Abstract
Økt glutation (GSH) og thioredoxin (TRX) metabolisme er mekanismer som er mye involvert i motstanden av kreftceller til kjemoterapi. Den aktuelle studien bestemt om samtidig hemmer utskillelsen av GSH og Trx stoffskiftet forbedret celle drap på menneskelig hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) celler ved en mekanisme som involverer oksidativt stress. Hemming av GSH og Trx stoffskifte med buthionine sulfoksiminforbindelser (BSO) og auranofin (AUR), henholdsvis indusert betydelig nedgang i klonogene overlevelse sammenlignet med enten stoffet alene Fadu, Cal-27 og SCC-25 HNSCC celler
in vitro
og
in vivo
i Cal-27 xenografter. BSO + AUR betydelig økt glutation og thioredoxin oksidasjon og undertrykte peroxiredoxin aktivitet
in vitro
. Forbehandling med N-acetylcystein helt snudd BSO + AUR-indusert celledreping i Fadu og Cal-27 celler, mens katalase og selen tilskudd bare hemmet BSO + AUR-indusert celledreping i Fadu celler. BSO + AUR redusert caspase 3/7 aktivitet i HNSCC celler og betydelig redusert levedyktigheten til både Bax /Bak dobbel knockout (DKO) og DKO-Bax rekonstituert hematopoetiske celler som tyder på at nekrose var involvert. BSO + AUR også betydelig sensibilisert Fadu, Cal-27, SCC-25 og SQ20B celler til celledød indusert av EGFR-hemmer Erlotinib
in vitro
. Disse resultatene støtter konklusjonen om at samtidig hemmer utskillelsen av GSH og Trx metabolisme trasé induserer oksidativt stress og klonogene drap i HNSCCs og denne strategien kan være nyttig i sensibiliserende HNSCCs til EGFR-hemmere
Citation. Sobhakumari A, Love-Homan L Fletcher EVM, Martin SM, Parsons AD, Spitz DR, et al. (2012) Følsomhet of Human hode og nakke kreft celler til Kombinert Hemming av glutation og thioredoxin Metabolism. PLoS ONE 7 (10): e48175. doi: 10,1371 /journal.pone.0048175
Redaktør: Jinah Choi, University of California, Merced, USA
mottatt: 19 juni 2012; Godkjent: 21 september 2012; Publisert: 31 oktober 2012
Copyright: © 2012 Sobhakumari et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health Grants K01CA134941 (ALS), R01CA133114 og P30CA086862 (DRS), samt Institutt for patologi og Radiation Oncology ved The University of Iowa. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ervervet resistens mot kjemoterapi er et stort hinder for vellykket hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) behandling. Tidlig stadium HNSCC-pasienter har en høy risiko for utvikling av sekundære tumorer, selv etter lokal kontroll oppnås [1] – [3]., Og derfor forstå de molekylære mekanismene som er forbundet med kjemoterapi resistens i cancerceller kan føre til forbedringer i pasientens overlevelse
økt glutation (GSH) og tioredoksin (Trx) metabolismen er mekanismer som har vært mye innblandet i kjemoterapi motstand [4] – [7], og begge disse stoffskifteveier spiller en viktig rolle i reaktive oksygenarter (ROS) avgiftning [ ,,,0],8] – [11]. Den GSH systemfunksjoner via glutationperoksidase (GPX) enzymer, som inaktiverer H
2o
2 og andre hydroperoksyder (inkludert alkyl- og lipidperoksider) ved omdannelse av GSH til glutation disulfid (GSSG), som blir omdannet tilbake til GSH av glutation reduktase (GR) under anvendelse av NADPH ([12], figur 1A). TRX systemet er involvert i avgiftning av H
2o
2 og hydroperoksider via virkningen av peroxiredoxins (PRX). I løpet av denne prosessen, oksydert Trx (Trx [S
2]) er utformet som deretter reduseres ved tioredoksinreduktase (TR) også ved bruk av reduksjonsmidler fra NADPH (figur 1A [13])
