Abstract
Vi presenterer en
in-silico-to-i-vitro
tilnærming til å utvikle godt definert, selv-montert, stiv-cored polymer (Polybee) nano-arkitektur for kontrollert levering av en viktig del av bie gift, melittin. En konkurransedyktig formulering med lipid-innkapslet (Lipobee) stiv cored micelle er også syntetisert. I en serie påfølgende eksperimenter viser vi hvordan nanoskala kjemi påvirker levering av gift giftstoffer for kreft regresjon og bidra til å unngå systemisk disintegrity og cellulær noxiousness. En relativt svakere sammenslutning av melittin i tilfelle av lipid-baserte nanopartikler er i forhold til de polymerpartikler avslørt av energi minimalisering og docking studier, som støttes av biofysiske studier. For første gang, forfatternes resultatene fra eksperimentet viser at melittin kan spille en betydelig rolle i DNA foreningen-dissosiasjon prosesser, noe som kan være en plausibel rute for deres anticancer aktivitet
Citation. Misra SK, Ye M, Kim S, Pan D (2015) Definert nanoskala kjemi Påvirker Levering av Peptido-toksiner for Cancer Therapy. PLoS ONE 10 (6): e0125908. doi: 10,1371 /journal.pone.0125908
Academic Redaktør: Mande Holford, The City University of New York-Graduate Center, UNITED STATES
mottatt: 22 oktober 2014; Godkjent: 23 mars 2015; Publisert: 01.06.2015
Copyright: © 2015 Misra et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av University of Illinois. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Host forsvars peptider (HDPS) er en klasse av evolusjonært konserverte stoffer i det medfødte immunrespons som er anerkjent som toppspillere i forsvarssystemet finnes blant alle klasser av livet. De er vanligvis amfipatiske, har en netto positiv ladning (vanligvis 2-9) og er kort i rekkefølge (10-100 aa); Videre HDPS har nylig blitt undersøkt for sin kreft eiendom [1-4]. Denne klassen av peptider har mange egenskaper som er ideelle for kreft behandling programmer, for eksempel i) høy vannstand løselighet, ii) et bredt spektrum av cytotoksisitet, og iii) evnen til å overvinne multiresistens, som har utviklet seg i kreftceller behandlet med konvensjonell kjemoterapi narkotika [5]. Flere biofysiske studier har vist at små proteiner eller peptider (20-40 aminosyre-rester) kan trenge gjennom cellemembraner av mikroorganismer. Melittin, en kationisk amfipatisk peptid bygget opp av 26 aminosyrer (aa) rester, er funnet å være en potent komponent av bee venom
Apis mellifera product: [6]. Det har vist seg å ha en direkte cytotoksisk effekt på et bredt spekter av kreftcellelinjer
in vitro
. Det har blitt rapportert at melittin hemmet cellevekst i to eggstokkreft celler via induksjon av død-reseptorer og nedregulering av JAK2 /STAT3 [7, 8]. Det utøver sin giftige aktivitet ved å forstyrre plasmamembraner følgende pore formasjon. Kationiske aa rester av melittin samhandle direkte med anioniske cellemembraner via elektrostatiske interaksjoner og hydrofobe regioner; denne interaksjonen er ansvarlig for membrangjennomtrengning og forstyrrelser [6]. En forholdsvis kort protein, med en ende-til-ende-avstand av ~ 3,5 nm, dimensjonen fungerer perfekt som et enkelt transmembranspennende alfa-heliks. Tallrike beregnings studier har vist at Melittin former transmembrane porene fra dets interaksjon med lecitin PC-membraner (2 ~ 3 nm i diameter). Dens potent aktivitet har tiltrukket seg forskere å utnytte melittin for neste generasjons anticancer terapeutisk middel. Men den terapeutiske potensialet er ikke fullt ut oppnådd i klinikken på grunn av deres off-target toksisitet, rask nedbrytning og clearance
in vivo
. Melittin har blitt innlemmet i lipid belagt perfluorkarboner partikler samler seg i flere tumormål, dramatisk redusere vekst [7].
