråling med forskjellige doser av stråling. Øverste panel viser representative klonogene plater med 0Gy og 4 Gy stråle Grafen nedenfor skildrer overlevende brøkdel etter VPA behandlinger og bestråling. Feil stolpe representerer standardavvik av tre uavhengige forsøk. b) klonogene analyse utført på DU-145-celler ble behandlet med 1,5 mM VPA og cisplatin (100 nM og 250 nM) i 48 timer. Feil stolpe representerer standardavvik. c) klonogene analyse utført på DU-145-celler ble behandlet med 1,5 mM VPA og hydroksyurea (0,5 mM og 1 mM) i 48 timer. Feil stolpe representerer standardavvik.
HDAC hemming av VPA fører til en reduksjon i DNA reparasjon proteiner av HR og DNA Damage Response pathway
Følsomhet for ulike DNA-skadelige stoffer på HDAC hemming kan være et resultat av nedsatt eller vernepleier DNA-reparasjon evne i behandlede celler. Dette kan være forårsaket av nedregulering av DNA-reparasjonsgener på HDAC hemming. Bestrålingssensibilisering av HDACis har vært knyttet til en reduksjon i Rad51 genekspresjon i PCa [20]. Hvis du først teste om VPA fører til en reduksjon i dobbel tråd pause DNA-reparasjon kapasitet på PCA celler vi utført en nøytral komet analyse for å vurdere for DNA reparasjon evne prostatakreftceller på HDAC hemming [34], [35]. Under forsøksbetingelsene brukt, fant vi ikke noen statistisk forskjell i halen øyeblikk av VPA behandlede og ubehandlede kontrollceller uten stråling. Imidlertid, i fravær av VPA behandlings celler eksponert til 4 Gy av bestråling var i stand til å reparere de fleste av deres ødelagte DNA i 4 timer. Men etter VPA behandling både prostatacellelinjer viste signifikant høyere hale øyeblikk 4 timer etter eksponering til 4 Gy av bestråling som tyder på redusert DNA-reparasjon kapasitet (fig. 3a). For å avgjøre om DSB reparasjon er kompromittert på HDAC hemming, ansatt vi H2AX klaring foci som en indikator på effektiv DSB reparasjon. DU-145 og LNCaP-celler ble behandlet med VPA og bestråles med 2 Gy, 4 Gy, og 6 Gys av stråling. Celler ble løst etter 4 timer for reparasjon og undersøkt med Ser
139 fosforylerte H2AX antistoffer. Som forventet, ble en økning i H2AX foci som finnes i PCA-celler behandlet med VPA, noe som indikerer en nedgang i DNA-reparasjon kapasitet (fig. 3b). Kompromittert DNA-reparasjon kan være et resultat av en reduksjon i den samlede reparasjon protein og /eller en reduksjon i lokalisering eller rekruttering av reparasjons proteiner til det skadede området. For å teste disse mulighetene, må vi først undersøkte nivåene av reparasjons proteiner som ble vist å være downmodulated i vår microarray datasettet etter VPA behandling. Mange av disse genene, slik som Rad51, BRCA1 og Chk1, blir indusert ved DNA-skade [24]. For å undersøke hvorvidt disse proteiner forblir nedregulert ved HDAC hemning selv ved DNA-skade, utførte vi vår analyse i fravær og nærvær av stråling. En økning i den totale H3-acetylering i DU-145 og LNCaP-celler viste at VPA medfører en effektiv global HDAC inhibering ved dosen benyttet for forsøkene (fig. 4a og data ikke vist). Ved å øke konsentrasjonen av VPA fører til en reduksjon i BRCA1 og Rad51 i begge DU-145 og LNCaP-celler, mens andre reparasjons proteiner slik som DNAPK og NBS1 forblir upåvirket (fig. 4b og c). BRCA1 proteinnivåer ikke er jevn i cellen, og topper ved forskjellige tidspunkt, avhengig av fasen av cellesyklusen. For å forstå når BRCA1 er nedregulert i VPA-behandlede celler, ble lysatene oppsamlet ved hvert tidspunkt etter behandling. BRCA1 ble funnet å avta så tidlig som 18 timer etter behandlingen (fig. 4c), som indikerer en rask respons på HDAC-inhibering. Bestråling av PCA-celler etter behandling med VPA, viste visse DNA-skade respons og reparasjon av proteiner som ATR og NBS1 forble upåvirket, mens DNAPK ble indusert ved VPA behandling i nærvær av stråling (fig. 5a). RAD51 ble BRCA1 og CHK1 funnet å forbli nedregulert selv ved bestråling i VPA behandlede celler. BRCA1 er et kjernefysisk protein, som distribuerer til cytoplasma under visse betingelser. For å forsikre seg om at behandling med VPA resultater i nedregulering av BRCA1 i kjernekraftrommet, ble DU-145 celler behandlet med VPA og bestrålt 48 timer etter behandlingsperioden med 4 Gy av stråling. Atom ekstrakter fremstilt fra disse cellene ble immunoprobed for BRCA1. Som vist på fig. 5b, VPA behandlede celler har en nedregulering av BRCA1 protein selv etter bestråling.