A.: NADPH er en kilde til reduksjonsekvivalenter for glutation system bestående av redusert glutation (GSH), glutation disulfid (GSSG), glutation peroksidase (GPX), og glutation reduktase (GR) og tioredoksin system som består av redusert tioredoksin [Trx (SH)
2], thioredoxin disulfid [Trx (S
2)], peroxiredoxin (PRX), og tioredoksinreduktase (TR). BSO hemmer γ-glutamyl-ligase (GCL), som katalyserer reaksjonen mellom cystein og L-glutamat for å danne γ-glutamyl-cystein. Glutationsyntetase (GS) konverterer γ-GCS inn GSH. AUR hemmer TR aktivitet. Fadu, Cal-27 og SCC-25 celler ble behandlet med 0,5 uM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer og analysert for total GSH (B) og TR aktivitet (C). Feilfelt representerer standardfeil for gjennomsnittet (SEM) N = 3 eksperimenter *, p. 0,05 versus kontroll
Flere studier i løpet av årene har utforsket strategier for individuelt hemme GSH eller Trx metabolisme i tillegg til konvensjonell kjemoterapi, men har gitt variable resultater [14] – [16] sannsynligvis på grunn av de overflødige beskyttende funksjoner av disse systemene [17] – [20]. Gitt at begge systemene avgifte H
2o
2 og bruke NADPH som reduksjonsmidler, er det logisk at begge GSH og TRX-systemer har overlappende og redundante funksjoner i avgiftning av ROS. For å overvinne redundans i disse banene som de forholder seg til motstand mot terapi i HNSCC, denne studien bestemmes effekten av samtidig hemme både GSH og Trx metabolisme ved hjelp buthionine sulfoksiminforbindelser (BSO, en hemmer av GSH syntese), og auranofin (AUR; en hemmer av TR aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
. Denne strategien ble funnet å være svært effektiv på å øke oksidativt stress-mediert tumorcelledreping og styrke følsomhet for Erlotinib kjemoterapi.
Materialer og metoder
Cells og kulturforhold
Fadu, Cal-27 og SCC-25 menneskelige hode og nakke plateepitel karsinom (HNSCC) celler ble hentet fra American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). SQ20B HNSCC celler [21] var en gave fra Dr. Anjali Gupta (Department of Radiation Oncology, The University of Iowa). Alle HNSCC cellelinjer var p53 mutant. HNEpC celler ble hentet fra PromoCell (Heidelberg, Tyskland). Alle cellelinjer ble godkjent av ATCC for levedyktighet (før frysing og etter tining), vekst, morfologi og isoenzymology. Celler ble lagret i henhold til leverandørens anvisninger og brukes over en periode på ikke mer enn 3 måneder etter gjenoppliving av frosne porsjoner. Bax /Bak dobbel-knockout (DKO) og DKO-Bax rekonstituert muse hematopoetiske celler var en generøs gave fra Dr. Craig Thompson (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA). Fadu, Cal-27 og SQ20B celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 4 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1,5 g /l natriumbikarbonat og 4,5 g /l glukose med 10% føtalt bovint serum (FBS ; Hyclone, Logan, UT). SCC-25-celler ble opprettholdt i en 01:01 blanding av Dulbeccos modifiserte Eagles medium og Hams F12-medium inneholdende 1,2 g /l natriumbikarbonat, 2,5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES, 0,5 mM natriumpyruvat, 4,5 g /l glukose, og 400 ng /ml hydrokortison med 10% føtalt bovint serum. DKO og DKO-Bax celler ble holdt i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 g /ml streptomycin og 50 pM 2-mercaptoethanol. HNEpC celler ble holdt i Airway epithelial vekstmedium (PromoCell) inneholdende 4 ul /ml bovint hypofyseekstrakt, 10 ng /ml epidermal vekstfaktor, 5 ug /ml insulin, 0,5 ug /ml hydrokortison, 0,5 ug /ml adrenalin, 6,7 ng /ml trijod-L-thyronin og 0,1 ng /mL retinsyre. Kulturer ble opprettholdt i 5% CO
2 og fuktet i en 37 ° C inkubator.
