Abstract
Biomarkører avledet fra genuttrykk profilering data kan ha en høy falskt positive og må være strengt validert ved hjelp av uavhengige kliniske datasett, som ikke alltid er tilgjengelig. Selv om dyremodellsystemer kunne gi alternative datasett for å formulere hypoteser og begrense antall underskrifter for å bli testet i kliniske prøver, er prediktiv kraft av en slik tilnærming ikke ennå bevist. Denne studien tar sikte på å analysere de molekylære signaturer av leverkreft i en c-MET-transgen musemodell og undersøke dens prognostisk betydning for menneskers leverkreft (HCC). Vevsprøver ble oppnådd fra tumor (TU), ved siden av ikke-tumor (AN) og fjernt normal (DN) lever i Tet-operator regulert (TRE) human c-MET transgene mus (n = 21) så vel som fra en kinesisk kohort av 272 HBV og 9 HCV-forbundet HCC pasienter. Hele genomet microarray uttrykk profilering ble gjennomført i Affymetrix genuttrykk chips, og prognostiske betydninger av genekspresjonssignaturer ble evaluert på tvers av de to artene. Våre data indikerer paralleller mellom mus og humane lever-tumorer, inkludert nedregulering av metabolske veier og opp-regulering av cellesyklusprosesser. Muse svulstene var mest lik en undergruppe av pasientprøver preget av aktivering av Wnt veien, men særpreget i p53 sti signaler. Av potensiell klinisk nytte, identifiserte vi et sett av gener som var ned regulert i begge musesvulster og menneskelig HCC har betydelig prediktiv kraft på generell og sykdomsfri overlevelse, som ble høyanriket for metabolske funksjoner. I konklusjoner, gir denne studien tyder på at en sykdomsmodell kan fungere som en mulig plattform for å generere hypoteser som skal testes i menneskelig vev og fremhever en effektiv metode for generering av biomarkør signaturer før omfattende kliniske studier er igangsatt.
Citation : Ivanovska jeg, Zhang C, Liu AM, Wong KF, Lee NP, Lewis P, et al. (2011) Gene Signatures avledet fra en c-MET-Driven leverkreft Mouse Model Tippe Survival of pasienter med leverkreft. PLoS ONE 6 (9): e24582. doi: 10,1371 /journal.pone.0024582
Redaktør: Wanjin Hong, Institutt for molekylær og cellebiologi, Singapore
mottatt: 9 mai 2011; Godkjent: 14 august 2011; Publisert: 16.09.2011
Copyright: © 2011 Ivanovska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. II, CZ, PL, UP, DB, CB, MS, mM, Mac og HD engasjert i dette arbeidet som ansatte i Merck Co., Inc., en ledende farmasøytiske selskap; annet enn det, alle andre forfattere offentliggjør ingen konkurrerende interesser. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftformen i verden, med over 300 000 nye tilfeller per år i Kina og med en økende forekomst i vestlige land [1]. Kirurgisk reseksjon eller levertransplantasjon er de primære behandlingstilbud for HCC pasienter som har en 5-års overlevelse på 50-60% [2]. Dessverre er ca 80% av pasientene diagnostisert i avansert stadium på presentasjonen og er i hovedsak ubrukelige og ildfaste til de fleste av de konvensjonelle chemotherapies [3]. Som sådan, det er et presserende behov for å identifisere prognostiske markører for HCC [4], [5], [6], [7], [8], [9] og for å utvikle målrettede terapier gjennom konvensjonelle lite molekyl hemmere og /eller RNAi terapi [10], [11], [12], [13], [14].