a) Nøytral komet analyse utført på prostatakreftceller behandlet med 1,5 mM VPA i 48 timer og bestrålt med 6 Gy γ- stråling etterfulgt av en 4 timer reparasjon intervall. Ubestrålte celler (0Gy) med og uten VPA behandling viste ingen signifikant forskjell i komet hale øyeblikk. Grafen viser gjennomsnittlig hale øyeblikk av 50 celler feilfelt indikerer SD verdi av tre forsøk. Sammenligninger er utført ved hjelp av t-test. b) Immunofluorescensanalyse viser H2AX Ser
139 flekker i DU-145 celler behandlet med 1,5 mM VPA for 48 timer og bestrålt med 4Gy stråling etterfulgt av fire timers reparasjonstid. Grafen viser kvantifisering av H2AX foci kontroll (blå kolonne) og behandlet (rød søyle) DU-145 og LNCaP celler. Feil stolpe representerer standardavviket av tre uavhengige eksperimenter.
a) Western blot som viser acetylering av histon H3 protein i DU-145-celler etter behandling med forskjellige doser av VPA i 48 timer. b) DNAPK og NBS1 proteinnivåer i VPA behandlet DU-145-celler i 48 timer. c) Western blot som viser RAD51 og BRCA1 proteinnivåer i LNCaP og DU-145-celler behandlet med varierende doser av VPA i 48 timer. Blot til høyre viser DU-145 celler behandlet med 1,5 mM VPA for varierende tidspunkter autosøk for BRCA1 protein.
a) PCA cellelinjer behandlet med 1,5 mM VPA for 48 timer, bestrålt med forskjellige doser av stråling, undersøkt for ulike reparasjoner proteiner ved Western blotting. Ubestrålt (0Gy celler) ble også inkludert. b) Total og kjerneekstrakt av VPA (1,5 mm for 48 h) behandlet DU-145 celler med og uten bestråling undersøkt for BRCA1 protein. Ubestrålt (0Gy celler) ble også inkludert. c) Top panelet viser TOPO IIα protein nivået i atom ekstrakt fra DU-145 celler ved VPA behandling. Nedre panel er en agarosegel viser TOPO IIα aktivitet i de samme ekstrakter, kjørefelt 4 er en negativ kontroll.
Våre resultater hadde indikert en markert reduksjon i TOPO IIα transkripsjonsnivåer ved behandling med VPA. TOPO IIα løser catenated DNA ved å fremkalle et forbigående DSB og påfølgende religering [36]. TOPO IIα har vært implisert i en rekke cellulære prosesser, inkludert DNA-replikasjon, transkripsjon og kromosomsegregering [37]. Vi forventet nedregulering av TOPO IIα protein etter HDAC hemming. Til vår overraskelse har vi funnet TOPO IIα protein blir oppregulert ved behandling VPA i begge prostatacellelinjer (fig. 5c og data ikke vist). For å undersøke hvorvidt dette fører til en økning i aktiviteten av TOPO IIα proteinet, har vi brukt kjerneekstrakt fra VPA behandlet DU-145-celler for å måle decatenation aktivitet av TOPO IIα. Som vist i fig. 5c, VPA behandlede celler decatenated kinetoplast DNA mer effektivt enn ubehandlede kontrollceller. Dette tyder på at selv om TOPO IIα blir nedregulert ved transkripsjon nivå på HDAC-inhibering, eksisterer det en posttranslasjonell regulering hvorved proteinet er stabilisert ved HDAC-inhibering.
rekruttering av nøkkel HR DNA-reparasjons proteiner påvirkes ved hemning HDAC ledende til en nedgang i HR DNA reparasjon
romlig og tidsmessig rekruttering av megler og DNA-reparasjonsproteiner til bestråling indusert foci er nødvendig for effektiv DNA-reparasjon skal skje [24]. Vi undersøkte om en reduksjon i DNA skade respons og reparasjon proteiner på HDAC hemming også ført til en nedgang i rekrutteringen av DNA reparasjons proteiner til det skadede området. VPA behandlet DU-145 og LNCaP-celler ble bestrålt med 4 Gy av stråling og deretter løst etter fire timer med reparasjon.