Drug Treatment
pegylert katalase (CAT), staurosporin (STS), ionomycin (ION) og L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (BSO) ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Auranofin (AUR) ble oppnådd fra ICN Biochemicals (Aurora, OH). Erlotinib (ERL) markedsføres som Tarceva og N-acetylcystein (NAC) markedsføres som Acetadote (Cumberland Pharmaceuticals, Nashville TN), ble hentet fra innleggelse apotek ved University of Iowa sykehus og klinikker. Alle legemidler ble anvendt uten ytterligere rensing. Legemidlene ble tilsatt til cellene ved endelige konsentrasjoner på 1 mM BSO, 0,5 uM AUR, 20 mM NAC, 1000 U /ml CAT, 10 uM ERL, 10 uM STS og 100 uM ION. BSO, CAT, og SEL ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS). AUR, STS, ERL og ION ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO). Det nødvendige volum av hvert medikament ble tilsatt til cellekulturmedium på cellene for å oppnå de ønskede sluttkonsentrasjoner. Kjøretøy kontroller ble inkludert med hvert forsøk.
glutation analysen
Redusert glutation (GSH) og glutation disulfid (GSSG) ble bestemt ved hjelp av et kommersielt glutation analysesett (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan) . Alle glutation bestemmelser ble normalisert til proteininnholdet i hele homogenater ved hjelp av Bradford-metoden.
tioredoksinreduktase Assay
tioredoksinreduktase (TR) aktivitet ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av en kommersiell tioredoksinreduktase assay kit (Cayman kjemisk, Ann Arbor, MI). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bradford-metoden.
celleviabilitet
Celleviabilitet ble målt ved hjelp av Prestoblue ™ celleviabilitet reagens (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens protokoll.
klonogene celleoverlevelses eksperimenter
klonogene overlevelses ble bestemt som tidligere beskrevet [21]. Individuelle analyser ble utført med flere fortynninger med minst fire klonings retter per datapunkt, gjentas i minst 3 separate forsøk.
siRNA Transfeksjon
tioredoksinreduktase (TR) og kontroll siRNA ble anskaffet fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). HNSCC celler ble transfektert med 20 nM siRNA på 80% samløpet i redusert serum Eagle er Minimum Essential Medium (EMEM, Santa Cruz, CA) i 24 timer. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ble anvendt for å trans følgende protokoller levert av produsenten. Biokjemiske analyser ble utført 48-72 timer etter transfeksjon.
caspase 3/7 aktivitet
caspase 3/7 aktivitet ble vurdert ved hjelp av ApoTox-Glo ™ Triplex analysen (Promega Corporation, Madison WI) .
thioredoxin redoks vestlige blotter
thioredoxin Western blot ble utført som tidligere beskrevet [22] – [25]. Celler ble inkubert med enten 2 mM DL-ditiotreitol (DTT) eller 2 mM H
2o
2 i 10 minutter ved romtemperatur, før inkubering med 50 mM IAA å bli brukt som kontroller for å hjelpe til med identifisering av tioredoksin redox state band.
glutation reduktase (GR) analyse
GR-aktivitet ble målt i henhold til metoden beskrevet av Mavis og Stellwagen [26]. Data ble normalisert pr mg protein, bestemt ved Lowry-proteinanalyse.
glutationperoksidase (GPX) Aktivitet
selen avhengig GPX-aktivitet ble målt som tidligere beskrevet [27]. Data ble normalisert pr mg protein, bestemt ved Lowry-proteinanalyse.
Peroxiredoxin Activity Assay
2-Cys-Peroxiredoxin aktivitet ble målt som beskrevet [28]. I korte trekk, ble den utgangshastighet på NADPH oksydasjon overvåket spektrofotometrisk ved 340 nm ved 30 ° C i en reaksjonsblanding (150 ul) inneholdende 50 mM Hepes-NaOH (pH 7,0), 0,25 mM NADPH, 46 nM TR, 2,4 mM Trx og 0,13 mm H
2o
2. Reaksjonen ble initiert ved tilsetning av H
2o
2 og overvåket i 10 min.
katalaseaktivitet Assay
CAT-aktiviteten ble målt på cellehomogenater ved å overvåke forsvinningen av 10 mmol /LH
2o
2 i 50 mmol /l kaliumfosfat (pH = 7,0) spektrofotometrisk ved 240 nm. Aktiviteter ble uttrykt i mk enheter /mg protein som beskrevet [29].