Flere intrikate transgene mus modeller av kreft hos mennesker har blitt foreslått å nøyaktig etterligne patofysiologi og molekylære funksjoner i menneske malignitet [15], men på tvers av arter gen-uttrykk sammenligninger av dyremodeller og sykdom hos mennesker er ikke tilgjengelig for validering [16]. HCC utvikler seg i mennesker som en progressiv sykdom fra en skrumplever predisposisjon forårsaket av hepatitt B eller C virus infeksjon, kronisk alkoholisme, eller aflatoksin eksponering. Som et resultat, er human HCC tumorvev omgitt av premaligne cirrhose vev [17]. En transgen musemodell for HCC har blitt utviklet av Bishop og kolleger i hvilken tumorer indusert av lever-spesifikke, tetracyklin-regulert (TRE) ekspresjon av en human c-MET-kinase transgenet, en genetisk lesjon vanligvis forbindes med humane lever-tumorer [18 ]. Tumorer som oppstår på grunn av c-MET over-ekspresjon i mus ligner på human HCC ved nivået for histologi [19]. Aktiverende mutasjoner i β-catenin fører til oppregulering av Wnt signalveien, en annen vanlig funksjon av menneskelig HCC, ble ofte observert i disse svulstene. Likevel, informasjon om tumor suppressor genet TP53, som ofte mutert i menneskelig HCC [20], og andre potensielle genet mål i denne modellen systemet er ikke tilgjengelig. Videre er molekylære karakteren av tilstøtende ikke-ondartet vev som omgir tumorer ikke godt studert og karakterisert [21]. En bedre forståelse av hvordan musemodell sammenligner med menneskelig sykdom på molekylært nivå er derfor avgjørende for utforming og tolkning av effektstudier for terapi.
Biomarkører avledet fra microarray expression profilering data kan være gjenstand for høy USANN positiv rate på grunn av flere hypotesetesting iboende til å jobbe med et stort antall gener og genkombinasjoner. En logisk biomarkør signatur eller gen sett bestemmes ut fra et gitt sett av prøver (treningssettet) må valideres med data fra uavhengige prøver (test /valideringssettet) [22], [23]. Møte dette målet kan være utfordrende som uavhengige datasett, spesielt de fra kliniske prøver som ble behandlet på en lignende måte, er sparsom eller kreve betydelig tid investering å akkumulere. En work-around til denne begrensningen er å formulere og teste hypoteser ved hjelp av data fra et modellsystem.
I denne studien har vi utført molekylær profilering av normal leveren og tumorvev fra c-MET drevet musemodell, til forstår de molekylære endringer i disse musene. Vi har fastslått hvor godt modellen tilnærmer sykdom hos mennesker og bekreftet ekspresjon av spesifikke kreft mål. Vi brukte data som er avledet fra den C-MET-modell for å generere signaturer skille tumor (TU) fra tilstøtende ikke-tumor (AN) og villtype (WT) normale vev, og testet prognostisk kraften i disse signaturene i et datasett fra menneskelig HCC.
Metoder
Etikk
Institutional Review Board ved University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB) godkjent denne studien , og hver enkelt pasient ga hans /hennes skriftlig informert samtykke på bruk av de kliniske prøver for forskning. Alle studier som involverer dyr ble fullt godkjent av Merck Boston Institutional Animal Care og bruk Committee (protokollnummer: # 07-08-044 og # 08-08-041) og ble gjennomført i henhold til de institusjonelle dyreetiske retningslinjer
Den c-MET mus HCC modell
mus brukt i denne studien er beskrevet (tabell 1) [18], [24]. Alle musene var på en FVB genetisk bakgrunn. Mus overekspresjon human c-MET gjennomført en kopi av LAP-TTA transgenet (leverspesifikke LAP promoter driver Tet-VP16 transaktivatorprotein) og en kopi av TRE-c-MET transgen (Tet-operatør regulert human c-MET genet ). Tilstedeværelsen av begge transgener resulterer i ekspresjon av det humane c-MET-genet spesifikt i og gjennom leveren (referert til heretter som den TRE-c-MET-stamme). Syv mus av hver stamme ble ofret på seks (TRE-c-MET), sju (LAP-TTA) eller 14 (TRE-c-MET) ukers alder. Normal leveren eller lever svulstvev (to per mus) ble samlet inn og behandlet for genekspresjon profilering på Rosetta Gene Expression Laboratory. I tillegg ble det tilstøtende levervev oppsamlet fra den ikke-involvert vev ved grensen av tumoren i den tumor-bærende leveren lobe. Fjernt levervev var fra en ikke-tumorbærende lapp eller fra områder på minst 1 cm fra svulsten. Animal arbeider ble utført i AALAC-akkreditert laboratorium i henhold til de institusjonelle dyreetiske retningslinjer.