Immunofluorescens ble utført i BRCA1 og RAD51 sammen med fosforylerte H2AX proteiner. Det var en markert reduksjon i farging for BRCA1 og RAD51 foci på VPA behandling; kontrollceller på den annen side viste diskrete BRCA1 og RAD51 foci som colocalized med fosforylert H2AX (Fig. 6a og b). Farging og lokalisering av NBS1, derimot, forble uendret etter VPA behandling (Fig. 6a). Vi kvantifisert antall BRCA1 og RAD51 foci ved å telle dem i celler med mer enn tjue H2AX foci. Som vist i figur 6c, har vi funnet at det var en signifikant reduksjon i antall reparasjons foci for begge de reparasjons proteinene ved behandling VPA. Både LNCaP og DU-145 celler viste punktat cytoplasma farging for både RAD51 og BRCA1. Disse resultatene tyder på at i tillegg til nedregulering, er det en svekket rekrutteringen av reparasjons proteinene til det skadede området ved HDAC-inhibering.
a) Immunofluorescensanalyse av DU-145-celler ble behandlet med 1,5 mM VPA i 48 timer og bestrålt med 4Gy av stråling undersøkt for BRCA1 (rød) og NBS1 (grønn). Kjerner ble kontra med DAPI. Cytoplasmatiske BRCA1 (pil) sett i VPA behandlede celler foreslår svekket rekruttering av BRCA1 i VPA behandlede celler. b) Immunofluorescensanalyse av LNCaP-celler ble behandlet med 1,5 mM VPA i 48 timer og bestrålt med 4Gy av stråling probet for H2AX Ser
139 (rød) og RAD51 (grønn). Kjerner ble kontra med DAPI. Celler som har 25 H2AX Tjen
139foci ble analysert. Cytoplasmatiske RAD51 (pil) sett i VPA behandlede celler foreslår svekket rekruttering av BRCA1 i VPA behandlede celler. c) Kvantifisering av antall BRCA1 og RAD51 foci colocalizing med H2AX Ser
139 foci i DU-145 og LNCaP-celler etter behandling med 1,5 mM VPA og bestråling med 4Gy av stråling. Til sammen 100 celler med 25 H2AX Ser
139foci ble talt opp. Feilfelt angir standardavvik fra gjennomsnittet. d) FACS-analyse som viser en HR reparasjon analyse ved hjelp av et plasmid reporter konstruere i LNCaP celler etter behandling med varierende konsentrasjon av VPA.
Om dette fører til en nedgang i HR reparasjon var det neste spørsmålet vi undersøkt. For dette, benyttet vi et plasmid basert tilnærming til skåring til HR effektivitet i LNCaP celler. Vi genererte en EGFP rekombinasjon reporter konstruere ved å klone en promoterless EGFP oppstrøms for pEGFPN1 vektor. En Bel I stedet ble konstruert i dette genet å indusere DSB sin. Den EGFP-genet i forkant av CMV-promoteren ble mutert, med den følge at funksjonaliteten av EGFP bare ville bli gjenopprettet når det ikke er effektiv HR reparasjon. Som vist i figur 6d, var det en signifikant reduksjon i antallet av HR dyktig LNCaP-celler ved behandling VPA. Disse resultatene indikerer klart en involvering av HR veien i PCA celler på HDAC hemming.
E2F1 er involvert i nedregulering av sentrale reparasjonsproteiner ved HDAC hemming
Siden våre data viser transkripsjonen nedregulering av reparasjonsgener på HDAC hemming, vi undersøkt histon H3 acetylering status for arrangører av en undergruppe av downregulated gener ved hjelp av chip analyser. Intriguingly våre resultater avslørte en reduksjon i H3 acetylering status av de proksimale promoter-regionene i alle de undersøkte gener (fig. 7a). En reduksjon i acetylering av promoter-regioner er også ledsaget av en økning i binding av transkripsjons repressor proteiner for å promoterne [7]. For å undersøke transkripsjonsfaktorer som kan føre til transkripsjon undertrykkelse av DNA-reparasjonsgener ved HDAC hemming, fokuserte vi vår oppmerksomhet på E2F transkripsjonsfaktorer. BRCA1 og Rad51 har to E2F bindingssetet i proksimale promoter regionen [31]. Både BRCA1 og Rad51 er undertrykt i henhold hypoksiske forhold ved rekruttering av E2F4 /p130 transkripsjons repressors. Under hypoksiske forhold, E2F1 og E2F4 samtidig binde BRCA1 arrangøren på to tilstøtende E2F-seter for å få til transcriptional undertrykkelse av BRCA1 genuttrykk [30], [31]. Tilsvarende Chk1 og BubR1 har transkripsjonsbindingssteder for E2F transkripsjonsfaktorer og indusert av E2F1 [32], [38].