tumorcelle implantasjon
Dame 4-5 uker gamle atymiske-nu /nu nakne mus ble kjøpt fra Harlan Laboratories (Indianapolis , IN). Mus ble plassert i en patogen-fri barriere plass i Animal Care Facility ved University of Iowa og håndteres ved hjelp av aseptiske prosedyrer. Alle prosedyrer ble godkjent av IACUC komiteen ved University of Iowa og likedannet til retningslinjer fastsatt av NIH. Mus ble tillatt minst 3 dager å akklimatisere seg før start eksperimentering, og mat og vann ble gjort fritt tilgjengelig. Tumorceller ble inokulert i nakne mus ved subkutan injeksjon av 0,1 ml porsjoner av saltvann inneholdende 4 x 10
6 Cal-27 celler i høyre flanke ved hjelp av 26 gauge nåler.
tumormålinger
i
in vivo
eksperimenter mus startet medikamentell behandling en uke etter at tumor inokulering med en gjennomsnittlig tumorvolum på 0,025 cm
3. Musene ble evaluert daglig og tumormålinger tatt tre ganger per uke ved hjelp av Vernier calipers. Tumorvolumene ble beregnet ved anvendelse av formelen: tumorvolum = (lengde x bredde
2) /2 hvor lengden var den lengste dimensjon, og bredden var dimensjonen vinkelrett på lengde
In vivo.
narkotika administrasjon
mus ble delt inn i 4 grupper (n = 6-10 mus /gruppe). BSO gruppe: BSO ble oppløst i saltvann og administrert 400 mg /kg i.p. hver dag i 2 uker. AUR gruppe: AUR stamoppløsningen ble fortynnet med saltløsning og administrert i.p. 1 mg /kg hver dag i 2 uker. BSO + AUR gruppe: mus ble administrert 400 mg /kg BSO pluss 1 mg /kg i.p. AUR annenhver dag i 2 uker. Kontrollgruppe: mus ble gitt en saltoppløsning hver dag i.p. Musene ble avlivet via CO
2 gass kvelning eller dødelig overdose av natrium pentobarbital (100 mg /kg) når svulst diameter over 1,5 cm i alle dimensjoner.
Statistical Analysis
Statistisk analyse var gjøres ved hjelp av GraphPad Prism versjon 5 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California). Forskjeller mellom 3 eller flere midler ble bestemt ved enveis ANOVA med Tukey post-tester. Lineære blandede effekter regresjonsmodeller ble brukt til å beregne og sammenligne gruppespesifikk endring i tumorvekstkurver. All statistisk analyse ble utført på p. 0,05 signifikansnivå
Resultater
BSO og AUR redusert GSH syntese og TR aktivitet
BSO og AUR er viden kjent hemmere av cellulær GSH-syntese og TR aktivitet henholdsvis som illustrert i forenklet skjematisk i figur 1A. For å bekrefte disse effektene av BSO og AUR i HNSCC celler, eksponentielt voksende Fadu ble Cal-27 og SCC-25 celler behandlet med 1 mM BSO og /eller 0,5 mikrometer AUR i 24 timer og deretter analysert for total GSH nivåer og TR aktivitet. GSH produksjon ble betydelig utarmet på både BSO og BSO + AUR behandlede celler i alle 3 cellelinjer, noe som tyder på at BSO var faktisk i stand til å inhibere GSH-syntese (figur 1B). BSO også betydelig økt TR aktivitet i Fadu og SCC-25 celler og viste en trend mot økt TR aktivitet i Cal-27 celler (figur 1C). I tillegg ble TR aktivitet hemmet i AUR og BSO + AUR behandlede celler bekrefter virkningsmekanismen til AUR (figur 1C). AUR også økt GSH produksjon i alle 3 cellelinjer (figur 1B). Disse resultatene tyder på at BSO og AUR hemme GSH produksjon og TR aktivitet henholdsvis etter 24 timers behandling i HNSCC-celler
in vitro
.