Selv om noen av disse metodene klart løfte overhengende suksess i prekliniske studier deres translasjonell potensial har ikke vært svulst fullt ut realisert. Ingen eller svært lite informasjon kan finnes i litteraturen om deres translasjonsforskning bruk i studier på mennesker. For å forbedre selektiviteten og redusere toksisitet, vil levering kjøretøy implementering i mennesker krever stor forsiktighet. Det er derfor viktig å understreke den grunnleggende kjemiske strategi og rasjonelt nærmer seg utformingen av kjøretøyet egnet for translasjonsbevegelse bruk. En bedre forståelse av vekselvirkningen mellom venom toksiner på nanoskala er kritisk, noe som kan diktere den generelle stabilitet, integritet og systemisk cellulær noxiousness. En nøye strukturert studie for å forstå interaksjoner av melittin med de funksjonelle komponentene på skallet og shell-overflaten vil drive utformingen av neste generasjons levering kjøretøy. Mot dette formål, har vi innført en in-silico-to-i-vitro tilnærming og utviklet en veldefinert nanoparticulate system for kontrollert levering av melittin. Målet med dette arbeidet var å gi en rasjonell nanopartikkel-baserte design for gift levering gjennom beregningsstudier og støtte våre teoretiske funn med fysisk-kjemiske og biologiske studier. Således, som følge av synteser og fysikalsk-kjemisk karakterisering, en serie påfølgende eksperimenter ble utført for å studere hvordan nanoskala kjemi påvirker levering av gift giftstoffer for kreft regresjon og bidra til å unngå systemisk disintegrity og cellulær noxiousness (figur 1).
(a) Skjematisk av administrative protokollen for Lipobee og Polybee; (B) De første dokking bilder av PS
67-
b
-PAA
27 og Melittin systemer som viser hvordan strukturene i melittin er bundet til enkeltamfifile polymerer og (c) som viser docking strukturen melittin og lecithin PC. PS
67-
b
-PAA
27 og lecithin er avbildet med hvite linjer med eksplisitte oksygenatomer avbildet i rødt. Den melittin peptid er vist i en grønn kjedeleddet stil med oksygenatomer avbildet som rød og nitrogen avbildet som blå.
In silico
studier viste høyere stabilitet responsen melittin mot amfifile blokkpolymerer sammenlignet med lipidmolekyler. Eksperimentell studie bekreftet bedre stabiliteten av polymer systemet over lipidic montering. For å introdusere micellær stabilitet, ble et konsept for stiv kjerne innført [9]. Studier som undersøker endring i hydrert størrelse og treghet mot serumproteiner viste høyere stabilitet av stive kjernepartikler. Eksperimenter på melittin utlutning i nærvær av serumkonsentrasjonen avslørte den høyere stabilitet av en melittin-polymersystem (Polybee) sammenlignet med en melittin-lipid (Lipobee) system. En in silico studie på melittin-DNA interaksjon ble utført og verifisert av eksperimentelle data. Det ble funnet at fri melittin kunne bringe betydelig endring i inter-helix hydrogenbinding til potensielt påvirke cellevekstmekanismer. Melittin i sin beskyttet form som Polybee og Lipobee var inaktive. Vesentlige endringer i den hydratiserte størrelsen av Polybee og Lipobee ved inkubasjon med natriumdodecylsulfat ble observert, men ikke en lavere pH-verdi. Dette pekte på anioniske membranen samspillet som ansvarlig faktor inne i cytoplasma som en plausibel melittin utløsermekanisme. Brystkreft celler av en annen østrogen reseptor status ble brukt som modell
in vitro
kreft for vekst hemninger studier. Uavhengig av cellelinje, Polybees ble funnet å være bedre anti-kreft formuleringer i forhold til Lipobee og gratis melittin kontroll.
og effektiv levering system Resultater Diskusjon
Å utforme en tryggere samt, vi fulgt en stiv kjerne nanosystem som potensielt kan beholde sin integritet i blodsirkulasjonen etter systemisk administrasjon [10a-c]. På nanoskala nivå, stiv kjerne micellar (RCM) systemer kan enten stabiliseres ved amfifile PS
67-
b
-PAA
27 (polystyren-b-polyakrylsyre) (PRCM) eller ved fosfolipider (lecitin PC) (LRCM) innkapsling (fig 1A). Vi forventer at dette systemet vil gi modell arkitekturer, siden flertallet av nanomedisin plattformer er dominert av lipid og polymere systemer. Videre kan denne strategien også bli utvidet til en rekke peptid-toksiner av forskjellige naturlige kilder, kjemi og størrelser.