Pasient kohorter og kliniske prøver
Alle pasientene som ble registrert i denne studien gjennomgikk en helbredende hepatectomy for HCC på Queen Mary Hospital, Pokfulam, Hong Kong mellom 1993 og 2007 [3], [25]. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board for menneskelig etikk og hver pasient ga hans /hennes skriftlig informert samtykke om bruk av kliniske prøver for forskning. Levervev som ble oppnådd fra pasienter ved tidspunktet for den kurative kirurgi ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil behov.
Microarray og analyse
Total RNA ble ekstrahert og renset fra de kliniske leverprøvene (n = 272 HBV-HCC tumor (TU), 257 HBV-HCC tumor-tilstøtende normal (AN), 9 HCV-HCC tumor (TU).
9 HCV HCC tumor-tilstøtende normal (AN)) ved anvendelse av SV96 Total RNA Isolation System (Promega) i henhold til en tilpasset automatisert protokoll. Den ekstraherte RNA ble kvantifisert ved hjelp RiboGreen RNA kvantifisering Reagens (Invitrogen) og dens kvalitet ble vurdert ved hjelp Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent, Santa Clara, CA) i en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bare de prøvene som passerer minimumsgrenser for kvantitet og kvalitet (RIN 6) ble forsterket og merket med Ovation WB-protokollen (Nugen Technologies, San Carlos, CA), i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, ble 50 ng av total RNA forsterket ved hjelp av Ribo-SPIA teknologi (Nugen Technologies), fragmentert og merket med biotin ved hjelp av FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 (Nugen Technologies). De resulterende forsterkede CRNAs ble hybridisert til Affymetrix genuttrykk chips (Menneskelig Rosetta Custom Affymetrix 1.0, Affymetrix, Santa Clara, CA) [26]. Bildene ble analysert ved hjelp av standard pakke med Affymetrix Genechip kjøreprogramvare (GCOS) (www.affymetrix.com/products/software/specific/gcos.affx) og var videre normalisert og behandlet for å utlede sekvensbaserte intensiteter hjelp av RMA algoritmen som gjennomføres i Affymetrix Power Tools (https://www.affymetrix.com/support/developer/powertools). Data som brukes for denne analysen gått to nivåer av kvalitetskontroller (QCS) (matrise nivå ved hjelp av Affymetrix anbefalte parametre, og prosjektnivå på eksklusive uteligger matriser og arrays med store mønstre forbundet med kjente prosessparametre). Log10 (ratio) av hvert gen i hver prøve ble beregnet ved å trekke gjennomsnittet av log10 (Intensitet) av genet på tvers av alle grenser ikke-tumorprøver, for å gjøre dem sammenlignbare med c-MET musemodelldata hvor referansene er pool av villtype mus levervev. Raw genuttrykk profilering data ble avsatt til GEO med følgende deponeringsnummer: GSE25142 (avledet fra c-Met musemodell) og GSE25097 (avledet fra human HCC)
Tumor signatur fra museprofiler
Vi brukte enveis ANOVA å definere svulst signatur i mus c-MET eksperiment, si, for en sammenligning mellom WT Vs. svulst, identifiserte vi 6277 muse probesets med ANOVA P-verdi 0,001. Den falske funnrate (FDR) her er beregnet til 0,62% fra 1000 permutasjoner. Blant disse signatur probesets, 3114 viste svulst ned- og 3163 svulst up-regler sammenlignet med WT. Musen svulst signaturen ble deretter kartlagt til menneske probesets i Affymetrix menneskelig chip. Vi identifiserte også musen svulst signatur fra sammenligninger av tilstøtende ikke-tumor vs. svulst og fjernt non-tumor vs. svulsten, ved ANOVA analyse.