BSO og AUR redusert cellelevedyktighet og klonogene overlevelses
for å undersøke de cytotoksiske effektene av BSO og AUR på HNSCC celler, celle levedyktighet og klonogene overlevelse ble testet etter BSO og AUR behandling i eksponentielt voksende Fadu, Cal-27 og SCC-25 celler. BSO og AUR som enkle midler, førte ikke til noen betydelig reduksjon i den metabolske celleviabilitet selv om en økning i levedyktighet ble observert med BSO behandling (i Cal-27 og SCC-25-celler) og med AUR behandling (i Fadu celler, figur 2A). I motsetning til dette, en kombinasjon av BSO og AUR betydelig redusert cellelevedyktighet i alle 3 cellelinjer i forhold til de andre behandlingsgruppene (figur 2A). Tilsvarende ble signifikant klonogene celledreping observert med kombinasjonen av BSO og AUR i alle 3 cellelinjer sammenlignet med hvert middel alene, noe som antyder at BSO og AUR må brukes samtidig for å indusere celledreping i HNSCC-celler (figur 2B) . Når celle-levedyktighet i respons til BSO + AUR ble testet i løpet av en 24 timers periode, viste det seg at en betydelig reduksjon i cellelevedyktighet ikke ble observert inntil 16 timer (Cal-27 og SCC-25) og 24 timer (Fadu) etter behandling (figur 2C). I motsetning til dette, betydelig reduksjon i klonogene overlevelses som reaksjon på BSO + AUR begynte å vises så snart en time etter behandling i SCC-25-celler og 4 timer etter behandling i Fadu celler (figur 2D). Disse resultatene viser klart at overvåke endringer i cellelevedyktighet som en funksjon av tid ikke nødvendigvis medikament-indusert celledreping som målt ved kolonidannende evne. Vi har også observert at BSO + AUR-indusert cytotoksisitet målt ved hjelp av klonogene assay, var betydelig mindre i konfluente HNSCC-celler i forhold til eksponentielt voksende kreftceller (figur 3A) som tyder på at BSO + AUR var mer effektiv i eksponentielt voksende celler. I tillegg Fadu celler var vesentlig mer følsom enn normale humane epitelceller (HNEpCs) til BSO + AUR etter 24 timer, noe som antyder at BSO + AUR fortrinnsvis toksisk for HNSCC-celler sammenlignet med normal «ikke-transformerte» celler (figur 3B). Til sammen resultatene i både levedyktigheten og klonogene eksperimenter tyder på at BSO + AUR synes å indusere mer enn additiv celle drap i Fadu, Cal-27 og SCC-25 celler
in vitro
.
Fadu, Cal-27 og SCC-25 celler ble behandlet med 0,5 uM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer og analysert med hensyn til cellenes levedyktighet (A) og klonogene celleoverlevelse (B). Celler ble behandlet som nevnt ovenfor, og levedyktigheten (C) og klonogene celleoverlevelse (D) ble målt over et tidsrom på 8 h (klonogene overlevelses, [D]) eller 24 timer (levedyktighet, [C]). Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus kontroll; ¥, p 0,05 versus BSO eller AUR
En. Eksponentiell vekst og konfluent Fadu, Cal-27 og SCC-25 celler ble behandlet med 0,5 mikrometer AUR og /eller en mM BSO i 24 timer og analysert med hensyn til klonogene overlevelses. Klonogene celleoverlevelsesdata ble normalisert til eksponentielt voksende og konfluent kontrollceller (ikke vist). B: Fadu og HNEpC celler ble behandlet med BSO + AUR og antallet levedyktige festede celler ble tellet etter 24 timer. Antallet av levende BSO + AUR-behandlede celler ble normalisert til deres respektive kontroller (CON). Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus EXP; ¥, s. 0,05 versus CON
tioredoksinreduktase (TR) knockdown sensibiliserte Fadu celler til BSO
For å bekrefte at AUR-induserte endringer i cytotoksisitet skyldtes undertrykkelse av TR aktivitet , TR uttrykk ble slått ned med siRNA rettet mot TR i Fadu celler og behandles med eller uten BSO i 24 timer. TR knockdown resulterte i en betydelig undertrykkelse av TR-aktivitet (tabell 1) og sensibilisert Fadu celler til BSO som bestemt ved klonogene analysen (figur 4). Disse resultatene gir ytterligere støtte for hypotesen om at hemming av Trx metabolismen sensitizes HNSCC celler til celledød i nærvær av hemmere av GSH metabolisme.