For å undersøke de viktigste interaksjoner i melittin- PS
67-
b
-PAA
27 polymer og melittin-lecithin PC lipid systemer, molekylære docking simuleringer ble utført og analysert (figur 1B og 1C). Alle molekyler ble minimert (Sybyl-X 2.0) [11] før dokking med MOE 2013,08. For å undersøke de viktigste interaksjoner i melittin- PS
67-
b
-PAA
27 polymer og melittin-lecithin PC lipid-systemet, MOE-Dock [12] ble ansatt for å forankre minimert melittin både PS
67-
b
-PAA
27 polymer og lecithin PC lipid systemer. De fem beste docking poserer med høyest S score (laveste docking energi) ble beholdt og oppført i tabellform. Superimpositions av de fem beste docking stiller i begge systemene viste i figur 2. Fra figur 2, kan det bli funnet at i melittin- PS
67-
b
-PAA
27 polymer docking struktur de fem docking positurer er i stor mangfold, noe som resulterer i den store forskjellen i dokking poengsum mellom positur 1 og utgjøre fem (14,5 kcal /mol). Men i melittin-lecitin PC lipid forankringsstruktur, kan fem tilkoblings poses innkopierer mye bedre, noe som resulterte i en liten forankrings poengsum forskjell mellom pose1 og pose 5 (1 kcal /mol). Konformasjon forskjeller i docking utgjør av melittin til PS
67-
b
-PAA
27 polymer og lecithin PC lipid ble forårsaket av ulike elektriske felt og steriske felt for disse to systemene.
Super-ileggelse av de fem beste tilkoblings utgjør av melittin med lecithin PC og PS
67-
b
-PAA
27 polymer: (a) dokking~~POS=TRUNC utgjør av melittin til PS
67-
b
-PAA
27 polymer; (B) docking utgjør av melittin til lecithin PC. Den beste scoret positur er i de grønne knyttet kjeder med følgende mindre vedlegg oppført i rekkefølge etter sin poengsum som indikert av sin farge: Magenta, andre; gul, tredje; hvit, fjerde, og cyan, femte.
Fig 1A viser tilkoblings strukturer av beste positurer melittin til PS
67-
b
-PAA
27 polymer (fig 1B) og lecithin PC lipid-systemet (figur 1C). I figur 1B, kan det sees at melittin peptidet forblir tett og godt paralleller med den hydrofile ende og en del av hydrofob del av polymeren. De hydrofile akrylsyrerester i polymeren som dannes kritiske hydrogenbindingsvekselvirkninger med amino- og hydroksylgruppene i aa-rester. Hydrofob fenyldelen nær den hydrofile terminale ende av den dannede polymer hydrofobe interaksjoner med sidekjeder av aa rester av melittin. Gly1 til Ile17 ligge i den hydrofile ende, mens Ser18 til Gln26 ligge i den hydrofobe ende av polymeren. I detalj aminogruppene av ryggraden i Gly1, Gly3, ALA4, Val5, Leu6, Gly12, Ala15 og Ile17, oksygen både i sidekjeden og ryggrad Thr11 dannede hydrogenbinding interaksjoner med oksygen fra karboksylsyre av polymeren. Sidekjedene av Leu17, Trp19, Lys21, Arg24 og Gln26 danner hydrofobe interaksjoner med fenyl, og karbonatomer i ryggraden av polymeren. Å sammenligne de viktigste interaksjoner av dokking poserer med lecithin PC-peptid-modell, dokket vi melittin peptid til lipid lecithin PC (Fig 1 C). Selv om melittin ble funnet å være godt sammenvevd med lipid, dette peptid-lipid-forankringsstruktur var mye løsnet. Avstanden mellom de to molekyler var ikke nær nok; derfor ikke mange hydrogen obligasjons interaksjoner og hydrofobe interaksjoner eksistere som observerte for peptid-polymer-komplekset. De eneste interaksjoner identifisert var aminogrupper i Arg22 og Arg24 danner hydrogen obligasjons interaksjoner med oksygen i keto og fosfonogrupper i lecithin PC lipid. De sidekjeder av ALA4, Leu13 og Ile17 dannet hydrofobe interaksjoner med alkylgruppen i lipid.