Biologisk merknader og geneset berikelse test
Vi har samlet mange databaser inkluderer gensettene med kjente biologiske funksjoner eller egenskaper fra en rekke offentlige (GO cellulære komponenter, molekylære funksjon, biologiske prosesser, KEGG trasé, SwissProt Keywoards, etc.), lisensiert (GeneGo, oppfinnsomhet, NextBio biosets, etc.), og proprietære kilder (indre forbindelse, siRNA, kropp atlas profilering, etc.). Disse kommenterte gensettene brukt i berikelse test. De berikelse P-verdier (sjansen sannsynligheten for å observere overlappende gener mellom inngangs geneset og geneset i databasen) beregnes ved hjelp av den hypergeometriske fordelingen [27].
Prognostic kraft signaturer
for å estimere den prognostiske kraften i hver av mus signaturer, ble signaturen kartlagt til humane probesets og deretter behandlet som en metagene [28], [29]. Nemlig, ble ekspresjonsnivået for den metagene i humane HCC prøver beregnes ved å ta gjennomsnittet log (forhold) for alle genene lagte fra musen oppover- eller nedover-regulerte signaturer. De menneskelige HCC prøvene ble rangert etter uttrykket nivået av metagene og deretter delt i to like grupper av medianverdien (for å unngå over-fitting, hadde vi ikke optimalisere terskel). Den log-rank p-verdier mellom disse to gruppene ble beregnet ved log-rank test med tidspunktet for total overlevelse og sykdomsfri overlevelse henholdsvis.
Resultater
Globale genuttrykk endringer i mus og menneskelig HCC
for å bestemme tumor-spesifikke genuttrykk i c-MET musemodell for HCC, sammenlignet vi vev fra tumor-bærende mus til flere kontroll vev inkludert tilstøtende og fjern normalt levervev fra svulst bærende mus, vill -type levervev og levervev fra to enkle transgene foreldrelinjene (tabell S1). Vi brukte villtype levervev (virtuell bassenget fra 7 mus) som en baseline og utført uten tilsyn gruppering av forskjellig-uttrykte gener. Vi fant at tumorene hadde en distinkt uttrykksmønster (figur 1A). For å karakterisere den molekylære natur forskjellig uttrykte gener, utførte vi Gene ontologi biologisk merknad [30] (se også Tilleggsopplysninger) på hvert gen sett og funnet ut at de nedregulert gener ble beriket for metabolske prosesser, mens oppregulert gener ble beriket for cellesyklus og cytoskjelett-relaterte ord (Tabell S2). Genuttrykk endringer i menneskelig HCC viste lignende GO kommentarer (tabell S3), noe som indikerer at en global genekspresjon nivå, anslår c-MET musemodell menneskelig HCC.
(A) global genekspresjonsanalyse avslørt tumor- spesifikke genuttrykk endringer preget av genene nedregulert i svulster som ble beriket for metabolske prosesser (hvit boks) og gener oppregulert i svulster som ble beriket for cellesyklus og aktin cytoskjelettet (gul). Non-tumorvev i tilknytning til eller fjerne fra svulstene viste lignende uttrykk mønstre er ble ispedd i varmen kartet generert av ukontrollert clustering, med prøver fra samme dyr clustering sammen. De vertikale stolpene til høyre for hvert heat kartet representerer fargekoding av prøvene som tilsvarer legende i hvert panel. (FVB-WT, lilla) levervev fra kontroll dyr; (LAP-TTA, mørk blå og TRE-c-MET, oransje) levervev fra enkelt transgene foreldre stammer; (C-MET TU, grønn) svulstvev fra dobbel transgen, tumorbærende dyr; (C-MET AN, lys blå) ikke-tumor levervev fra dobbel transgen, tumorbærende dyr ved siden av svulst; (C-MET DN, rød) ikke-tumor levervev fra dobbelttransgene, tumorbærende dyr fjernt fra tumor. Varmen kartet representerer uten tilsyn clustering av forskjellig-uttrykte gener (endring ≥1.25, p 0,01, Cluster Algoritme: agglomerative, Likhet Mål: Cosinus korrelasjon). (B) De fleste av lever-anrikede gener ble nedregulert i c-MET tumorer, i samsvar med tap av leverfunksjonen. For denne analysen valgte vi de beste 400 gener med størst fold-endring fra leveren-beriket gener identifisert av Su og kolleger [18]. En liten undergruppe av gener som var oppregulert (gule bokser) kan inneholde nyttige biomarkører for svulst tilstedeværelse. Color legende -0,5 log