a) ChIP analyse av VPA (1,5 mm for 48 h) behandlet DU-145 celler for acetylert histon H3 status på arrangører av reparasjonsgener. Baren diagrammet er en densitometry lesning av agarosegel vist normalisert til innganger. b) Activator og repressor E2F protein nivåer i VPA (1,5 mm for 48 h) behandlede celler LNCaP og DU-145 cells.E2F nivåer forble downregulated på VPA behandling selv etter bestråling med 4Gy stråling som vist i DU-145 celler, ubestrålt (0Gy ) celler fungerte som en stråling kontroll. c) luciferaserapportørplasmid forsøk i DU-145 og LNCaP-celler, behandlet med varierende konsentrasjoner av VPA ved hjelp proksimale promotorområdene, som omfatter E2F-bindende regioner av downregulated reparasjonsgener. d) ChIP analyse for E2F belegg i promotorområdene av downregulated gener. Brikken ble utført ved anvendelse av antistoffer mot E2Fs (1, 4 og 6) i VPA (1,5 mM i 48 timer) behandlede og kontroll DU-145-celler. Baren Diagrammet representerer densitometriske målinger normalisert til respektive innganger.
Siden E2F1 transkripsjon ble nedregulert av HDACis, hypotese vi at HDAC hemming kan øke bindingen av undertrykkende E2Fs til downregulated reparasjon genet arrangører, og dermed føre til aktiv undertrykkelse av DNA reparasjonsgener. Vi først undersøkt protein nivåer av både aktivator og undertrykkende E2Fs etter behandling med VPA både LNCaP og DU-145 celler. I samsvar med transkripsjonsnivåer, ble det E2F1 proteinnivået nedregulert ved VPA behandling, mens de undertrykkende E2Fs (E2F4 og 6) ikke endret. E2F1 forble downregulated selv etter induksjon av DNA-skade ved bestråling (fig. 7b). Det er således en differensial reaksjon av aktivator og undertrykkende E2Fs til HDAC inhibering. Det finnes rapporter som tyder på en økning i E2F1 transkripsjonen aktivitet under nerveapoptose på HDAC hemming [39]. Dette kan være vevet avhengig, som vorinostat mediert HDAC-inhiberende resulterer i nedregulering av E2F relaterte gener i multippelt myelom [40]. Videre er binding av E2F1 til ARHI promoteren ble vist å bli redusert med HDAC-inhibitoren trichostatin A [41]. Selv om vi har funnet E2F1 proteinnivåer nedregulert ved HDAC-inhibering, var det en mulighet for at aktiviteten av den gjenværende pool av E2F1 ble øket etter HDAC hemming. For å undersøke dette, klonet vi proksimale regioner i BRCA1, Rad51, og Chk1, som omfatter de E2F bindingssteder, inn i pGL3 grunn luciferase reporter vektor. VPA behandlet DU-145 og LNCaP celler ble transfektert med arrangøren reporteren konstruerer sammen med kontroll Renilla luciferase vektor. Lysater ble underkastet en dual- luciferase-assay. Våre data viste en betydelig nedregulering av alle genet promotorer ved VPA behandling, med BRCA1 promoteren å være den mest berørt, sammenlignet med kontrollceller (Fig. 7c). Hvorvidt dette innebærer redusert binding av E2F1 eller økt binding av undertrykkende E2F4 eller E2F6 til downregulated genet arrangører var det neste spørsmålet vi adressert. Primere for chip-analyser ble utformet for å flanke E2F steder i proksimale arrangører av BRCA1, Rad51, Chk1 og Bubr1 gener. Kromatin fra VPA, behandlede og ubehandlede kontrollceller ble immunopresipitert ved bruk av antistoffer mot E2F1, E2F4 og E2F6. PCR forsterkning av utfelt kromatin DNA avslørte arrangøren belegg på disse transkripsjonsfaktorer. Bekreftende en tidligere rapport, fant vi samtidig belegg på E2F1 og E2F4 til BRCA1 og Rad51 genet arrangører og fant et lignende mønster for Bubr1 promoter. Under våre eksperimentelle forhold, fant vi ikke noen E2F6 binding til noen av arrangører undersøkt. Mens E2F1 sterkt bundet til promoter-regionene i ubehandlede kontroller, var det en signifikant reduksjon av E2F1 rekrutteringen ved HDAC inhibering (fig. 7d). I motsetning til vår hypotese, fant vi at nedregulering av reparasjonsgener er ikke som et resultat av aktiv undertrykkelse av undertrykkende E2Fs, men en generell nedgang i rekrutteringen av aktivator E2F1 til arrangører.
Diskusjoner
i løpet av utviklingen av PCa, visse DNA-reparasjons banene er inaktivert, som et resultat av dette, får PCa genomiske ustabilitet. Dette utgjør en større grad av endogent DNA-skader i PCA celler enn normale celler [42], [43]. For fortsatt celle overlevelse, er andre DNA skade respons og reparasjon trasé indusert og vedlikeholdes.