For ytterligere å undersøke sekvens og størrelse avhengighet av peptider for Polybee og Lipobee bærere, vi valgte flere Melittin peptidic fragmenter for beregnings modelleringsstudier (S1 Fig). Vi valgte (1) skudd med høyre 17-rester peptid, (2) igjen 9-rester peptid, og (3) midterste 16-rester peptid å dokke til PS
67-
b
-PAA
27 polymer og lecitin PC lipid-system, henholdsvis. I forankrings strukturen av høyre 17-rester peptid med PS
67-
b
-PAA
27 polymer, aminogruppene av ryggraden i Thr1, sidekjeden til Lys 12, Arg13 og Arg15 , oksygen karbonylgruppen av Lys 12, Gln17 og sidekjede av hydroksylgrupper av Thr1, Thr2 og Ser10 dannede hydrogenbinding interaksjoner med oksygen fra karboksylsyre av polymeren. I lecitin PC lipid forankringsstruktur, aminogruppene i ryggraden av Lys14 og sidekjede av Arg13, og sidekjede av hydroksylgrupper av Thr1 dannede hydrogenbinding interaksjoner med oksygen i fosfonogrupper i lecitin PC lipid. I forankringsstrukturen av venstre 9-rester peptid med PS
67-
b
-PAA
27 polymer, aminogruppene av ryggraden i Gly1, Ile2, ALA4 og Leu9, oksygen av karbonylgruppen av Val8 dannede hydrogenbinding interaksjoner med oksygen fra karboksylsyre av polymeren. I lecitin PC lipid forankringsstruktur, aminogruppene av ryggraden i Gly1, Ile2 og oksygen av karbonylgruppen av Ile2 dannede hydrogenbinding interaksjoner med oksygen i fosfonogrupper i lecitin PC lipid. I forankringsstrukturen av middel 16-rester peptid med PS
67-
b
-PAA
27 polymer, aminogruppene av ryggraden i Thr5, Gly7, Lys16, sidekjeden av Trp14, oksygen av karbonylgruppen av Gly7 og sidekjede av hydroksylgruppen av Ser13 dannede hydrogenbinding interaksjoner med oksygen fra karboksylsyre av polymeren. I lecitin PC lipid forankringsstruktur, aminogruppene av ryggraden i Leu1, LYS2, Val3, Thr5 og sidekjeden av hydroksylgrupper av Thr5 dannede hydrogenbinding interaksjoner med oksygen i fosfonogrupper i lecitin PC lipid.
analysen av tilkoblings utgjør kan tydelig forklare hvorfor peptid-polymer struktur er mer stabil enn den peptid-lipid-struktur (tabell 1). Vi la merke til at på strid med docking positurer og interaksjoner analyse, er lavere enn PS
67-
b
-PAA
27 polymer system dokking energi i lecithin PC lipid-systemet. Dette kan være forårsaket av forskjeller i gjennomsnittlig entropi tap /gevinst på grunn av conformational fleksibilitet og desolvation energien i hvert atom snarere enn for maksimal energi på H-bindingen mellom PS
67-
b
-PAA
27 polymer og lecithin PC lipid hvis størrelser er mye forskjellig. I PS
67-
b
-PAA
27 polymer system, vil det hydrofile akrylsyre og hydrofob styren enhet forholdet påvirke hydrogenbindingen og hydrofobe interaksjoner mellom Melittin og polymersystemer, mens enheten lengde endrer ikke disse interaksjonene sterkt. S2 Tabellen viser resultatet av tilkoblings resultatene av tre Melittin fragmenter til polybee og lipobee. Som tydelig, jo lenger peptidsekvensene, jo bedre tilkoblings score ble oppnådd. Dokking score var bedre for peptid med PS
67-
b
-PAA
27 polymer enn med leticin PC lipid fordi mer hydrogen obligasjons interaksjoner er involvert i en PS
67-
b
-PAA
27 polymer system.