10 (ratio) 0,5. (C) Sammenligning av mus c-MET og humane tumor HCC profiler. Menneskelig og mus viste prøver co-gruppert indikerer lignende genuttrykksmønster (rød boks). De differensielt uttrykte genene kan deles inn i tre grupper på grunnlag av deres spesifikke reguleringsmønstre (gule bokser) og GO merknader. (HCC Adj) Menneskelig tilstøtende ikke-tumor; (HCC TU) human svulst; (C-MET TU) mus tumor; (C-MET Adj /Dis) mus ved siden av og fjern normalt. Varmen kartet representerer uten tilsyn clustering av forskjellig-uttrykte gener (endring ≥1.25, p 0,01, Cluster Algoritme: agglomerative, Likhet Mål: Cosinus korrelasjon).
Vi utførte uten tilsyn clustering og fant at uttrykk profiler av tilstøtende og fjerne normale vevsprøver ble avbrutt, segregert av dyret som de ble tatt, og skiller seg fra kreft profiler (figur 1A). Dette resultatet indikerer at svulsten nærhet, ikke signifikant påvirker genuttrykket i normal leveren vev. Imidlertid kan små forskjeller mellom de tilstøtende og fjerne prøver foreligger.
Selv om både HCV og HBV-infeksjon har blitt vist å forårsake HCC, HBV-infeksjoner var dominerende i denne kohort (272 HBV-HCC tumorer og 9 HCV -HCC svulster). For å identifisere potensielle molekylære forskjeller mellom HCV og HBV-infisert HCC, analyserte vi alle tilgjengelige HCV prøver i denne kohorten (ni) og sammenlignet dem med et likt antall tilfeldig utvalgte HBV-prøver (ni). Den HBV-prøver ble vilkårlig fordelt i en ukontrollert klynge av alle tumorprøver (data ikke vist) indikerer at de ikke var forskjøvet mot et bestemt molekyl profil. Vi observerte ikke noen konsistent molekylær forskjell mellom disse prøvene (data ikke vist).
For å avgjøre om paralleller mellom mennesker og mus HCC eksisterer på gennivå, utførte vi direkte sammenligning av mus og menneskelige HCC profiler. Muse Prøvene ble normalisert mot villtype levervev (virtuell bassenget fra 7 mus) og humane prøver ble normalisert mot et gjennomsnitt av alle tilstøtende ikke-tumorprøver. Unsupervised clustering av de menneskelige og muse prøvene viste at de molekylære profiler av de to kreft settene ble mer nært knyttet til hverandre enn til sine beslektede tilstøtende ikke-tumorvev (figur 1B, rød boks), avslører en tumor-spesifikke molekylære signatur.
Blant de genene forskjellig uttrykt i de fleste mus og humane tumorer, identifiserte vi tre genet undergrupper med forskjellige egenskaper (figur 1B, gule bokser). To grupper viste lignende uttrykk mønstre i både tumortyper: genene nedregulert i begge krefttyper ble beriket for metabolske prosesser, mens gener oppregulert i begge krefttyper ble beriket for cellesyklusprosesser. Gener nedregulert spesifikt i humane tumorer ble beriket for immunresponsprosesser, noe som reflekterer en molekylær utmerkelse som kan peke på forskjeller i tumorprogresjon mekanismer. I sammendrag, sammenligning av de molekylære profiler av human og mus HCC avdekket omfattende paralleller på genekspresjon nivå. Men hvert sett av svulster ble også preget av spesifikke genuttrykksmønster.