TR uttrykk ble slått ned i Fadu celler ved hjelp av siRNA rettet mot TR og analysert for klonogene overlevelses med og uten 1 mM BSO behandling i 24 timer. Klonogene overlevelse data ble normalisert til kontroll (CON). Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus kontroll; ¥, s. 0,05 versus BSO eller siTR
BSO + AUR indusert nekrotisk celledød
Den cytotoksiske respons av BSO + AUR kunne påvises morfologisk ved hjelp av fasekontrastmikroskop . Cal-27 celler behandlet med BSO og /eller AUR for bare 6 timer ble avrundet og løsrevet fra vev kultur retter i forhold til BSO eller AUR-behandlede celler som var festet og så intakt (figur 5A). De samme observasjonene ble sett i Fadu og SCC-25-celler (data ikke vist). For å avgjøre om apoptose eller nekrose var involvert i BSO + AUR-indusert celledød, analyserte vi caspase 3/7 aktivitetsnivået til BSO og /eller AUR i 24 timer i Fadu og Cal-27 celler. Celler behandlet med staurosporin (STS, 10 um, 6 timer) og ionomycin (ION, 100 uM, 6 timer) ble anvendt som positive kontroller for henholdsvis apoptose og nekrose. Vi fant at AUR betydelig økt kaspase 3/7 aktivitet sammenlignet med kontroll behandlede celler i bare Cal-27-celler (Figur 5B). Imidlertid BSO + AUR redusert betraktelig caspase 3/7 aktivitet i Fadu og Cal-27-celler, som var sammenlignbare med ionomycin behandlede celler (figur 5B), noe som tyder på at nekrose og apoptose ikke var involvert i mekanismen for celledød. Til støtte for disse resultatene, vi i tillegg undersøkt effekten av BSO + AUR på Bax
– /- Bak
– /- doble knock out (DKO) muse hematopoetiske celler. Den apoptotiske sti oppheves i DKO celler ved genetisk sletting av pro-apoptotiske faktorer, Bax og Bak gjengi disse cellene er avhengige av nekrose når de utsettes for dødelige fornærmelser [30]. Vi har også brukt DKO celler som ble rekonstituert med Bax (DKO-Bax) ved transfeksjon med en vektor som inneholder Bax (pcDNA3 /Bax) som tidligere beskrevet [30]. Rekonstituering av Bax inn i DKO-celler har vist seg å gjenopprette deres følsomhet for apoptotiske stimuli [30], [31]. Vi observerte at BSO alene ikke påvirker levedyktigheten til enten DKO eller DKO-Bax celler (figur 5C). Men DKO-Bax men ikke DKO celler var svært følsomme for AUR behandling (figur 5C) som støtter tidligere rapporter som AUR induserer en apoptotisk respons [32]. Både DKO og DKO-Bax celler var svært sensitive til BSO + AUR antyder at nekrose var celledødsreaksjonsveien er involvert i respons til BSO + AUR (figur 5C). Disse resultatene tyder på at BSO + AUR ved de doser og behandlingstider som anvendes i disse studiene indusert nekrotisk celledød
A.: Fase kontrastbilder av Cal-27 celler ble tatt etter 6 timer med behandling med 0,5 uM og AUR /eller 1 mM BSO. B: Fadu og Cal-27 celler ble behandlet med 0,5 uM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer, deretter analysert for caspase 3/7 aktivitet ved anvendelse av en luminescens analyse. Celle behandling med staurosporin (STS) og ionomycin (ION) i 6 t ble anvendt som positive kontroller for henholdsvis apoptose og nekrose. Alle behandlinger ble normalisert til kontroll. *, P 0,05 versus kontroll; ¥, p 0,05 versus BSO eller AUR. C: Bax /Bak dobbel knockout (DKO) celler og DKO celler med rekonstituert Bax (DKO-Bax) ble behandlet med 0,05 mM BSO og 2 mikrometer AUR i 24 timer og deretter analysert for celle levedyktighet. Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus kontroll; ¥, p 0,05 versus BSO eller AUR; £, p. 0,05 versus DKO celler
BSO + AUR indusert GSH og Trx oksidasjon
Fordi en økning i oksidert GSSG (% GSSG) antas å betegne en dreining mot en mer sterkt oksyderende intracellulære miljø indikativ for oksidativt stress [12], undersøkte vi endringer i% GSSG i respons til BSO og AUR. BSO + AUR induserte en signifikant økning i% GSSG i forhold til BSO og AUR alene Fadu celler, mens både BSO og BSO + AUR-behandlede grupper induserte en signifikant økning i% GSSG sammenlignet med kontroll i Cal-27-celler (figur 6A). Analyse av tioredoksin-1 (Trx-1) redoks western blot-eksperimenter viste at behandling med BSO + AUR i Fadu celler resulterte i en økning i oksydert Trx-1 (TRX1 [S