en post-preparativ one-pot innsetting metoden ble brukt for stabil entrapment av melittin og en generasjon av lipidert stiv kjerne micellar melittin (Lipobees) fra lipidert stive kjerne miceller (LRCMs). På lignende måte polymeriseres stiv kjerne micellar melittin (Polybees) ble fremstilt fra polymerisert stive kjerne miceller (PRCMs). En typisk utarbeidelse av LRCMs og PRCMs involvert en sammensetning av «stiv kjerne» av polyoxyethylene20 cetyleter (PECE) etterfulgt av stabilt belegg med lecithin PC eller PS
67-
b
-PAA
27 [ ,,,0],1. 3]. Stabiliteten av micellene ble oppnådd ved herding i kjernen ved 4 ° C (PECE smeltepunkt 32 ° C). RCMs ble deretter utsatt for post-preparativ inkubering av melittin i vandig suspensjon i 30 minutter ved omgivelsestemperatur med mild risting. Den hydrodynamiske diameter, morfologi, lagdelte ordninger; topografi, elektroforetisk potensial, og partikkel-stabilitet ble etablert ved anvendelse av forskjellige fysikalsk-kjemiske eksperimenter. For å finne ut lasting av melittin i LRCM og PRCM ble UV-absorbans spektroskopi utført. Det ble sett på som signatur absorbans for melittin på 290 nm falt ned i tilfelle av Lipobee og Polybee, mest sannsynlig på grunn av overflaten internalisering av melittin i LRCM og PRCM med post-interaksjon metodikk.
LRCM hadde en gjennomsnittlig hydrodynamisk partikkelstørrelse på 23 ± 2 nm, som vokste til 83 ± 3 nm i Lipobee først og fremst på grunn av overflate interaksjonen av melittin med RCM (figur 3). Tilsvarende PRCM viste en midlere hydrodynamisk diameter på 25 ± 5 som økte til 40 ± 8 nm i Polybee (figur 3). Stabilitet av disse PRCM partiklene på tvers av forskjellige tidspunkter ved romtemperatur og pH 7,4 ble målt ved anvendelse av DLS-målinger, som viste en nominell endring i størrelsen av PRCM og Polybee på mindre enn 10%. Tilsvarende hadde LRCM størrelse ikke endres i vesentlig grad mens Lipobee viste størrelse endringer av ~ 40%, med vekt på den betydelige uroen i Lipobees forhold til den høye stabiliteten Polybee. Stabilitet av bære biler har alltid vært stor bekymring i suksessen av nano-levering protokoller. Derfor lover Polybee sannsynlig bedre melittin levering respons i forhold til Lipobee partikler under
in vitro Hotell og
in vivo
bruker. Overflaten ladningstetthet for PRCMs var -12 ± 1 mV, som falt ned til -6 ± 1 mV i Polybee etter inkubasjon med bee giftstoffer
Syntese og karakterisering av stive kjerne miceller og Melittin lastet partikler. ( a) Syntese av PRCM og Polybee nanopartikler; (B) representative TEM bilder av Polybee; (C) representative AFM bilder av Polybee; (D) Syntese av LRCM og Lipobee nanopartikler; (E) representative TEM bilder av Lipobee; (C) representative AFM bilder av Lipobee; (F) UV-vis spektroskopi av melittin, LRCM, PRCM, Lipobee og Polybee; (G) hydrodynamisk diameterfordeling (tall i gjennomsnitt, nm). TEM prøver (20 mL) ble utarbeidet på formvar lakkert karbon nett og negativt farget med uranylacetat og vakuumtørket før du utfører mikroskopi. Prøver (20 ul) ble rulle støpt på ferskt spaltes glimmer ark og lufttørket for 24 timer før utføring tappemodus AFM
På den annen side, zeta-potensialet av LRCMs viste en nominell endring. zeta potensial når det konverteres til Lipobee. Dette betyr at effektiviteten av å gjøre Coulombic interaksjoner av peptidet med den ytre korona av blokkpolymerer som består av poly (akrylsyre) rester. Vannfri tilstand Morfologien til Lipobee og Polybee partikler ble oppnådd ved 25 ± 5 nm størrelse i forhold til 22 ± 6 nm for LRCM og PRCM som undersøkt ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM, figur 3F). De representative atomic force mikroskopi (AFM) bilder ble kjøpt fra slipp støpte prøver på glimmer ark for å studere morfologi mønster av disse RCM partikler. Gjennomsnittlig høydeverdier (H
AV) av et representativt utvalg var 25 ± 5 nm (Fig 3G). Fysikalsk-kjemiske karakterisering av Polybees og Lipobees foreslå en potensiell overkanten for Polybees enn Lipobees i formuleringen stabilitet og andre forutsetninger for å gjøre dem bedre midler til systemisk bruk (tabell 2).