nedregulering av gener involvert i metabolske prosesser i svulstene tyder på at leverfunksjonen er redusert eller svekket. For å utforske leveren identitet i disse tumorene ytterligere, undersøkte vi ekspresjonen av lever-anriket gener [31], [32], [33], og fant at de var nedregulert i tumorprøver (figur 1C), i samsvar med tap av lever identitet og funksjon med tumorprogresjon.
aktivitet av onkologi pathways i HCC
for å få en bedre forståelse av aktiviteten til signalveier som er relevante for onkologi i c-MET modell av HCC, vi utføres målrettet analyse av uttrykket endres ved hjelp pathway signaturer definert tidligere. Wnt /β-catenin signatur består av gener opp- og ned-regulert av β-catenin sirnas i DLD-1 colon carcinoma celler [34]. Vi har funnet forhøyede Wnt sti-aktivitet (figur 2A), i samsvar med den aktiverende mutasjoner i β-catenin ofte påvist i disse tumorene og aktivering av Wnt reaksjonsveien i en tredjedel av HCCs [35]. Uten tilsyn gruppering av mus og humane prøver viste et forhold mellom en undergruppe av humane HCC profiler og musetumorprøver (figur 2B), hvilket indikerer at c-MET mus kan være en nyttig modell for å studere HCC pasienter med aktivert Wnt signalering. Interessant, genom-wide profiler av musen svulster og den delen av menneskelig HCC med oppregulert Wnt veien uttrykk var ikke korrelert (korrelasjon = 0,07). Dette er i motsetning til den signifikant korrelasjon observert for den fokuserte Wnt signalveien gen set, noe som indikerer at likhetene er begrenset til bestemte veier.
(A) Wnt /β-catenin sti ble oppregulert i muse tumorer målt ved Wnt /β-catenin gen signatur [34]. Genene i hver signatur er indikert tvers over toppen av hvert varmekartet. Prøvene er på Y-aksen og deres vev av opprinnelse er angitt i den vertikale fargekodet bar til høyre for hvert heat kartet. Fargekoding legende for panelene A og C er mellom panelene. Alle forkortelsene er som i figur 1. (B) Wnt /β-catenin sti var oppregulert i en undergruppe av humane HCC pasienter som illustrert ved de tre humane prøver (HCC TU, lilla) som co-klyngen med musen HCC prøver (c-MET TU, gul). Fargekoding legende for panelene B og D er mellom panelene. (C) TP53 veien var oppregulert i muse svulster (c-MET TU, grønn). (D) Up-regulering av TP53 veien var bestemt til musemodell (c-MET TU, gul) og ble ikke observert i menneskelige HCC (HCC TU, lilla).
p53 pathway aktivitet i muse HCC modellen er av interesse som
TP53
mutasjoner er vanlig (i ~27% av tilfellene) i menneskelig HCC [20]. Vi brukte en p53 sti signatur [36] og observert opp-regulering av p53-reaksjonsveien i mus HCC tumorer, viser en forskjell fra human HCC (figur 2C). I motsetning til dette ble humane HCC prøver ikke viser p53 sti oppregulering (figur 2D), antagelig på grunn av mutasjoner eller andre p53-inaktiverende mekanismer. Disse resultatene indikerer at selv om musen c-MET-modellen kan replikere en undergruppe av humane HCCs i flere aspekter, har molekyl forskjeller og bør tas i betraktning når data oppnådd fra denne modellen blir analysert, spesielt for mål i p53 pathway. Dette skyldes i stor grad villtype status av p53-genet i mus modell. Derfor bør spesiell oppmerksomhet og omtanke skal betales når man sammenligner det tverr arter menneskelig sykdom modell. Wnt signalveien og p53 veien er svært vanlig i kreftutvikling. Genekspresjonssignaturer av begge baner i musetumormodell og menneskelig HCC ble presentert i figur S2.