2] og TRX1 [S
2 ]
2) ekspresjon som sett av den økte ekspresjon av de 2 øverste bånd i figur 6B i forhold til de andre behandlingsgruppene. En lignende effekt ble sett i Cal-27 cellene i respons til BSO + AUR behandling, selv om den totale mengden av Trx (redusert + oksidert) syntes å være mindre enn de andre behandlingsgruppene (figur 6B). Tidligere rapporter har antydet at reduksjonen i total Trx ekspresjonen kan være på grunn av dannelsen av store tioredoksin blandede protein disulfid-komplekser som er i stand til å gå inn i gelen under elektroforese [23]. Vi bekreftet dette ved å inkubere BSO + AUR-behandlet lysatene med DTT for å redusere eventuelle blandede protein disulfides før analyse for redusert og oksidert TRX1. Vi fant ut at DTT var vellykket på å redusere oksidert TRX1 dannet av BSO + AUR og gjenopprette nivåene av redusert TRX1 til nær kontrollnivåer i både Fadu og Cal-27 celler (Figur 6b) som tyder på at blandede protein disulfider ble dannet som svar på BSO + AUR. Til slutt, ble endring i aktiviteten av andre GSH og TRX beslektede enzymer så som glutation reduktase (GR), glutation peroksidase (GPX) og peroxiredoxin (prx) som reaksjon på BSO og AUR undersøkt i Fadu og Cal-27-celler. Det var ingen signifikante endringer i GR (figur 7A) eller GPX (figur 7B) som svar på BSO + AUR i begge cellelinje i forhold til kontroll. Prx aktivitet øker betydelig hos BSO-behandlet Cal-27 celler, men ble betydelig undertrykt i AUR og BSO + AUR-behandlet Fadu og Cal-27 celler (figur 7C). Disse resultatene tyder på at BSO + AUR indusert oksidativt stress via økt GSH og Trx oksidasjon i HNSCC-celler
A, B:. Fadu og Cal-27 celler ble behandlet med 0,5 uM AUR og /eller 1 mM BSO for 24 h, og deretter analysert for prosent glutation disulfid (% GSSG, (A)) og tioredoksin redoks-status (B). Dithiotrietol (DTT, 2 mM) eller 2 mM H
2o
2 ble tilsatt i 15 minutter for å styre lysater som positive kontroller for redusert og oksydert tioredoksin henholdsvis (B). *, P 0,05 versus kontroll (CON); ¥, s 0,05 versus BSO eller AUR
A-C:. Fadu og Cal-27 celler ble behandlet med 0,5 uM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer, deretter analysert for glutation reduktase (GR) aktivitet (A), glutation peroksidase (GPX) aktivitet (B), og peroxiredoxin aktivitet (C). Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P. 0,05 versus kontroll
BSO + AUR-indusert cytotoksisitet hemmes av antioksidanter
For ytterligere analyse av rollen som oksidativt stress i BSO + AUR-indusert celledreping, Fadu og Cal-27-celler ble forbehandlet med 20 mM NAC (en tiol antioksydant) i 1 time før og i løpet av BSO + AUR behandling, deretter analysert for klonogene overlevelses. NAC var i stand til å fullstendig reversere cytotoksisitet indusert av BSO + AUR i Fadu og Cal-27 celler som tyder på at hemming av BSO + AUR induserer oksidativt stress via forstyrrelser i tiol metabolisme (figur 8A). For å bekrefte at H
2o
2 var involvert i BSO + AUR-indusert cytotoksisitet, ble Fadu og Cal-27 celler forbehandlet i 1 time med 1000 U /ml pegylert katalase (CAT) før behandling med BSO + AUR. CAT vesentlig tilbake BSO + AUR-indusert cytotoksisitet i Fadu celler, men ikke Cal-27 celler (figur 8A). Analyse av CAT aktivitet i BSO + AUR versus CAT + BSO + AUR-behandlede celler viste at behandling med CAT ikke økte CAT aktivitet i Cal-27 celler i forhold til Fadu celler (figur 8b), noe som tyder på at CAT kanskje ikke tilstrekkelig oppgitt cellene. Videre Cal-27-celler besatt et signifikant høyere nivå av CAT-aktivitet sammenlignet med Fadu celler (Figur 8B). Til sammen resultatene i figurene 6, 7 og 8 støtte hypotesen om at H
2o
2-indusert disrutions i tiol metabolisme fører til oksidativt stress er involvert i celledreping indusert av BSO + AUR i menneskelige HNSCC celler.