For å bekrefte kreft celle regresjon affinitet av disse formuleringer, ble cytotoksisitetsanalyser utført. Som et modellsystem for
in vitro
kreft kultur, valgte vi østrogen positive (MCF-7) og østrogen negativ brystkreftceller (MD-MB231) for å evaluere den funksjonelle terapeutiske potensialet av Polybees og Lipobees. MCF-7 og MD-MB231 cellelinjer representerer tidlig stadium og invasive menneskelige brystkreft cellelinjer, henholdsvis. Uavhengig av cellelinjen, Polybee viste signifikant høyere effektivitet i forhold til Lipobee og melittin som fremgår av MTT-analyser (figur 4). Ved inkubasjon 48t punkt, i MD-MB231-celler, er IC50-verdien for Polybee har blitt funnet ved ca. 40 ± 4 nM sammenlignet med ca. 70 ± 7 nM i tilfelle Lipobee og ca. 110 ± 10 M gratis melittin; Videre, i MCF-7, ble IC50-verdien for Polybee funnet å være ca. 80 ± 8 nM sammenlignet med ca. 100 ± 10 nM i tilfellet med Lipobee og 105 ± 10 nM for fri melittin. I mellomtiden, LRCM og PRCM viste IC50 1000 nM uavhengig av cellelinjen (figur 4G). For cellene behandlet med gratis melittin (100 nM), cellevekst tetthet og morfologiske endringene var et tegn på celledød, mens LRCM og PRCM ikke endret i vesentlig grad (figur 4).
Representative lyse felt bilder av cellevekst tetthet og kreft cellemorfologi variant for MCF-7 (ac) og MD-MB231 (df) etter 48 timers inkubering ble behandlet med melittin, LRCM og Lipobee, (g) IC50-verdier for forskjellige formuleringer i tabellform; biostatistiske analyse på IC50 verdier for Polybee respekt til melittin representerer *** for p-verdi 0,001 og ** for p-verdi 0.005 etter en måte ANOVA med Bonferroni post test og (hi)% Celleviabilitet varianter av forskjellig formulering i MD-MB231 og (JK) MCF-7 celler for (hj) polymer og (ik) lipidic formuleringer.
CH50 verdier for alle de benyttede formuleringer ble funnet å være 6 ± 1 for PRCM, LRCM, Polybee, Lipobee og melittin og 8 ± 1, 3 ± 1 for Referanse 1 Referanse 2 og henholdsvis (figur 5A). Selv
in vitro
eksperimenter etablerte Polybee og Lipobee som potent anti-kreft formuleringer, deres antatte oppførsel for
in vivo
applikasjoner fortsatt forble uklart.
In vivo
suksess for slike formuleringer veldig mye avhenge av to viktige faktorer i) nøytralitet mot blod komplement og ii) bærekraftig aging av nyttelast gjennom systemisk sirkulasjon. Våre beregnings studier indikerer sterkere, tettere samspill av melittin med amfifile polymerkjedene i direkte sammenligning med lipid, noe som gjør Polybees; dermed melittin med sin stive kjerne og polymer skallet er en bedre kandidat for
in vivo
søknad. For å bekrefte denne observasjonen eksperimentelt, utforsket vi komplementaktivering og melittin opphold evne av disse formuleringene i blodet serum. Sammenfallende dette systemet, vil en gruppe proteiner som aktiverer å lede target cellelyse og lette fagocytose gjennom opsonisation ved kontakt med faste fremmedlegemer i sirkulasjons systemisk væske. Den CH50 analysen, som skjermer aktivering av klassiske utfyllende trasé funnet å være følsomme for reduksjon, fravær og /eller inaktivitet av enhver komponent av veien. Den komplementære CH50 Analysen er basert på lysering av sensibilized saueerytrocytter i nærvær av Ca
2 + og Mg
2 +. Når sensibilized saue-erytrocytter blir inkubert med testserum fra forskjellige behandlinger, er forskjellige nivåer av hemolyse oppnådd. CH50 komplementaktivering Analysen ble utført for alle formuleringene som brukes her og funnet å være meget inert i aktivering av komplementære proteiner, og viser ingen signifikant endring i CH50-verdier sammenlignet med normal komplementær nivå plasma (referanse 1, det vil si, 8 ± 1).