Mus-avledet gen signaturer har prediktiv kraft for overlevelsen av menneske HCC pasienter
identifiserte genet signaturer i musetumorer ved å sammenligne tumor genuttrykksmønstrene til de tre ikke-tumorvev angitt i tabell S1 (villtype (WT), tilstøtende nontumor (AN) og fjernt normal (DN) leveren). Vi brukte tilstøtende vs. tumor signatur fordi det er mest analog til sammenligning av de kliniske prøver i vårt studium. Den fjerne vs. svulst signatur gir ytterligere informasjon om eventuelle effekter som svulst nærhet kan utøve på tilstøtende vev. Til slutt, gitt at både den tilstøtende og fjerne vev også uttrykker c-MET transgenet, vi inkludert villtype-vs. tumor signatur for å identifisere eventuelle c-MET-drevne gene expression endringer.
For hvert par klok vev sammenligning, identifiserte vi sett av gener som var ned- eller oppregulert i tumoren og genererte varme kart ved hjelp av disse gener og mus c-MET tumor og FVB-WT villtype-prøvene er vist i figur 3A og figur S1 . Vi deretter projisert disse signaturene til de menneskelige HCC data og bestemt deres overlevelse prediktiv kraft og sitt uttrykk mønster. Hele kohort av pasienter ble brukt i denne analysen og de menneskelige prøvene ble delt inn i to grupper basert på gjennomsnittlig log (ratio) av alle gener i signaturen som beskrevet i Materialer og metoder.
(A) mus tumor genekspresjonssignaturer. Varme kart viser uttrykket av gener som var forskjellig uttrykt mellom svulstvev og villtype eller tilstøtende normalt vev i musen. (B) Den musetumor signaturer ble delt inn oppregulert og nedregulert sett og Kaplan-Meier plott ble generert for hvert gen satt til å teste prediktiv kraft for pasientene, og overlevelse.
Interessant, vi fant ut at for alle sammenligninger, genene nedregulert i svulstene hadde svært prediktiv kraft for pasient overlevelse (tabell 1) og sykdomsfri overlevelse (tabell S4). Som vist tidligere, ble disse genene beriket for metabolske prosesser både hos mennesker og mus. I motsetning til oppregulert signatur, beriket for cellesyklusprosesser, ikke har veldig høy prediktiv kraft for overlevelse (tabell 1) eller sykdomsfri overlevelse (tabell S4). Figur 3B og Figur S1 viser Kaplan-Meier plott for disse dataene. Vi foreslår at oppregulert cellesyklusprosesser mangler prediktiv kraft fordi de representerer generelle kreft hendelser, mens tap av metabolske egenskaper betyr konkret tap av funksjonelle egenskaper ved leverceller som kan være skadelig for pasientens overlevelse.
Å avgjøre om prediktiv kraft av muse-avledet signaturer er spesifikk for c-MET modell, analyserte vi den prediktive kraften i en signatur avledet fra uavhengige musemodeller [37], og fant at en betydelig del av genene hadde prediktiv kraft (figur S3). Disse resultatene indikerer at den prediktive kraften av muse-avledede gener som stammer fra tumoregenskapene til museprøver og antyder en generell anvendelighet av musetumormodeller for identifisering av genet signaturer prediktiv av utfall i humane tumorer.
Neste analyserte vi uttrykket mønster av muse genet signaturer i humane prøver og funnet ut at genene identifisert i musemodellen viste signifikante uttrykk endringer i humane tumorer (representative varmekart i figur 4.) for å avgjøre om uttrykket endringene var i den samme retning i mus og menneske, beregnet vi gjennomsnitts uttrykket for hvert gen i humane tumorer, sammenlignet med tilstøtende ikke-tumor. Vi har funnet ut at hver av de seks mus skriftene inneholdt gener hvis ekspresjon endres i humane tumorer både i samme og i motsatt retning. For eksempel blant de genene nedregulert i mus svulster vs WT vev (Figur 4A-B), en undergruppe ble også nedregulert i humane tumorer (Figur 4A) mens en undergruppe ble oppregulert i humane svulster i forhold til tilstøtende ikke-tumorvev (figur 4b). På tilsvarende måte, blant gener som var oppregulert i musetumorer lignet med WT vev, en undergruppe av gener var nedregulert i humane svulster og et undersett ble oppregulert (data ikke vist).