A: Fadu og Cal-27 celler ble behandlet med 20 mM NAC eller 1000 U /ml pegylert katalase (CAT) i 1 time før og i løpet av 24 timers behandling med 0,5 uM AUR og /eller 1 mM BSO. Legemiddelbehandlede celler ble målt for cellelevedyktighet. Alle behandlinger ble normalisert til kontroll. B: BSO + AUR og CAT + BSO + AUR-behandlet Fadu og Cal-27 celler ble analysert for CAT aktivitet. Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus kontroll; ¥, p 0,05 versus BSO + AUR; **, P. 0,05 versus respektive behandling i Fadu celler
BSO + AUR trykt Cal-27 tumorvekst
in vivo
aktivitet av BSO og AUR i Cal-27 tumorbærende atymiske nakne mus ble undersøkt. Resultatene viste at mus som ble behandlet med 400 mg /kg BSO i kombinasjon med 1 mg /kg i.p. AUR daglig i 10 dager, viste en undertrykkelse av tumorvekst i forhold til kontroll og BSO-behandlede tumorer (figur 9A) uten noen negative effekter på kroppsvekt (figur 9B) resultatene sett bekrefter
in vitro
. Selv om BSO + AUR-behandlede svulster viste en trend mot lavere vekst sammenlignet med AUR-behandlede svulster, gjorde ikke denne forskjellen nå betydning (9A)
A, B. Atymiske (nu /nu) mus med Cal-27 xenograft tumorer ble behandlet som begynner ved et gjennomsnittlig tumorvolum på 0,025 cm
3 og 450 mg /kg ip BSO og /eller 1 mg /kg i.p. AUR daglig i 10 dager. Kontrollmus mottok 10% etanol i saltoppløsning i.p. daglig i 10 dager. Tumorvolum (A) og kroppsvekt (B) ble målt på dag 1, 3, 5, 8, 10 og 12 for behandling. Datapunkter representerer gjennomsnittsverdiene for 10 mus. B: Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (SEM) av n = 3 forsøk. *, P. 0,05 versus CON
BSO + AUR sensibilisert HNSCC celler til Erlotinib
Gitt at resistens mot kjemoterapi agenter, som for eksempel EGFR-hemmere, er en betydelig begrensning i HNSCC behandling [33], bestemt vi om BSO + AUR ville bevisst konfluente HNSCC celler til EGFR-hemmer Erlotinib. Vi fant at BSO og AUR når de anvendes alene ikke var i stand til å sensibilisere celler overfor erlotinib (10 uM, i 24 timer (figur 10)). Men BSO + AUR betydelig sensibilisert alle cellelinjene som ble testet til Erlotinib (Figur 10) som tyder på at BSO + AUR må brukes i kombinasjon med EGFR-hemmere for å oppnå maksimal chemo-allergi.
Confluent Fadu, Cal-27, SCC-25 og SQ20B celler ble behandlet med 1 mM BSO og eller 0,5 uM AUR i kombinasjon med 10 uM erlotinib (ERL) i 24 timer. Klonogene celleoverlevelsesdata ble normalisert til å kontrollere (CON) celler. Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus CON; ¥, p 0,05 versus CON, BSO og AUR; £, p 0,05 versus ERL; §, p. 0,05 versus alle andre behandlingsgrupper
Diskusjoner
Økt GSH og Trx metabolismen har vært kjent i årevis for å være korrelert med høy tumor aggresjon og motstand mot kjemoterapi [4 ] – [7]. Som et resultat av denne kunnskapen, har inhibering av GSH eller Trx i forbindelse med kjemoterapi blitt grundig undersøkt, men er høyt cellelinje spesifikt og har gitt skuffende resultater som kan være på grunn av de overlappende og redundante antioksidant funksjoner av GSH og TRX systemer [17 ] – [20]. Faktisk har våre tidligere studier har vist at evnen til BSO eller AUR for å sensitiv HNSCC-celler til å Akt inhibitorer var høyt cellelinje spesifikk [16].