(a) supplerer aktivering og (b) melittin utlekkings av Lipobee og Polybees. Gratis melittin ble LRCM og PRCM brukt som kontroller; (C) optiske mikroskopi bilder av blodutstryk ubehandlet (i) og behandlet med melittin (01:10) (ii), LRCM (01:10) (iii), Lipobee (01:10) (iv), PRCM (1: 10) (v) og polybee (01:10) (vi), henholdsvis (med 20x forstørrelse). Melittin- og Lipobee-behandlede svin blod i alvorlig clumped, morfologisk forvrengt tilstand er vist i (ii) og (iv). Innfellinger i (ii) og (iv) viser røde blodlegemer morfologi å understreke andre lignende morfologiske mønstre hele prøven.
De CH50 verdier for alle brukte formuleringer ble funnet å være 6 ± 1 for PRCM , LRCM, Polybee, Lipobee og melittin og 8 ± 1 og 3 ± 1 for Referanse 1 og Reference to, henholdsvis. Det indikerer at formuleringen PRCM, LRCM, Polybee, Lipobee og melittin fremkalte ikke noen supplement til noe vesentlig. Den støtter muligheten for å bruke disse formuleringene
in vivo
uten risiko for å indusere immunrespons.
For å vurdere fordelene ved å bruke Polybee løpet Lipobee for systemisk levering videre, melittin utlekking karakteristisk for disse formuleringene var evaluert og estimert ved å utføre en MTT-assay på MD-MB231-celler. Utlutes melittin oppnådd etter inkubering Polybee og Lipobee med 10% føtalt bovint serum (FBS) i DMEM-buffer ble anvendt ved fortynninger på 1, 2, 4, 8 og 16 for MTT-analyser. En kjent melittin-konsentrasjon ble anvendt som en positiv kontroll som strekker seg 20 til 1,25 uM. MTT-analyser viste en høy mengde av melittin utlekking fra Lipobee forårsaker en høy prosentandel av celle dødsfall ved hver fortynning sammenlignet med celler behandlet med melittin utlekking fra Polybee som gir en meget signifikant bio-statistisk signifikans (p 0,001) ved fortynningsfaktoren 1. på den annen side, ved den samme fortynning, melittin utlutes fra Polybee, noe som resulterer i en signifikant nedgang i cellepopulasjonen døden med ingen vesentlig endring i cellenes levedyktighet (figur 5B). Disse funn indikerte at ved systemisk administrering av Lipobee, kan en stor mengde av melittin lekke ut i sirkulasjonsvæsken før til kreftceller, og derved forårsake et betydelig tap i anticancer-effektiviteten.
Polybee nanopartikler er også vist bemerkelsesverdig vigør da blandes med griseblod. En «blodutstryk utarbeidelse ble gjort for å identifisere eventuelle morfologiske variasjoner i lymfocytter og blod klumper overvåkes av en klinisk optisk mikroskopi teknikk (konvensjonell lysmikroskopi) under en høy effekt felt (figur 5C). Ingen overfladiske plodding eller morfologiske omskiftninger i blodceller ble observert i frisk gris blod behandlet med PRCM, LRCM og Polybee (blod: NP = 10: 1). Men gris blod behandles med gratis melittin og Lipobee utstilt betydelig klumper og morfologiske endringer (figur 5C, ii og iv). For å forstå plausibel mekanisme melittin frigjøring fra Lipobee og Polybee
in vitro
, videre studier ble gjennomført. Frigivelse av terapeutiske midler fra nanopartikler er blitt rapportert som pH-responsive, og /eller interaktive med anioniske lag av det endosomale rommet i cellulære systemer. Disse faktorene kan undersøke responsen brukes nanopartikler for å nå en sannsynlig utløsningsmekanisme. Vi brukte denne strategien for å begrense vårt utvalg av fortrinnsrett trasé for melittin utgivelsen fra Lipobee og Polybee nanoformulations. Lipobee og Polybee ble fremstilt som beskrevet tidligere, etterfulgt av inkubasjon ved pH 4,6 og i nærvær av natriumdodecylsulfat (SDS, 1 mM) i 2 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble en hydrodynamisk diameter anskaffet for forskjellige formuleringer ved bruk av dynamisk lysspredning. Størrelser på 0 h ble betraktet som kontrollen for eksperimentene (S2) Fig.