Gene signaturer som genereres i musevev ble projisert på det humane HKU HCC datasett. Fargeskalaen er som i figur 1 (-0,5 til 0,5). Betyr ekspresjonsnivåer er plottet til høyre for hvert varmekartet for å illustrere sammenhengen mellom uttrykk og prognose. KM kurvene er gitt nedenfor hvert heat kartet.
For å forstå forskjellen mellom genene regulert i samme eller i motsatt retning i mus og humane tumorer, vi analyserte hver undergruppe separat for deres makt for å forutsi overlevelse (tabell 2), sykdomsfri overlevelse (tabell S5) og for anrikning av biologiske mekanismer (tabell 2). Vi fant ut at genene nedregulert både mus og humane tumorer (Tabell S6) beholdt en stor betydning prediktiv kraft for å overleve og berikelse for metabolske prosesser. I kontrast, gjorde undergruppe av gener som ble nedregulert i muse svulster men oppregulert i humane svulster ikke har prediktiv kraft og betydelig berikelse for alle biologiske prosesser. Blant de genene oppregulert i muse svulster, gjorde de som var nedregulert i humane svulster ikke har noen prediktiv kraft for å overleve eller vesentlig biologiske annotering (betydelig berikelse av biologiske pathways, målt ved hypergeometriske P-verdi). Interessant, mens hele settet av gener oppregulert i muse svulster ikke har en prediktiv kraft (se ovenfor, tabell 1 og tabell S4), undergruppe av gener som var oppregulert i både mus og humane svulster viste marginalt signifikant prediktiv kraft (Tabell 2, Tabell S7). Dette resultatet indikerer at filtrere ut discordantly regulerte gener gjennom et modellsystem og kliniske prøver og beholde bare de som er tilsvarende regulert i både kan avsløre sett med prediktiv kraft som ikke kan oppdages når enten de globale underskrifter fra begge system regnes separat.
Siden muse HCCs ble indusert av c-MET, vi gjentok analysen ovenfor i menneskelig HCC ved å fokusere på de pasientene med høy c-MET (pasienter med HCC c-MET uttrykk median uttrykk av populasjonen) for å definere signaturene i samme eller motsatt retning mellom mus og menneske. I likhet med figur 4 A og B, identifiserte vi 775 gener begge ned reguleres i mus og human c-MET-høy HCC, og 612 gener i motsatt retning. Blant disse 749 overlappet med 800 samme retning gener ved hjelp av alle HCC prøver (96,7% overlapping, hypergeometrisk P-verdi 0) og 562 overlappet med 587 motsatt retning gener ved hjelp av alle HCC prøver (95,7% overlapping, hypergeometrisk P-verdi 0). Analoger til figur 4 og tabell 2, har vi også kontrollert prognostisk kraft av disse to signaturene, er log-rank p-verdier for total overlevelse er 2,2 x 10-6 og 0,78 henholdsvis, meget lik prediktiv kraft som tilfellet hvor hele HCC pasienter ble brukt til å kartlegge lapper signaturer (tabell 2). Gene ontologi av disse overlappende gener ble gjennomført for å avdekke biologiske mekanismer knyttet til ulike gensettene når man sammenligner de mus c-MET drevet leversvulster og menneske c-MET-høy HCC (tabell S8).
Diskusjoner
den foreliggende undersøkelse viser at mus c-MET tumormodell har likheter med human HCC på molekylært nivå, inkludert nedregulering av metabolske prosesser og opp-regulering av cellesyklus-gener. Tumor-spesifikke genet avledet signaturer i musemodellen kan skille tumor fra ikke-tumorvev i human HCC. Genene nedregulert i tumor sammenlignet med tilstøtende ikke-svulstvev i både mus og humane prøver hadde betydelig prediktiv kraft på total overlevelse og sykdomsfri overlevelse i HCC pasienter.