DLS resultater viser klart at variasjon i størrelsen av Lipobee og Polybee bare i nærvær av SDS (5 mM) uten noen vesentlig effekt på et lavere pH (S2 fig). Den støtter sannsynlig forekomst av anionisk interaksjon i et endosomal rommet ansvarlig for melittin utgivelsen fra Polybee og Lipobee. I tillegg er en høyere endring i størrelsen på Lipobee skjedde ved inkubasjon med SDS betegner en høyere lipid-surfaktant interaksjon.
Peptide-polynukleotidsekvenser interaksjoner har alltid tiltrukket seg interesse av medisinske kjemikere. Det er av spesiell interesse å tyde Melittin DNA interaksjoner og forstå sin rolle i dissosiasjon fra DNA sekundærstruktur. Gel-elektroforese ble utført for å muliggjøre observasjon av de endringer i elektroforetisk mobilitet mønstre av pBR322 inkubert med forskjellige formuleringer i nærvær (melittin, Polybee og Lipobee) og i fravær av melittin (LRCM og PRCM) samt forskjellige konsentrasjoner av fri melittin ( 50 til 0,0005 mm).
det ble funnet at bare gratis melittin var i stand til å distansere plasmid DNA. I sin tur, ble tapet av elektroforese båndet oppnås enten ved å retardere den DNA migrasjon eller ved å utvise den interkalerte EtBr (Etidiumbromid) på grunn av større spor binding av melittin i DNA-dupleks. Formuleringer med beskyttet melittin i begge tilfellene, Lipobee og Polybee, ikke påvirker DNA-båndene i vesentlig grad (S3A figur).
En ytterligere gel elektroforese Undersøkelsen viste at ~ 0,05 mikrometer gratis melittin var tilstrekkelig til å start dissosiasjon av et DNA-sekundærstruktur (figur S3b). Interaksjoner av melittin med DNA i fri form markere at en frigjøring fra Lipobee og Polybee kan målrette genomisk DNA, som kan strekke seg til nivået for å hindre transkripsjonen prosessen. Imidlertid kan ingen interaksjon skje dersom melittin er stabilt innarbeidet. Her ingen signifikant effekt fra LRCM og PRCM på DNA mobilitet viste at disse partiklene ikke har en aktiv rolle i DNA interaksjon og melittin er den eneste komponenten i Polybee og Lipobee til å delta i samspill med DNA dupleks.
proteiner er viktige bestanddeler av blod serum og motvirke belastningen kjøretøy og pharmacoactive agenter samtidig levere gjennom systemkretsløp. Eventuelle hindringer i normal oppførsel av slike blodserumproteiner kan føre til skadelige konsekvenser for faget. Som et modellsystem for studien, valgte vi fetal bovine serum for å etablere effekten av gratis melittin og dets nanoformulations, Lipobee og Polybees på normale spektroskopiske egenskaper. UV-absorbans Studien ble utført på 50 mikrometer melittin inkubert (gratis eller nanoformulation form) 10% FBS løsning. Ingen hypso- eller bathochromic skifte i UV-absorbans mønsteret ble notert fra FBS løsning, men absorbans ble økt etter inkubasjon med gratis melittin. En reduksjon i absorbans ble sett i tilfelle av Lipobee, som nådde et nivå tilsvarende behandlede FBS i forhold til Polybee (S3C Fig). Denne observasjonen kan forklares på grunn av den ekstra absorbans fra lagt formuleringer, som betyr ingen spesifikk interaksjon av melittin i fri eller nanoformulation skjema med serumproteiner.
Skjebnen utgitt melittin kan rasjonaliseres i forhold til sin interaksjon med genomisk
